Name: Fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Impara a creare scaffold di alginato macroporoso secco (Drydux) per la trasduzione virale efficiente delle cellule T attivate. Questo metodo semplifica l'ingegneria genetica e offre un'alternativa economica alla spinoculazione su piastriche rivestite con RetroNectin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health attraverso i numeri di sovvenzione R37-CA260223, R21CA246414. Ringraziamo il nucleo di citometria a flusso NCSU per la formazione e la guida sull'analisi della citometria a flusso. Gli schemi sono stati creati con Biorender.com

Tutte le procedure che coinvolgono cellule primate umane e vettori retrovirali sono state eseguite in conformità con le linee guida sulla sicurezza biologica della North Carolina State University e approvate dall'Ufficio per la salute e la sicurezza ambientale. Le cellule mononucleate del sangue periferico umano sono state acquistate come buffy coat da fonti commerciali. Le cellule umane primarie devono essere isolate dalle frazioni del rivestimento di buffy umano e richiedono l'autorizzazione di livello 2 di biosicurezza e procedure operative standard dettagliate e l'approvazione da parte dell'istituzione in cui si svolgerà il lavoro. I vettori virali, compresi i supernatanti vettori retrovirali utilizzati per la trasduzione preparati come descritto in precedenza19, possono essere classificati come livello di biosicurezza 1 o livello di biosicurezza 2 a seconda della proteina codificata e richiedono l'approvazione del comitato istituzionale competente per la biosicurezza.
1. Realizzazione degli scaffold di alginato macroporoso
<ol><li>Preparare una soluzione madre di gluconato di calcio D allo 0,4% (peso per volume) aggiungendo acqua deionizzata filtrata sterile al gluconato di calcio D in un becher. Mescolare a velocità media fino a quando il gluconato di calcio si è sciolto (~ 1,5 h), filtrare sterile e conservare a temperatura ambiente. NOTA: Non è necessario controllare il pH della soluzione.</li>
	<li>Preparare una soluzione di alginato al 2% (peso per volume) in un flaconcino o becher con tappo a vite. Aggiungere con attenzione l'alginato ultrapuro alla nave e aggiungere acqua deionizzata filtrata sterile all'alginato. Scegli il più grande agitatore possibile che non impedisca la miscelazione e aggiungilo al recipiente. NOTA: Informazioni sul tipo di alginato ultrapuro utilizzato per questo protocollo sono disponibili nella tabella dei materiali e sul sito web Novamatrix20. Diversi alginati non sono stati esplorati per questi scafffold, in quanto possono portare a cambiamenti indesiderati nella porosità e nella biocompatibilità degli scaffold 9,10,11.</li>
	<li>Mescolare la soluzione ad alta velocità fino a quando l'alginato si scioglie (~1 h). Se ci sono grandi ciuffi sui lati della nave, inclinare la nave per spostarli. Piccole quantità di alginato sui lati si dissolveranno durante l'agitazione e non sono motivo di preoccupazione. NOTA: Non è necessario controllare il pH della soluzione.</li>
	<li>Quando l'alginato si dissolve, ridurre la velocità di agitazione, aggiungere lentamente un volume uguale di gluconato di calcio D allo 0,4% alla soluzione di alginato per evitare la formazione di grumi di reticolazione e mescolare vigorosamente per 15 minuti.</li>
	<li>Inclinare lateralmente il becher o il flaconcino per rimuovere eventuali grumi che potrebbero essersi formati. NOTA: Si consiglia di utilizzare un omogeneizzatore. La soluzione finale dovrebbe essere otticamente chiara.</li>
	<li>Pipettare il volume desiderato della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti o di una piastra a 24 pozzetti. Utilizzare 300 μL/pozzetto per una piastra da 48 pozzetti e 1 ml/pozzetto per una piastra da 24 pozzetti. Lanciare lentamente e cambiare le punte frequentemente, poiché la soluzione sarà viscosa e si attaccherà alla punta.</li>
	<li>Coprire le piastre con coperchi e congelare per una notte a -20 °C.</li>
	<li>Preparare la piastra per il liofilizzante rimuovendo il coperchio e fissando la parte superiore con salviette e elastici. Posizionare le piastre in boccette da 750 ml a 2.000 ml di liofilizzatore e posizionare sul liofilizzatore per 72 ore.</li>
	<li>Dopo 72 h, rimuovere la piastra dal liofilizzatore e sostituire il coperchio. Sigillare la piastra e conservare a 4 °C. Per una conservazione a lungo termine, sigillare sottovuoto la piastra prima di conservarla a 4 °C. Conservare asciutto fino al momento del bisogno. NOTA: Preparare una soluzione extra di alginato di calcio a causa di un errore di volume (alcuni si attaccano alle pareti del flaconcino, punte delle pipette). Ad esempio, per realizzare quattro scaffold in una piastra da 24 pozzetti, sono necessari 4 ml di soluzione combinata (2 ml di alginato + 2 ml di calcio D gluconato), ma si consiglia di preparare 2,5 ml di soluzione di alginato al 2% e 2,5 ml di soluzione di gluconato di calcio D allo 0,4%.</li>
</ol>2. Trasduzione
<ol><li>Concentrazione di surnatante virale con filtri da 100 kDa<ol><li>Idratare il filtro centrifugo per 2 minuti con 1 mL di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Scartare il PBS.</li>
