Valutazione non distruttiva della densità cellulare regionale all'interno degli aggregati tumorali dopo il trattamento farmacologico

Questo protocollo fornisce informazioni sulla progressione del modello tumorale in modo non distruttivo. Fornisce anche indicazioni di risposta terapeutica attraverso interi regimi farmacologici all'interno di singoli aggregati piuttosto che fare affidamento su campioni di corrispondenza dell'età. I metodi convenzionali per ottenere densità e vitalità delle celle all'interno degli aggregati richiedono la fissazione e il sezionamento del campione, mentre il nostro fornisce dati in modo non distruttivo.

Pertanto, le modifiche possono essere monitorate all'interno di un singolo aggregato nel tempo. Si prevede che questa tecnica migliorerà la nostra comprensione della risposta ai farmaci all'interno di regioni discrete di modelli aggregati, con implicazioni su quanto bene questi modelli riflettano le risposte in vivo e le applicazioni di screening dei farmaci. Per iniziare, preparare colture cellulari di confluenza dal 70 al 90% delle linee cellulari desiderate in condizioni standard.

Staccare i monostrati cellulari dai loro palloni di coltura seguendo il metodo standard di tripsinizzazione e aggiungere la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga. Aggiungere 10 microlitri della sospensione cellulare a un emocitometro e contare al microscopio per determinare il numero di cellule nella sospensione. Celle a pellet tramite centrifugazione e celle risospese in mezzi alla concentrazione desiderata di 2,5 volte 10 alla quinta cella per millilitro.

Per le sospensioni preparate con la matrice della membrana basale, rimuovere il flaconcino della matrice da meno 20 gradi Celsius e posto in frigorifero per scongelare durante la notte. Preparare un contenitore con mezzi di crescita e conservare in frigorifero per 10 minuti per raffreddare. Utilizzando una punta di pipetta congelata aggiungere la matrice al mezzo refrigerato in modo tale che la concentrazione finale di questa soluzione sia del 5%Aggiungere 50 microlitri di questo mezzo a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo e non aderente in modo tale che la concentrazione finale di matrice in questi pozzetti sarà del 2,5% dopo l'aggiunta di sospensione cellulare.

Per le sospensioni preparate senza matrice, aggiungere 50 microlitri di terreni di crescita semplici a ciascun pozzetto. Erogare 50 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto. Centrifugare le piastre a 123 G per 10 minuti a temperatura ambiente subito dopo la semina per garantire la raccolta di un pellet cellulare sul fondo di ogni pozzetto.

Utilizzare un sistema OCT per l'imaging strutturale. Impostare la velocità di scansione A su 5,5 kilohertz per la raccolta di immagini ad alta risoluzione. Impostare l'indice di rifrazione a 1,33 per i campioni in un mezzo liquido.

Nella finestra dei parametri dell'immagine sul lato destro dello schermo, impostare il campo visivo inserendo i valori X, Y e Z in modo che il campione sia compreso in questa regione di interesse. Fare clic su Modalità di acquisizione 3D e quindi fare clic su Registra per raccogliere la scansione del volume 3D del campione. Per creare la ricostruzione del volume, apri Imaris e vai al file TIF convertito all'interno della loro arena.

Vai a modifica, quindi fai clic su Proprietà immagine e inserisci la dimensione voxel dall'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office nelle caselle XYZ corrispondenti. Quindi, fare clic su OK. Fate clic su Aggiungi nuove superfici (Add New Surfaces) sopra l'albero degli oggetti. Nel menu sotto l'albero, fai clic su Salta creazione automatica e modifica manualmente.

All'interno della finestra di regolazione dello schermo, far scorrere manualmente le frecce rosse e nere per migliorare il contrasto tra il campione e lo sfondo e migliorare la visualizzazione del campione. Regolare la posizione della fetta sulla fetta su un bordo del campione. Utilizzare il tasto Esc per passare il mouse dalla modalità di navigazione alla modalità di selezione e quindi fare clic su Disegna.

Tracciare manualmente il contorno della regione che visualizza il segnale. Avanzate la posizione della sezione immettendo la posizione successiva nella casella di input. Questa posizione successiva dovrebbe essere inferiore o uguale a 100 fette più avanti nel campione rispetto alla precedente.

Tracciare manualmente la regione che visualizza il segnale. Ripetere questo passaggio attraverso lo spessore del campione fino a raggiungere il bordo opposto del campione. Quindi fare clic su Crea superficie e menu a sinistra per cucire insieme queste sezioni.

Infine, fai clic su Modifica, quindi fai clic su Selezione maschera, quindi fai clic su OK per completare la ricostruzione del volume. Per ottenere la densità totale delle celle del campione, selezionate Aggiungi nuovi punti. Nel menu delle impostazioni dell'algoritmo, deseleziona tutte le caselle.

Fare clic sulla freccia blu per passare alla schermata del canale sorgente. Dal menu a discesa visualizzato, selezionare canale mascherato. Immettere il diametro medio della cella per il campione nella casella diametro XY.

Assicurarsi che la sottrazione in background sia selezionata. Fai clic sulla freccia blu per passare alla schermata del punto di classificazione. Nel grafico nella parte inferiore del menu, fare clic e trascinare il bordo sinistro della soglia gialla sul bordo sinistro del grafico in modo che tutti gli oggetti siano inclusi nella soglia ombreggiata gialla.

