Caratterizzazione di proteine transmembrana di vescicole extracellulari singole mediante citometria a nano-flusso

La caratterizzazione approfondita dei veicoli elettrici può essere impegnativa, richiedendo più strumenti per descrivere i singoli parametri. La misurazione di questi criteri chiave in una singola tecnica come la citometria a nano-flusso descrive più sottopopolazioni di EV contemporaneamente. Quindi ogni EV viene misurato individualmente identificando particelle più grandi di 14 nanometri di diametro senza etichetta prima di determinare la loro fluorescenza.

Ciò consente di ottenere un set di dati affidabile rimuovendo i falsi positivi. La citometria a nano-flusso può essere applicata alle EV da una varietà di fonti, comprese quelle arricchite da plasma, CSF e terreno di coltura. Questa tecnica viene utilizzata anche per l'analisi di virus, nanoparticelle lipidiche e nanomateriali.

È importante ottimizzare il protocollo di etichettatura. Ciò massimizza qualsiasi fluorescenza associata a una particella rispetto a qualsiasi fluorescenza residua rimasta nel buffer. Per iniziare, accendi lo strumento, carica Nano-Flow Profession e seleziona Start Up dal menu a discesa Sheath Flow, carica acqua nella baia di carico e seleziona Boosting dal menu a discesa Sheath Flow.

Diluire le sfere di controllo qualità da una a 100 in acqua distillata in un tubo da 0,6 microlitri e posizionarle nella baia di carico per introdurre il campione nel sistema. Quindi aumentare il campione per 45 secondi come dimostrato in precedenza per sostituire completamente il campione precedente, l'acqua o la soluzione detergente. Durante il boosting, impostare la potenza del laser sul modello preimpostato per le perline QC su 250 nanometri FL QC standard.

Successivamente, per ridurre la pressione del sistema, selezionare la pressione di campionamento dallo stesso menu a discesa e impostare la pressione di campionamento automatico su un kilo pascal per mantenere una pressione costante. Quindi avviare l'analisi di un minuto selezionando Time To Record dai controlli di acquisizione. I dati verranno tracciati sul dot plot che mostra una scala logaritmica per l'intensità di dispersione laterale e un'intensità di fluorescenza selezionata.

Prima di salvare il file, inserire il nome del file e la diluizione del campione. Quindi, selezionare scarico per rimuovere il tubo dalla baia di carico. Sostituire le perline di controllo qualità con 150 microlitri di soluzione detergente e pulire per più di 30 secondi selezionando Boosting.

Utilizzando un tubo contenente 150 microlitri di acqua, rimuovere qualsiasi soluzione detergente in eccesso dalla punta capillare immergendo la punta in acqua. Quindi diluire le perline standard di dimensioni da uno a 100 in acqua e caricare 100 microlitri nella baia di carico. Ora, imposta la potenza del laser sul modello preimpostato, S16 EXO da 68 a 155 nanometri.

Questa impostazione è valida sia per le dimensioni standard che per i campioni contenenti veicoli elettrici di dimensioni inferiori a 200 nanometri. Selezionare il campionamento e procedere alla registrazione del campione per un minuto. Eseguire la terza misurazione con un campione di acqua o PBS per creare un valore di misurazione in bianco, identificando i falsi positivi per la rimozione da parte del software.

Diluire i campioni EV non marcati in PBS a un intervallo di concentrazione di particelle adatto da una volta 10 all'ottavo a cinque volte 10 all'ottava particella per millilitro per l'analisi nFCM. E caricare da 10 a 100 microlitri del campione diluito nella baia di carico. Se la concentrazione di particelle è sconosciuta, iniziare con una diluizione da uno a 100 del campione EV.

La concentrazione del campione può essere rapidamente approssimata dalla dimensione dello spot laser sulla telecamera CCD durante il boost o dall'osservazione della traccia dell'evento burst durante il campionamento. Una volta potenziato il campione caricato per 45 secondi, registrare per un minuto e salvare il file come illustrato in precedenza. Dopo la registrazione, inizia ad analizzare questi dati, passando dalla scheda Acquisizione alla scheda Analisi e aprendo i file NFA salvati.

Per una misurazione accurata del campione, utilizzare le due misurazioni standard effettuate prima della misurazione del campionamento per impostare i valori per il confronto del campione e il bianco. Create la curva standard di dimensione per la conversione da dispersione laterale a diametro selezionando il file standard di dimensione e utilizzando lo strumento imposta soglia. La soglia, visibile nella traccia dell'evento burst, identifica l'intensità minima del segnale richiesta affinché un evento sia considerato significativo.

Con la soglia impostata, controllare i parametri del dot plot, SS-H o SS-A sull'asse X e FITC-A sull'asse Y. Aprite lo strumento Generazione curva standard e selezionate S16 EXO da 68 a 155 nanometri come modello di dimensionamento. Fare clic su Trova picchi per identificare le intensità di dispersione lato picco come particelle di diametro 68, 91, 113 o 155 nanometri.