		<li>Concentrare la sospensione virale aggiungendo 2 ml di sospensione virale (1 × 106 TU/ml) e centrifugandola attraverso il filtro centrifugo a 1.500 × g per 10 minuti in un rotore a benna oscillante. NOTA: sono necessari da uno a duecento microlitri di virus concentrato per impalcatura.</li>
		<li>Ruotare per qualche minuto supplementare se il volume concentrato della sospensione virale è superiore a 200 μL.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.1.1-2.1.3 per ogni impalcatura. NOTA: È anche accettabile concentrare una grande scorta di virus e prelevare 100-200 μL di aliquote dallo stock concentrato.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellule attivate dal seme e virus insieme.<ol><li>Per ogni impalcatura, preparare un'aliquota sospendendo 1 × 106 cellule mononucleate del sangue periferico attivate (PBMC) in 50 μL di terreno di coltura cellulare completo (250 mL di supporti Click's + 250 mL di RPMI 1640 di media + 50 mL di siero fetale bovino + 5 mL di sostituto della glutammina + 5 mL di penicillina/streptomicina). NOTA: vedere il file supplementare 1 per un protocollo su come attivare i PBMC.</li>
		<li>Aggiungere il surnatante virale concentrato (~2 × 106 TU, MOI 2) alla sospensione cellulare. Il volume totale della sospensione di virus cellulare non deve superare 200 μL per un'impalcatura a 48 pozzetti o 350 μL per un'impalcatura a 24 pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere la miscela di virus cellulare a goccia nella parte superiore dell'impalcatura asciutta. Per gli esperimenti di controllo negativo, utilizzare terreni di coltura cellulare completi al posto del virus concentrato. Aggiungere la sospensione cellulare nella parte superiore dell'impalcatura asciutta.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.2.1-2.2.3 per ogni impalcatura.</li>
		<li>Incubare gli scaffold in un incubatore di colture cellulari a 37 °C per 45-60 minuti. Rimuovere le impalcature dall'incubatore; Gli scaffold assorbiranno completamente la soluzione durante questo periodo.</li>
		<li>Per indurre la proliferazione, aggiungere terreni di coltura cellulare completi integrati con IL-15 (5 ng / mL) e IL-7 (10 ng / mL) a ciascun pozzetto; IL-2 può anche essere usato. Aggiungere 500 μL a ciascuna impalcatura a 48 pozzetti o 1 mL a ciascuna impalcatura a 24 pozzetti.</li>
		<li>Incubare gli scaffold a 37 °C per 72 h. Man mano che le cellule proliferano, i media diventeranno arancioni.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolare le cellule dagli scaffold per l'analisi.<ol><li>Diluire 0,5 M EDTA a 0,25 M EDTA in 1x PBS.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo in eccesso da ciascun pozzetto e raccogliere in provette da centrifuga separate da 15 ml.</li>
		<li>Per isolare le cellule dallo scaffold, aggiungere 0,25 M EDTA a ciascuna impalcatura. Aggiungere 300 μL a scaffold a 48 pozzetti o da 1 mL a scaffold a 24 pozzetti. Lasciare riposare il piatto o agitare delicatamente per 3-4 minuti.</li>
		<li>Una volta che l'impalcatura è per lo più sciolta, pipettare dentro e fuori delicatamente all'interno del pozzetto. Potrebbero essere necessari alcuni passaggi di pipettaggio in entrata e in uscita per dissolvere completamente lo scaffold. Se non si dissolve in 10 minuti, aggiungere altri 200 μL di 0,25 M EDTA.</li>
		<li>Una volta che lo scaffold si scioglie completamente, trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 ml.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 2.3.4 e 2.3.5 per ogni impalcatura.</li>
		<li>Lavare le celle due volte aggiungendo 12 mL di PBS a ciascuna provetta da centrifuga e centrifugando a 400 × g per 5 minuti. Un pellet cellulare si formerà sul fondo di ogni tubo. Aspirare il surnatante e ripetere il lavaggio. Fare attenzione ad aspirare completamente il surnatante ad ogni lavaggio in quanto è fondamentale rimuovere tutto l'EDTA.</li>
		<li>Dopo il secondo lavaggio con PBS, il pellet cellulare è ora pronto per l'analisi. Seguire il protocollo appropriato richiesto per l'analisi.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+ready+for+the+next+round+of+clinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anticancer+Therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing.</a> Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).</li>
<li>Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+for+glioblastoma%3A+recent+clinical+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges.</a> Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).</li>
<li>Nair, R., Westin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1342, 297-317 (2021).</li>
<li>Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+CAR+T-cells+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Driving CAR T-cells forward.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 13 (6), 370-383 (2016).</li>
