In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Questa misura costruisce un modello minimo della cellula privo di complesse regolazioni biochimiche. La tecnica utilizzata può generare un'elevata resa di liposomi e avere elevate efficienze di incapsulamento per le proteine del citoscheletro. Questa misura può essere applicata all'incapsulamento di varietà di proteine e oggetti di grandi dimensioni come microparticelle e micro nuotatori auto-preparanti.

Un individuo sta lottando aumentando la resa liposomica per i primi tentativi. Si raccomanda di discutere regolarmente la sezione del manoscritto per maggiori dettagli per aumentare la resa. Per iniziare, preparare il tampone acquoso interno non polimerizzante in un volume totale di cinque millilitri mescolando 0,1 millimolari CACL due, 10 millimolari HEPES, un millimolare DTT, 0,5 millimolare DAPCO, 320 millimolare di saccarosio e 0,2 millimolare ATP.

Preparare il mix proteico aggiungendo proteine al tampone interno di non polimerizzazione a quattro gradi Celsius. Per formare uno strato di actina, aggiungere 100 gellcalina nanomolare, quattro tossialina micromolare e 2,2 micromolari VCA HEZ al mix proteico. Come esperimento di controllo, sostituire la miscela proteica con 100 microgrammi per millilitro di colorante fluorescente.

Preparare il tampone di polimerizzazione interno acquoso in un volume totale di cinque millilitri mescolando 100 millimolari di cloruro di potassio. Quattro cloruro di magnesio millimolare, HEPES 10 millimolare, un DTT millimolare, DABCO 0,5 millimolare, ATP 10 millimolare e saccarosio 80 millimolare. Preparare il tampone finale mescolando tampone interno non polimerizzante e tampone interno di polimerizzazione con un rapporto volumetrico di uno a uno, per ottenere la soluzione acquosa interna in un volume totale di 30 microlitri che sarà incapsulato all'interno del liposoma.

Preparare il tampone esterno acquoso in un volume totale di 150 microlitri mescolando 10 millimolari HEPES, 50 millimolari cloruro di potassio, due millimolari cloruro di magnesio, 0,2 millimolare di cloruro di calcio, due millimolari ATP, un millimolare DTT, 0,5 millimolare DAPCO, 212 millimolare di glucosio e 0,1 milligrammi per millilitro di involucro beta. Per preparare la miscela di olio lipidico, iniziare aggiungendo 100 microlitri di 25 milligrammi per millilitri EGGPC in una fiala di vetro. Evaporare il cloroformio con gas argon lasciando un film lipidico solido secco sul fondo del flaconcino.

Per formare uno strato di actina, aggiungere lipidi di nichel con un rapporto di 10 a uno di EGGPC con lipidi di nichel e mescolare, prima dell'evaporazione del cloroformio. Aggiungere due millilitri di olio minerale. Far evaporare il cloroformio e sonicare la miscela di olio lipidico a temperatura ambiente in un bagno per un'ora, per risospendere i lipidi.

Preparare un tampone finale in emulsione oleosa per la preparazione di goccioline lipidiche monostrato contenenti la proteina di interesse. Inizia prendendo 100 microlitri della miscela di olio lipidico in un tubo di plastica e aggiungi 10 microlitri di tampone finale alla miscela di olio lipidico. Assicurarsi che il buffer finale sia in una goccia.

Utilizzando una siringa di vetro aspirare prima una piccola quantità di miscela di olio lipidico e poi la goccia tampone finale posizionando la punta della siringa alla periferia della goccia per romperla in minuscole goccioline. Aspirare delicatamente su e giù più volte fino a formare un'emulsione torbida. Mettere 30 microlitri di tampone esterno in un tubo di plastica separato.

Posizionare 30 microlitri della miscela di olio lipidico sopra il tampone esterno e lasciarlo riposare per circa 10 minuti per sviluppare un monostrato lipidico all'interfaccia. Per preparare i liposomi, aggiungere con attenzione 50 microlitri dell'emulsione finale di olio tampone, alla fase superiore dell'olio del tubo. Centrifugare il tubo di plastica a 100 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.

