Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Il collegamento delle porte per accoppiarsi alle siringhe con tubi è fondamentale perché, quando è fatto bene, non ci sono perdite, non ci sono bolle nella cella di flusso e gli esperimenti possono essere eseguiti ripetutamente utilizzando la stessa cella di flusso per un periodo di un anno con un uso attento. Qui, verranno presentati due semplici metodi per collegare i connettori alle celle di flusso. Questi sono facili, sono riproducibili e consentono allo sperimentatore di adattare facilmente la cella di flusso alle proprie esigenze senza troppi problemi.

L'uso di queste cellule a flusso è stato fatto pensando a esperimenti su singole molecole. In particolare, ciò che chiamiamo biochimica visiva, ma possono essere utilizzati in qualsiasi studio in cui è richiesta la microfluidica e in situazioni in cui deve essere utilizzato il flusso del fluido della lamina. Quindi, per evitare errori, invece di utilizzare preziose celle di flusso per stabilire le tecniche, suggerirei di esercitarsi prima su un vetrino o su un vetrino.

Ciò consentirà di avere un'idea del vetro o dei materiali PDMS per sapere come gestirli e quanta forza applicare quando si inseriscono tubi o si incollano i connettori. Ciò richiederà il sacrificio di alcuni connettori, ma sono molto più economici delle celle di flusso. Iniziare posizionando la cella di flusso su una superficie piana pulita.

Tenere il tubo in PTFE a tre millimetri dall'estremità libera con una pinza e spingere il tubo nella porta. Ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti. Collegare le porte di ingresso alla pompa della siringa e l'uscita a una bottiglia di scarto.

Riempire ogni siringa di vetro con un millilitro di metanolo spettrofotometrico e collegarli a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 microlitri di metanolo. Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso e pompare 800 microlitri di metanolo attraverso la cella di flusso a una portata di 100 microlitri all'ora per bagnare le superfici ed eliminare le bolle.

Il giorno dopo, ripeti questo processo usando 800 microlitri di acqua ultrapura. La cella di flusso è ora pronta per l'uso. Se è necessario utilizzare connettori per tubi pressabili, rimuovere con cautela il nastro adesivo da un lato del connettore e posizionarlo sopra il foro nel vetrino del microscopio.

Premere verso il basso per alcuni secondi. Ripetere il processo per i connettori rimanenti. Quindi posizionare la cella di flusso su una superficie piana e pulita.

Tenere il tubo in PTFE a tre millimetri dall'estremità libera e spingere il tubo nel foro della porta. Ripetere questa procedura per ciascuna delle porte rimanenti. Collegare i tubi dagli ingressi alle valvole di commutazione.

Posizionare l'accessorio su una superficie piana pulita o su un collettore personalizzato per mantenere la cella di flusso e i connettori in posizione durante l'incollaggio. Posizionare la cella di flusso sulla sezione incassata del collettore, quindi posizionare una piccola quantità di colla di vetro sul fondo del gruppo e inserire il sigillo. Posizionare la porta nano su uno dei fori di ingresso sul vetrino del microscopio.

Spingere delicatamente verso il basso e tenere in posizione senza movimenti laterali. Ripetere il processo per le porte rimanenti. Lasciare asciugare o bloccare in posizione nel collettore.

Rimuovere delicatamente la cella di flusso dal collettore e assicurarsi che gli assiemi siano ben allineati con le porte di ingresso nella cella di flusso. Posizionare una cella di flusso sul palco del microscopio e collegare il tubo utilizzando i connettori a tenuta di dito. Riempire ogni siringa di vetro con un millilitro di metanolo spettrofotometrico.

Collegare ogni siringa a una valvola di commutazione. Assicurarsi che la valvola abbia l'uscita diretta allo spreco e spurgare ogni linea con 50 microlitri di metanolo. Commutare la posizione di uscita sulla cella di flusso e pompare 800 microlitri di metanolo attraverso la cella di flusso a una portata di 100 microlitri all'ora.

Il giorno dopo, ripeti questo processo usando 800 microlitri di acqua ultrapura. La misurazione della potenza erogata è mostrata qui. La potenza erogata dal laser viene misurata prima di installare la testa laser nel layout ottico.

Una volta terminato l'allineamento della trappola, la potenza del fascio viene misurata dopo l'obiettivo 100 x per ogni trappola. Le immagini dimostrano l'intrappolamento ottico stabile di perle fluorescenti di un micrometro. Qui F è una trappola fissa e M è una trappola mobile.

Con la trappola mobile in modalità di scansione che si muove attraverso un cerchio piccolo o grande a 30 hertz. Il flusso del fluido all'interno della cella di flusso è laminare. Lo schema mostra la cella di flusso dall'alto per dimostrare che la diffusione intercanale è la principale fonte di miscelazione tra i flussi di fluido adiacenti.

Le frecce blu indicano la direzione del flusso e i singoli flussi sono colorati, bianchi, grigio chiaro e bianchi. Le regioni di diffusione trasversale in allargamento tra i canali sono indicate in rosso. L'inserto mostra un'immagine a fluorescenza dei flussi fluidi adiacenti a 10 volte l'ingrandimento con complessi di perline di DNA marcati con fluorescenza nel flusso inferiore e tamponi solo nel flusso superiore.

Le macchie bianche nel flusso superiore sono rumore ripreso dalla telecamera CCD. Il profilo di flusso e le celle a flusso laminare sono parabolici. La cella di flusso è vista lateralmente e la direzione del flusso è indicata sopra ogni cella.

La velocità lineare del tallone è influenzata dalla velocità della pompa e dalla concentrazione di saccarosio. La forza opposta su un tallone è influenzata dalla viscosità della soluzione. Il diametro del tallone influenza la forza sulle perle sotto flusso.

Quando si tenta questa procedura, assicurarsi che l'area in cui si sta lavorando sia pulita e di aver pulito le superfici di vetro con metanolo o acetone di grado spettrometrico. In questa fase, dovresti avere una cella di flusso che viene fatta alla tua pompa a siringa e ora sei pronto per introdurre le tue soluzioni e iniziare gli esperimenti di pinzetta ottica. L'uso di celle a flusso, che possono essere utilizzate per lunghi periodi di tempo, ha permesso ai ricercatori di studiare una varietà di reazioni a singola molecola in cui vengono misurate le forze, le reazioni vengono visualizzate mediante fluorescenza o una combinazione di entrambe.