<li>Sterner, R. C., Sterner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cell+therapy%3A+current+limitations+and+potential+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cancer+Journal%22%5BJournal%5D)">CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies.</a> Blood Cancer Journal. 11 (4), 69(2021).</li>
<li>Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy%3A+A+new+era+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).</li>
<li>Lee, H. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retronectin+enhances+lentivirus-mediated+gene+delivery+into+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%3A+Journal+of+the+International+Association+of+Biological+Standardization%22%5BJournal%5D)">Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells.</a> Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).</li>
<li>Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinoculation+and+retronectin+highly+enhance+the+gene+transduction+efficiency+of+Mucin-1-specific+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+in+human+primary+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57(2021).</li>
<li>Sun, J., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-based+biomaterials+for+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications.</a> Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).</li>
<li>Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+14+-+Alginate-based+scaffolds+for+drug+delivery+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Alginates+in+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering.</a> Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).</li>
<li>Lee, K. Y., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%3A+properties+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Alginate: properties and biomedical applications.</a> Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).</li>
<li>Kuo, C. K., Ma, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionically+crosslinked+alginate+hydrogels+as+scaffolds+for+tissue+engineering%3A+part+1.+Structure%2C+gelation+rate+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties.</a> Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).</li>
<li>Soccol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+nondairy+beverages%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Plant-Based+Fermented+Food+and+Beverage+Technology%2C+Second+Edition%22%5BJournal%5D)">Probiotic nondairy beverages.</a> Handbook of Plant-Based Fermented Food and Beverage Technology, Second Edition. , 707-728 (2012).</li>
<li>Moody, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoring+carboxylates+on+highly+modified+alginates+improves+gelation%2C+tissue+retention+and+systemic+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture.</a> Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).</li>
<li>Brudno, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replenishable+drug+depot+to+combat+post-resection+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence.</a> Biomaterials. 178, 373-382 (2018).</li>
<li>Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+cross-linking+improves+retention+and+targeting+of+refillable+alginate+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots.</a> Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-mediated+static+transduction+of+T+Cells+for+CAR-T+Cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275(2020).</li>
<li>Agarwalla, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinstructive+implantable+scaffolds+for+rapid+in+vivo+manufacture+and+release+of+CAR-T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells.</a> Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).</li>
<li>Vera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+redirected+against+the+kappa+light+chain+of+human+immunoglobulin+efficiently+kill+mature+B+lymphocyte-derived+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells.</a> Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).</li>
<li>PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/">https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/</a> (2022).</li>
<li>Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+effector+T+cell+functions+and+activity+of+immunomodulatory+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies.</a> Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).</li>
<li>Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+assessment+of+human+T+cell+activation+by+real-time+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis.</a> STAR Protocols. 3 (1), 101084(2022).</li>
<li>Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true">https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true</a> (2022).</li>
<li>Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+alginate%2Fhydroxyapatite+composite+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%3A+Preparation%2C+characterization%2C+andin+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).</li>
<li>Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+poly%28ethylene+glycol%29+aligned+porous+cryogels+using+a+unidirectional+freezing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique.</a> Soft Matter. 8 (13), 3620(2012).</li>
</ol>