Quindi fare clic sulla freccia verde per completare la creazione dello spot. Ottenere il numero di oggetti identificati facendo clic su Statistiche. Quindi fai clic su Complessivo e infine su Numero totale di punti.

Fate clic sulla superficie creata e accedete alla scheda Qualità stile superfici (Surfaces Style Quality). Modificare la selezione in Punto centrale e modificare la larghezza dei pixel in meno di 20 per una migliore visibilità. Passare a Statistiche.

Quindi fai clic su Dettagliato, quindi su Posizione e registra la posizione nel punto centrale. Selezionate Aggiungi nuovo fotogramma di riferimento dal menu sopra l'albero degli oggetti. Seleziona le caselle visibili e fisse accanto alla X, Y nel menu.

Fate clic e trascinate il centro dell'icona del fotogramma di riferimento in modo che sia in linea con il punto centrale. Deseleziona le caselle XY visibili e fisse e selezionale per XZ. Ancora una volta, fate clic e trascinate il centro dell'icona del fotogramma di riferimento in modo che sia in linea con il punto centrale. Infine, ripetete questa operazione per il piano YZ, alternando questi tre piani fissi fino a quando il sistema di riferimento non si allinea perfettamente con il punto centrale.

Fate doppio clic sul quadro di riferimento nell'albero degli oggetti e rinominatelo al centro o simile. Fai clic sugli spot creati e vai a Statistiche. Quindi fate clic su Dettagliato (Detailed), quindi su Sistema di riferimento posizione (Position Reference Frame).

Fate clic sul fotogramma di riferimento posizione X finché non viene ordinato dal valore più alto a quello più basso. Registrare il valore più alto per ottenere il raggio degli aggregati. Eseguire calcoli manuali per determinare ulteriori posizioni di interesse.

A tale scopo, aggiungere 100 micrometri al valore centrale X e quindi utilizzare i valori Y e Z del punto centrale per definire la prima posizione lungo l'asse centrale. Seleziona Aggiungi nuovi spot. Quindi seleziona Ignora la creazione automatica Modifica manualmente.

Tieni premuto il pulsante Maiusc sulla tastiera e fai clic in un punto qualsiasi dello schermo per posizionare un nuovo punto. Immettere i valori di posizione XYZ per la prima posizione di interesse. Selezionate quindi Aggiungi nuovo fotogramma di riferimento e allineatelo sullo spot.

Aggiungi 100 micrometri a ogni posizione X sequenziale. Posizionare l'ultimo sistema di riferimento a meno di 50 micrometri di distanza dal raggio esterno del campione. Fai clic sugli spot creati e vai a Statistiche.

Nell'angolo in basso a destra del menu, fai clic su Esporta tutte le statistiche in file e salva i dati in un foglio di calcolo. Apri il foglio di calcolo. Passare alla scheda del fotogramma di riferimento di origine.

Utilizzate la funzione mod per assegnare numericamente ogni distanza al sistema di riferimento corrispondente. Filtrate i valori in questa colonna per lavorare con le distanze in ogni fotogramma di riferimento. Per ciascuno dei quadri di riferimento, calcolare il numero di oggetti entro 50 micrometri dal fotogramma utilizzando la funzione CONTA.SE.

Il valore risultante corrisponde al numero di celle in quel tappo regionale. Dividere questo valore per il volume della spina da 100 micrometri per ottenere la densità della cella. Il test T dello studente ha rivelato una densità cellulare significativamente più elevata nel nucleo sferoide rispetto agli strati transizionali ed esterni per i modelli sferoidi MDA-MB-231.

Il risultato indica la compattazione in questo nucleo sferoide dopo quattro giorni. All'interno di entrambi i modelli aggregati AU565 e MDA-MB-231, l'aggiunta della matrice non sembra influenzare il volume o il conteggio cellulare, e quindi sembra avere un'influenza trascurabile sulla proliferazione cellulare. Piuttosto, l'aggiunta di matrice sembra ridistribuire la densità cellulare promuovendo una significativa compattazione del nucleo e diminuendo la densità cellulare negli strati esterni.

Questi risultati forniscono preziose informazioni sui meccanismi fisici attraverso i quali la matrice consente l'aggregazione cellulare in diverse linee cellulari di cancro al seno. Guardando successivamente ai tumori AU565 sferoidi preparati con matrice, gli aggregati maturi sono stati trattati con trastuzumab e la densità cellulare regionale è stata valutata attraverso un regime farmacologico di cinque giorni. I tappi sono stati impostati ogni 100 micrometri in tutto lo spessore degli aggregati.

Piccole fluttuazioni nella densità cellulare sono state osservate nel tempo entro i 500 micrometri interni di ciascun aggregato che indicano una morte cellulare minima. La visualizzazione della morte cellulare come risposta indicativa al farmaco principalmente negli strati esterni degli sferoidi tumorali è coerente con i problemi di penetrazione del farmaco di trastuzumab. Ora possiamo misurare in modo non distruttivo la vitalità cellulare negli aggregati senza sacrificare la struttura.

Ciò consente la valutazione della risposta longitudinale al farmaco in singoli aggregati tumorali per identificare le qualità temporali e di penetrazione dei farmaci antitumorali candidati.