Prima di chiudere la finestra, verificate se il lato sparso alla curva di diametro è stato generato con un valore R vicino a uno. Impostare lo standard di concentrazione. Selezionare il file salvato, fare clic su conteggio standard e inserire la concentrazione di particelle dello standard.

Impostare le informazioni standard. Selezionare il file di esempio EV e impostare la soglia. Selezionare il file vuoto e fare clic su imposta vuoto per identificare il numero di falsi positivi da rimuovere dal conteggio dei campioni.

Una volta aperto lo strumento di generazione PDF, controllare il dimensionamento, la concentrazione e le diluizioni del campione. Quindi mostrare la concentrazione del campione e la distribuzione dimensionale delle particelle. Dopo aver etichettato i campioni EV come descritto nel manoscritto, prendere un microlitro del campione etichettato e diluirne uno a 50 in PBS in un tubo da 0,6 millilitri.

Caricare il campione nella baia di carico e applicare una pressione di spinta per 45 secondi. Inoltre, assicurarsi che le impostazioni laser corrette e che siano caricate le lenti appropriate. Ora, passa alla pressione di campionamento e seleziona il tempo per registrare.

Dopo l'acquisizione di un minuto, assegnare un nome al file di dati e salvare. Scaricare il campione, sostituirlo con una soluzione detergente e aumentare la soluzione detergente per più di 30 secondi prima di caricare il campione etichettato successivo, come dimostrato in precedenza. Per la generazione di PDF, applicare gli stessi standard precedentemente dimostrati.

Solo la misura del bianco verrà impostata in modo diverso. Selezionare il file di esempio e impostare la soglia. Selezionare lo strumento di gating e utilizzare il clic sinistro del mouse per tracciare una linea che separa la popolazione positiva alla fluorescenza.

Impostare i nomi e i colori per la rappresentazione. Imposta il file vuoto e fai clic su imposta vuoto per identificare il numero di falsi positivi per la rimozione da ogni diversa popolazione. Apri lo strumento di generazione PDF e identifica la distribuzione dimensionale, la concentrazione e la percentuale della sottopopolazione positiva alla fluorescenza.

Nel diagramma a punti, modificate l'asse Y per mostrare le misurazioni della fluorescenza dal canale verde o rosso. Impostare lo spazio vuoto e generare il PDF come illustrato in precedenza. Nel diagramma a punti, impostate l'asse X su FITC e l'asse Y su APC.

Utilizzare lo strumento quadrante per identificare le popolazioni fluorescenti positive doppie. Impostare nomi e colori in modo che siano rappresentativi, quindi aprire il file PDF e selezionare le sottopopolazioni fluorescenti. Le EV derivate da C2C12 hanno mostrato circa il 50% di CD9, il 30% di presentazione di CD63 e il 70% della popolazione ha presentato almeno uno dei tre marcatori EV.

I profili dimensionali per le sottopopolazioni di EV marcate con tetraspanina singola hanno mostrato una dimensione mediana maggiore di circa 75-85 nanometri e meno di 65 nanometri EV rispetto alla popolazione totale di particelle. Gli EV derivati dall'SW620 hanno mostrato circa il 40% di CD9, il 7% di presentazione CD63 e il 42% di particelle con almeno uno dei tre marcatori. Gli EV derivati da SW620, marcati con tetraspanina, hanno mostrato una distribuzione più normale e un diametro mediano più grande tra 90 e 110 nanometri con distribuzioni simili tra le singole sottopopolazioni positive alla tetraspanina.

L'etichettatura a membrana ha ripetutamente mostrato l'80% di positività dei veicoli elettrici derivati da C2C12 e SW620. L'intensità di dispersione laterale è correlata all'intensità FITC sui grafici a punti di C2C12 e SW620. Le percentuali positive doppie sono molto simili alle percentuali positive della tetraspanina.

E l'etichettatura CD63 sembra mostrare la correlazione più debole con l'etichettatura a membrana. Le misurazioni percentuali di positività erano simili tra l'etichettatura degli anticorpi con e senza etichettatura aggiuntiva della membrana. L'intensità media della fluorescenza per le popolazioni fluorescenti di EV derivate da C2C12 ha suggerito una presentazione inferiore di CD63 e CD81 rispetto alle EV CD9, mentre SW620 ha mostrato che l'uso di tutti e tre gli anticorpi fornisce un segnale di fluorescenza maggiore rispetto a qualsiasi singola etichetta anticorpale In questo protocollo, i marcatori EV comuni sono stati marcati con fluorescenza, ma molti dei bersagli anticorpali possono essere scelti per mostrare l'origine EV, la funzione EV o lo stato di malattia.