P.A. e Y.B. sono inventori di brevetti relativi all'uso di biomateriali per la generazione di terapie cellulari CAR-T. Y.B. riceve una borsa di ricerca sponsorizzata dall'industria relativa alla tecnologia terapeutica delle cellule CAR-T (non correlata a questo lavoro). Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

La terapia cellulare CAR-T continua a guadagnare interesse sia per la ricerca che per le applicazioni commerciali. Nonostante il successo della terapia cellulare CAR-T nel trattamento dei tumori del sangue, l'alto costo della procedura ne limita l'uso. Il protocollo qui presentato introduce un nuovo metodo per il trasferimento genico virale delle cellule T senza la necessità di spinoculazione di piastre rivestite di retronectina. La produzione di scaffold di alginato macroporoso secco per mediare la trasduzione è relativ...

L'immunoterapia è emersa come un paradigma rivoluzionario per il trattamento del cancro grazie alla sua capacità di colpire specificamente i tumori, limitare la citotossicità fuori bersaglio e prevenire le ricadute. In particolare, la terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico T (CAR-T) ha guadagnato popolarità grazie al suo successo nel trattamento di linfomi e leucemie. La FDA ha approvato la prima terapia cellulare CAR-T nel 2017 e, da allora, ha approvato altre quattro terapie cellulari CAR-T 1,2,3,4,5. Le CAR hanno un dominio di riconoscimento dell'antigene solitamente costituito da un frammento variabile a catena singola di un anticorpo monoclonale specifico per un antigene associato al tumore 3,4. Quando una CAR interagisce con il suo antigene associato al tumore, le cellule CAR-T si attivano, portando a una risposta antitumorale che coinvolge il rilascio di citochine, la degranulazione citolitica, l'espressione del fattore di trascrizione e la proliferazione delle cellule T. Per produrre cellule CAR-T, il sangue viene raccolto dal paziente per ottenere le loro cellule T. Le CAR vengono aggiunte geneticamente alle cellule T del paziente utilizzando un virus. Le cellule CAR-T vengono coltivate in vitro e reinfuse nel paziente 2,3,4,6. La generazione di successo delle cellule CAR-T è determinata dall'efficienza di trasduzione, che descrive il numero di cellule T geneticamente modificate in cellule CAR-T.
Attualmente, il gold standard per la generazione di cellule CAR-T è la spinoculazione di cellule T attivate e virus su piastre rivestite di retronectina 7,8. La trasduzione inizia quando le particelle virali interagiscono con la superficie delle cellule T. La retronectina promuove la colocalizzazione di virus e cellule aumentando l'efficienza di legame tra le particelle virali e le cellule, migliorando la trasduzione 7,8. La retronectina non funziona bene da sola e deve essere accompagnata da spinoculazione, che migliora il trasferimento genico concentrando le particelle virali e aumentando la permeabilità superficiale delle cellule T, consentendo una più facile infezione virale8. Nonostante il successo della spinoculazione su piastre rivestite di retronectina, si tratta di un processo complesso che richiede più cicli di centrifuga e costosi reagenti. Pertanto, metodi alternativi per il trasferimento genico virale che sono più rapidi ed economici sono altamente desiderabili.
L'alginato è un polisaccaride anionico naturale ampiamente utilizzato nell'industria biomedica grazie al suo basso costo, al buon profilo di sicurezza e alla capacità di formare idrogel dopo la miscelazione con cationi bivalenti 9,10,11,12. L'alginato è un polimero conforme alle GMP ed è generalmente riconosciuto come sicuro (GRAS) dalla FDA13. L'alginato reticolante con i cationi crea idrogel stabili spesso utilizzati nella guarigione delle ferite, nella consegna di piccoli farmaci chimici e proteine e nel trasporto cellulare 9,10,11,12,14,15,16. Grazie alle sue eccellenti proprietà gelificanti, l'alginato è il materiale preferito per creare scaffold porosi mediante liofilizzazione10,17. Queste caratteristiche dell'alginato lo rendono un candidato attraente per la produzione di un'impalcatura in grado di mediare il trasferimento genico virale delle cellule attivate.
Qui è descritto un protocollo per la realizzazione di scaffold di alginato macroporoso secco, noti come scaffold di Drydux, che trasducono staticamente le cellule T mediante trasferimento genico virale17,18. Il processo per la realizzazione di questi scaffold è illustrato nella Figura 1. Questi scaffold eliminano la necessità di spinoculazione delle piastre rivestite di retronectina. Gli scaffold macroporosi di alginato incoraggiano l'interazione di particelle virali e cellule T per consentire un efficiente trasferimento genico in un unico passaggio senza compromettere la funzionalità e la vitalità delle cellule T ingegnerizzate17. Se seguiti correttamente, questi scaffold di alginato macroporoso hanno un'efficienza di trasduzione di almeno l'80%, semplificando e abbreviando il processo di trasduzione virale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64036/64036fig01v2.jpg"> Figura 1: Schema e calendario del protocollo . (A) Calendario per la realizzazione degli scaffold di alginato macroporoso secco. L'alginato è reticolato con calcio-D-gluconato e congelato durante la notte. Gli scaffold congelati vengono liofilizzati per 72 ore per creare gli scaffold Drydux. (B) Cronologia per la trasduzione virale delle cellule attivate. Le cellule attivate e il virus (MOI 2) vengono seminati sopra l'impalcatura e incubati in terreni completi integrati con IL-7 e IL-15. Gli scaffold assorbono la miscela e promuovono il trasferimento genico virale. L'EDTA viene utilizzato per dissolvere gli scaffold e isolare le cellule trasdotte. Dopo aver lavato due volte con PBS, il pellet cellulare può essere utilizzato per l'analisi. Abbreviazioni: PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; PBMCs = cellule mononucleate del sangue periferico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64036/64036fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>UltraPure, pH 8,0</td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Senza cloruro di calcio o cloruro di magnesio</td></tr><tr><td>3% Acido acetico con Methylene Blue</td><td>Stemcell Technologies Inc</td><td>07060</td><td></td></tr><tr><td>Cellule mononucleate del sangue perifroideo attivato</td> <td>-</td><td></td> <td>Fresco o congelato</td></tr><tr><td>Calcio-D-gluconato</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11649</td><td></td></tr><tr><td>CD28.2 Anticorpo</td><td>BD</td><td>555725</td><td>1 mg/mL</td></tr><tr><td>CD3 Anticorpo</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-387</td><td>100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Click's Media</td><td>FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>DI Acqua</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35-050-061</td><td></td></tr><tr><td>HyClone FBS</td><td>Cytvia</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI 1640 Media</td><td>Cytvia</td><td>SH3009601</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (P/S)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cellule mononucleate del sangue periferico</td> <td>-</td><td></td> <td>Fresco o congelato</td></tr><tr><td>PRONOVA UP MVG</td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>Alginato di sodio</td></tr><tr><td>ricombinante umano IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15</td><td>5 ng / mL</td></tr><tr><td>Ricombinante umano IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>10 ng / mL</td></tr><tr><td>Retrovirus</td> <td>-</td><td></td> <td>1 x 106 TU / Ml</td></tr></tbody></table>

fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule t

Fabrication and Use of Dry Macroporous Alginate Scaffolds for Viral Transduction of T Cells

