Microtrapianto di membrane sinaptiche per riattivare i recettori sinaptici umani per studi funzionali

I disturbi neurodegenerativi e di salute mentale derivano da cambiamenti nella comunicazione sinaptica. Gli eventi multifattoriali cambiano i recettori sinaptici in modi che non comprendiamo completamente. Il microtrapianto di membrane sinaptiche fornisce informazioni su queste alterazioni.

Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di registrare l'attività dei recettori cerebrali nativi che lavorano nel cervello umano e, quindi, rappresentano le malattie che stiamo studiando. I recettori sinaptici sono obiettivi importanti per la medicina che regola l'attività elettrica del cervello, ma comprendendo come questi recettori cambiano, è possibile sviluppare terapie migliori che ripristinino la loro funzionalità. Questo metodo è stato applicato con successo a diverse specie, da insetti, pesci, mammiferi, ma può anche essere applicato ai recettori di membrana al di fuori del cervello, ad esempio muscoli e tumori.

Le possibilità sono ampie. Tagliare gli aghi per iniezione è complicato. Troppo piccolo può impedire l'iniezione di proteine e due grandi possono uccidere la cellula.

Aiuta a utilizzare una misurazione coerente, come il bordo di una lama di rasoio. Inizia sonicando i campioni selezionati preparati dalla regione del cervello umano di interesse tre volte in un bagno con ghiaccio bagnato galleggiante. Usa cinque secondi cicli ogni volta e attendi un minuto sul ghiaccio bagnato tra un ciclo e l'altro.

Posizionare un microlitro del campione sul materiale termoplastico e, se necessario, effettuare una rientranza sulla superficie, prima del posizionamento del campione per impedire il movimento del campione. Utilizzare le manopole del manipolatore che tiene il nanoiniettore per posizionare l'ago e spostarlo verso il campione da riempire. Una volta che la punta dell'ago è nel campione, tenere premuto il pulsante di riempimento fino a quando non viene prelevato un campione sufficiente.

Per 10 ovociti è necessario un campione di circa 0,5 microliti. Utilizzare le manopole per spostare l'ago del nanoiniettore nella posizione più alta. Penetrare l'ovocita appena sotto la superficie con un ago, non più profondo, e utilizzare il pedale per iniettare il campione.

Attendere circa due o tre secondi. Dopo un'iniezione di successo, la cellula si espanderà. Utilizzare le manopole sul manipolatore per uscire dalla cella.

Spostare la capsula di Petri in modo che l'ovocita successivo sia allineato con l'ago. Ripetere il processo fino a quando non è stato iniettato il numero desiderato di ovociti nel piatto, quindi ritrarre il nanoiniettore nella sua posizione originale e rimuovere l'ago. Assicurarsi che un pozzetto di ovociti sia lasciato non iniettato per essere utilizzato come controllo.

Accendere tutte le apparecchiature utilizzate per la registrazione delle correnti ioniche, quindi accendere il computer desktop e accedere a WinEDR versione 3.9.1. Assicurarsi che il programma sia in esecuzione e che il record sia impostato su Disco. Successivamente, imposta la durata della registrazione e cancella l'opzione Simulatore.

Per la sezione dell'elettrodo di tensione, disattivare la compensazione della capacità negativa. Impostare l'interruttore del selettore di guadagno su 10 per la sezione dell'elettrodo del bagno, quindi impostare l'interruttore a levetta a tre posizioni, che seleziona il moltiplicatore di guadagno, su x1. Le luci a LED indicheranno la selezione del moltiplicatore di guadagno.

Spegnere il selettore della modalità morsetto, inserire il controllo del guadagno DC e impostare il controllo del guadagno su circa la metà dell'intera larghezza di banda aperta. Impostare i comandi su 40 millivolt, i controlli di attesa su negativo e il moltiplicatore di scala su x2. Per l'elettrodo corrente, utilizzare l'offset VE per stabilire un riferimento zero, prima di impalare l'ovocita.

Quindi, apri il software WinEDR versione 3.9.1, vai al menu in alto e seleziona File, seguito da Nuovo. Crea la tua cartella e salva il file. Nel menu principale, seleziona Registra, quindi Registra su disco.

Posizionare i ponti di agar nei rispettivi fori circolari dietro la camera di registrazione, collegando i pozzetti per gli elettrodi utilizzati come riferimento a terra nella camera di registrazione. Aggiungere 1x Soluzione di lavoro di Ringer alla valvola di perfusione corrispondente. Aprire la valvola fino a riempire la camera di registrazione con Ringer's Solution.