Variare il tempo e la velocità di centrifugazione, per ottimizzare la formazione dei liposomi. Rimuovere con cautela la fase dell'olio aspirando il volume supplementare della pipetta, se necessario. Assicurarsi di non mettere la punta della pipetta sul lato del tubo per evitare di creare un menisco di olio sopra la fase liposomica.

Con una nuova pipetta, tagliare la punta della pipetta. Inserire lentamente la pipetta nella fase inferiore rimanente e aspirare il volume acquoso per raccogliere i liposomi. Versare 100 microlitri di tampone esterno nel pozzetto di una camera di incubazione.

Depositare delicatamente i liposomi raccolti nel tampone esterno e quindi posizionare un altro vetrino di copertura sulla parte superiore della camera. Osservare i liposomi con un microscopio confocale utilizzando un obiettivo ad immersione in olio 63x. Utilizzare linee laser a 488, 647 e 561 nanometri.

Per osservare rispettivamente lipidi marcati fluorescenti, colorante fluorescente incapsulato e actina incapsulata con fluorescenza. Cattura i fotogrammi di interesse e salva le immagini in formato TIF. Elabora e analizza le immagini nell'immagine J.Start aprendo il file TIF, utilizzando il software immagine J.

Vai all'immagine, quindi fai clic su Regola. Seguito dal contrasto della luminosità, regola la luminosità e il contrasto dell'immagine alla scala desiderata regolando le impostazioni minime e massime e i cursori di luminosità e contrasto. Fare clic sullo strumento di selezione del rettangolo nella barra degli strumenti e selezionare la regione di interesse.

Vai all'immagine, quindi fai clic su Ritaglia per ritagliare il ROI. Vai su analizza, quindi fai clic su imposta scala. Nella finestra pop-up, inserisci 1.0 nel campo delle proporzioni pixel e imposta micrometro come unità di lunghezza.

Nel campo Distanza in pixel, immettere la larghezza dell'immagine in pixel. Nel campo Distanza nota, inserisci la larghezza effettiva dell'immagine in micron. Per misurare la dimensione del liposoma, utilizzando lo strumento di selezione ovale nella barra degli strumenti, disegnare un cerchio lungo il bordo del liposoma.

Vai ad analizzare, quindi fai clic su misura, per misurare l'area del cerchio, da cui è possibile calcolare il diametro del liposoma. Il successo della generazione di liposomi viene verificato attraverso la visualizzazione del sottile anello circolare che è il doppio strato lipidico fluorescente verde. Sotto un laser a 488 nanometri utilizzando la microscopia confocale per confermare l'incapsulamento del colorante fluorescente.

L'ambiente interno dei liposomi dovrebbe essere uniformemente fluorescente sotto un laser a 647 nanometri. La formazione di liposomi potrebbe essere visualizzata dai sottili anelli circolari verdi. Gli effetti ricostituiti nelle reti all'interno dei liposomi sono eterogenei, manifestandosi come strutture reticolari ramificate di filamenti di actina.

L'architettura del ramo è stata innescata dall'introduzione del complesso ARP due tre, che controlla simultaneamente la nucleazione e la ramificazione dei filamenti di actina, insieme a VCA HEZ. Uno strato di actina sottile, ma densamente ramificato, viene creato sul foglietto interno del doppio strato di liposomi che può essere visualizzato come un mosto fluorescente. La miscela tampone finale audio lipidico deve essere generalmente pompata avanti e indietro attraverso una siringa di vetro, per evitare l'introduzione di bolle d'aria.

La miscela deve essere biancastra dopo il processo. Questa tecnica ha aperto la strada alla costruzione di un modello minimale della cellula, privo di complesse regolazioni biochimiche. Con questo sistema di imitazione cellulare i ricercatori possono esplorare le proprietà meccaniche e dinamiche delle proteine del citoscheletro, del nucleatore e del motore molecolare.