L'ingegneria genetica delle cellule T per la terapia cellulare CAR-T è arrivata alla ribalta nel trattamento del cancro negli ultimi anni. Le cellule CAR-T sono prodotte dal trasferimento genico virale nelle cellule T. L'attuale gold standard del trasferimento genico virale comporta la spinoculazione di piastre rivestite di retronectina, che è costosa e richiede tempo. Vi è una significativa necessità di metodi efficienti ed economici per generare celle CAR-T. Qui è descritto un metodo per fabbricare scaffold di alginato macroporoso poco costoso e secco, noti come scaffold Drydux, che promuovono efficacemente la trasduzione virale delle cellule T attivate. Gli scaffold sono progettati per essere utilizzati al posto della spinoculazione gold standard di piastre rivestite di retronectina seminate con virus e semplificano il processo di trasduzione delle cellule. L'alginato è reticolato con calcio-D-gluconato e congelato durante la notte per creare gli scaffold . Gli scaffold congelati vengono liofilizzati in un liofilizzatore per 72 ore per completare la formazione degli scaffold macroporosi asciutti. Gli scaffold mediano il trasferimento genico virale quando il virus e le cellule T attivate vengono seminati insieme sulla parte superiore dell'impalcatura per produrre cellule geneticamente modificate. Gli scaffold producono >85% di trasduzione primaria delle cellule T, che è paragonabile all'efficienza di trasduzione della spinoculazione su piastre rivestite di retronectina. Questi risultati dimostrano che gli scaffold di alginato macroporoso secco servono come alternativa più economica e più conveniente al metodo di trasduzione convenzionale.

Questi scaffold di alginato macroporoso sono facili da realizzare e dovrebbero uscire dal liofilizzatore come dischi porosi, soffici e bianchi. Sebbene non studiata in questo esperimento, la soluzione di calcio-alginato può essere colata in diversi stampi per creare scaffold di forme variabili, a seconda delle esigenze dell'utente 9,10. Gli scaffold sono elettrostatici e possono attaccarsi al coperchio della piastra del pozzetto o a un dito guantato. <strong clas...

Qui è un protocollo per la creazione di scaffold di alginato macroporoso secco che mediano un efficiente trasferimento genico virale per l'uso nell'ingegneria genetica delle cellule T, comprese le cellule T per la terapia cellulare CAR-T. Gli scaffold hanno dimostrato di trasdurre le cellule T primarie attivate con una trasduzione del >85%.

Fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule T

Genetic engineering of T cells for CAR-T cell therapy has come to the forefront of cancer treatment over the last few years. CAR-T cells are produced by ...