Utilizzando i manipolatori destro e sinistro che tengono gli elettrodi, guidare gli aghi dell'elettrodo nella camera di registrazione che è riempita con la soluzione di Ringer. Controllare la resistenza di ciascun elettrodo azzerando le manopole di offset VM e VE e quindi premendo i pulsanti di test dell'elettrodo. La resistenza dovrebbe essere compresa tra 0,5 e tre megaohm.

Se la resistenza è fuori dall'intervallo, sostituirla con nuovi microelettrodi. Quindi, riempire la camera di registrazione con la nuova soluzione di Ringer. Utilizzare una pipetta di vetro per posizionare un ovocita non iniettato o microtrapiantato al centro della camera di registrazione.

Assicurarsi che l'ovocita sia chiaramente visibile al microscopio con il lato animale verso l'alto. Guidare l'elettrodo nella soluzione di Ringer fino a quando non toccano la membrana dell'ovocita. Perforare delicatamente la membrana dell'ovocita sul lato animale con entrambi gli elettrodi e registrare il potenziale di membrana a riposo.

Attivare il flusso Soluzione della suoneria. Utilizzando l'amplificatore a morsetto per ovociti, cambiare la modalità in morsetto di tensione lento e impostare la tensione di tenuta su 80 millivolt. La corrente sul monitor dovrebbe essere negativa, di solito tra 0 e 0,4 microampere.

Vai a File, Nuovo, quindi salva la registrazione sul software per creare un nuovo file e salvare la registrazione. Premere Registra seguito da Registra su disco per avviare la registrazione. Aggiungere informazioni pertinenti al file utilizzando la finestra di dialogo Contrassegna grafico.

Applicare agonisti per la stimolazione chimica aprendo le valvole e perfondendole nella camera di registrazione per 15 secondi. Una volta completata la registrazione, ruotare il morsetto di tensione in posizione off e spegnere la valvola Ringer's Solution. Rimuovere l'ovocita e scartare seguendo la politica istituzionale per i campioni di cervello umano, quindi interrompere la registrazione e salvare il file.

Salvare una copia delle registrazioni su un'unità USB. Da lì, apri il file desiderato da analizzare. Per misurare la risposta massima AMPA e la risposta di picco GABA A, in primo luogo, stabilire un livello 0 o una linea di base trovando la linea rossa, quindi trascinarla sulla corrente generata dall'applicazione Ringer o dalla linea di base.

Una volta stabilito il livello 0, determinare le misurazioni della risposta trascinando il cursore di lettura verticale verde sulla parte desiderata del tracciante grafico. Sono state registrate correnti ioniche dagli ovociti iniettati con le membrane dei recettori sinaptici umani. I recettori AMPA sono stati attivati con 100 kainato micromolare e recettori GABA A con un GABA millimolare.

La co-iniezione delle membrane filtrate dall'organo elettrico del siluro, ricco di recettori dell'acetilcolina, e il cDNA che codifica per il recettore GABA della fila uno nel polo animale ha prodotto principalmente due gruppi di ovociti, in base alle loro risposte. Un gruppo di ovociti ha avuto grandi risposte all'acetilcolina, ma nessuna risposta a un GABA micromolare. Gli ovociti in un altro gruppo hanno avuto risposte nulle o basse all'acetilcolina, ma grandi risposte al GABA.

L'immagine grafica mostra l'errore standard medio più meno della media della corrente di picco nel gruppo uno e nel gruppo due. Un ovocita nel gruppo due aveva grandi risposte GABA e acetilcolina, suggerendo la rottura del nucleo. Di conseguenza, la distribuzione delle risposte è stata distorta a valori bassi, come notato dalla differenza tra la media e la mediana della distribuzione della corrente di membrana.

Una delle cause degli ovociti a bassa risposta è che le membrane vengono iniettate e intrappolate nel nucleo dell'ovocita. GabA e risposte kainate di ovociti iniettati nei poli animali o vegetali con membrane non filtrate ottenute da un cervello non AD, e un cervello AD sono mostrati qui. Gli ovociti iniettati vicino al polo animale senza colpire il nucleo hanno dato risposte più grandi rispetto agli ovociti iniettati nel polo vegetale, consentendo così lo studio di campioni di tessuto con un numero molto basso di recettori.

Durante il tentativo di questa procedura, monitorare sempre il livello di suoneria. È sempre durante le registrazioni importanti che finirai, e poi userà il tuo risultato, la morte dell'ovocita e la perdita di dati molto preziosi. Seguendo questa procedura, possiamo eseguire carichi occidentali per convalidare la presenza dei recettori sinaptici o proteine di interesse.

Permette di misurare l'eccitazione globale ai rapporti sinaptici di inibizione in diverse regioni del cervello e diversi disturbi cerebrali, consentendo di effettuare test diretti sulla previsione teorica sulle cause della malattia.