Descritto in questo video è un protocollo per la creazione e l'utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco noto come Drydux che promuove efficacemente la trasduzione delle cellule T attivate. Drydux è progettato per essere utilizzato al posto della spinoculazione gold standard di piastre rivestite con RetroNectin seminate con virus e semplifica il processo di trasduzione delle cellule. Drydux ha un'efficienza di trasduzione paragonabile alla spinoculazione su piastre rivestite con RetroNectin e rappresenta un'alternativa più economica e conveniente al metodo di trasduzione convenzionale.In primo luogo, preparare una soluzione allo 0,4% di calcio-D-gluconato. Aggiungere acqua DI filtrata sterile al calcio-D-gluconato in un becher. Mescolare a velocità media fino a quando il calcio-D-gluconato si è sciolto, il che richiede circa 1 1/2 ore.Una volta sciolto, filtrare sterile la soluzione di calcio-D-gluconato. Questa soluzione può essere conservata a temperatura ambiente. Quindi, preparare una soluzione di alginato al 2%.Questo può essere realizzato utilizzando una fiala con tappo a vite o un becher. Entrambi saranno mostrati qui. Aggiungere con attenzione l'alginato ultrapuro al recipiente.Aggiungere la quantità appropriata di acqua DI all'alginato. Scegli il più grande agitatore possibile che non impedisca la miscelazione e aggiungilo al recipiente. Mescolare la soluzione in alto fino a quando l'alginato si scioglie, il che richiede circa un'ora.Se ci sono grandi ciuffi di alginato sul lato della nave, inclinare la nave lateralmente per spostarli. Piccoli grumi si dissolveranno nel corso dell'ora e non sono motivo di preoccupazione. Una volta che la soluzione di alginato al 2% si scioglie, ridurre la velocità di agitazione.Aggiungere lentamente un volume uguale della soluzione di calcio-D-gluconato alla soluzione di alginato. Aggiungerlo lentamente aiuterà a prevenire la formazione di grumi di reticolazione. Quando la soluzione di calcio-gluconato è stata aggiunta, aumentare la velocità di agitazione e mescolare vigorosamente per 15 minuti.Inclinare la nave lateralmente per rimuovere eventuali grumi che potrebbero essersi formati. Dopo aver agitato vigorosamente per 15 minuti, assicurarsi che non ci siano grumi nella soluzione. Pipettare la soluzione in una piastra da 48 o 24 pozzetti.Per una piastra da 48 pozzetti, pipettare 300 microlitri in ciascun pozzetto. Assicurarsi di lanciare lentamente e cambiare spesso le punte, poiché la soluzione sarà viscosa e potrebbe attaccarsi alla punta. Per una piastra da 24 pozzetti, pipettare un millilitro in ciascun pozzetto.Anche in questo caso, lanciare lentamente e cambiare spesso le punte delle pipette. Coprire le piastre del pozzo con un coperchio e congelare a 20 gradi Celsius negativi durante la notte. Preparare i piatti per il liofilizzante rimuovendo i coperchi e fissando la parte superiore con salviette e elastici.Posizionare le piastre nel tubo del liofilizzatore e indossare il liofilizzatore per 72 ore. Dopo 72 ore, rimuovere la piastra dal liofilizzatore. Gli scaffold sono ora pronti per essere utilizzati per la trasduzione.Se non si utilizzano immediatamente i ponteggi, sigillare la piastra con Parafilm e conservare a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di sigillare sottovuoto la piastra oltre alla sigillatura con Parafilm. Concentrare il surnatante virale centrifugando due millilitri di soluzione virale attraverso un filtro centrifugo a 1.500 g per 10 minuti.Sono necessari da 100 a 200 microlitri di virus concentrato per impalcatura. Ruotare per qualche minuto aggiuntivo se il volume della soluzione virale concentrata è superiore a 200 microlitri. Per ogni impalcatura, fare un'aliquota di 1 milione di cellule T attivate sospese in 50 microlitri di terreno di coltura cellulare completo.Aggiungere il virus concentrato alla sospensione cellulare. Il volume totale della sospensione del virus cellulare non deve superare i 200 microlitri per uno scaffold a 48 pozzetti o 350 microlitri per uno scaffold a 24 pozzetti. Aggiungere la miscela di virus cellulare goccia a goccia nella parte superiore dell'impalcatura asciutta.Per gli esperimenti di controllo negativo, utilizzare terreni di coltura cellulare completi al posto del virus concentrato. Aggiungere questa sospensione cellulare nella parte superiore dell'impalcatura asciutta. Incubare gli scaffold nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti.Rimuovere i ponteggi dall'incubatore. Gli scaffold dovrebbero assorbire completamente la soluzione durante questo periodo. Per indurre la proliferazione, aggiungere terreni di coltura cellulare completi integrati con IL-7 e IL-15 a ciascun pozzetto.IL-2 può anche essere usato. Per un'impalcatura a 24 pozzetti, aggiungere un millilitro. Per un'impalcatura da 48 pozzetti, aggiungere 500 microlitri.Incubare a 37 gradi Celsius per 72 ore. Le cellule proliferano nel corso delle 72 ore, il che può trasformare il mezzo in arancione. Rimuovere i supporti in eccesso da ciascun pozzetto.Per isolare le cellule dallo scaffold, aggiungere una soluzione di EDTA molare 0,25 a ciascuna impalcatura. Aggiungere un millilitro per scaffold da 24 pozzetti o 300 microlitri per scaffold da 48 pozzetti. Lasciare riposare il piatto o agitare delicatamente per tre o quattro minuti.Una volta per lo più sciolto, pipettare dentro e fuori delicatamente all'interno del pozzetto. Potrebbero essere necessari alcuni passaggi di pipettaggio in entrata e in uscita per dissolvere completamente lo scaffold. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri.Lavare le celle due volte con PBS. Aggiungere 12 millilitri di PBS a ciascuna provetta da centrifuga. Centrifugare a 400 g per cinque minuti.Un pellet cellulare si formerà sul fondo del tubo. Aspirare la soluzione surnatante e ripetere il lavaggio. Fare attenzione a rimuovere completamente il surnatante ad ogni lavaggio in quanto è fondamentale eliminare tutto l'EDTA.Dopo il lavaggio con PBS una seconda volta, il pellet cellulare è pronto per l'analisi. La citometria a flusso è stata utilizzata per determinare l'efficienza di trasduzione di ciascun gruppo. Le cellule non trasdotte sono state utilizzate come controllo negativo e non hanno mostrato trasduzione.Anche le cellule seminate su scaffold senza retrovirus GFP non hanno mostrato trasduzione. Il gruppo Drydux, che aveva attivato cellule seminate sugli scaffold di alginato macroporoso secco, ha mostrato una trasduzione dell'85%, appena inferiore al gruppo Retronectin. Questi risultati dimostrano che gli scaffold di Drydux trasducono efficacemente le cellule mediante trasferimento genico retrovirale senza la necessità di spinoculazione di piastre rivestite di RetroNectin.Gli scaffold Drydux mostrano un'elevata efficienza di trasduzione paragonabile a RetroNectin, fornendo un metodo alternativo per la trasduzione delle cellule T. A causa del basso costo di produzione degli scaffold Drydux, questo processo ha il potenziale per ridurre significativamente il costo delle terapie con cellule T CAR.

fabrication-use-dry-macroporous-alginate-scaffolds-for-viral

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo video dimostra la procedura di fabbricazione di microcarrier derivati da matrice extracellulare mediante elettrospraying. Questi microvettori simulano il microambiente nativo tessuto-specifico e sono stabili in modelli di coltura cellulare 3D in vitro a lungo termine.

Fabbricazione di bioscaffold mediante elettrospraying: una tecnica per generare scaffold di microcarrier derivati da matrice extracellulare di tessuto decellularizzato

L'obiettivo di questo protocollo è produrre cellule T di grado clinico specifiche per i patogeni utilizzando un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione automatizzato da banco che incorpora un sistema chiuso di cattura delle citochine e non richiede personale dedicato o l'uso di una struttura GMP. Le cellule T specifiche per il citomegalovirus pp65 generate possono essere somministrate direttamente ai pazienti.

Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

Un iniettabili impalcatura ingegneria tissutale composta da poli (N-isopropilacrilammide) solfato -graft-condroitina (PNIPAAm-g-CS) contenenti, microparticelle di alginato è stato preparato. La forza adesiva, gonfiore proprietà e in biocompatibilità vitro vengono analizzati in questo studio. Le tecniche di caratterizzazione sviluppate qui possono essere applicabili ad altri sistemi thermogelling.

Sintesi di Thermogelling poli (N-isopropilacrilammide) -graft-condroitin solfato compositi con alginato microparticelle per ingegneria dei tessuti

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare formazione del vaso sanguigno in vivo e in tempo reale in 3D impalcature da microscopia multifotonica. Angiogenesi in impalcature geneticamente è stato studiato in un modello di difetto critico calvarial murino dell'osso. Più nuovi vasi sanguigni sono stati rilevati nel gruppo di trattamento rispetto ai controlli.

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

La matrice extracellulare tessuto-specifico (ECM) è un mediatore chiave della funzione delle cellule. Questo articolo descrive metodi per sintetizzare schiume e microcarriers che sono stabili in coltura senza la necessità di reticolazione chimica per applicazioni in 3D avanzata in colture di cellule in vitro o come bioscaffolds pro-rigenerativi ECM-derivato puri.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Questo protocollo descrive una piattaforma per la realizzazione di anelli di tessuto auto-assemblati usando una muffa di plastica su misura 3D-stampato di dimensioni variabili. PDMS negativi sono curati nello stampo 3D-stampato; quindi dell'agarosi sono nel cast i negativi PDMS polimerizzati. Le cellule sono seminate nei pozzetti risultante dell'agarosi dove si aggregano in anelli di tessuto.

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

Qui, presentiamo un protocollo per in modo rapido e riproducibile generare articifical biologicamente ispirato, biodegradabile antigene che presenta le cellule (aAPC) con sintonizzabile dimensione, forma e presentazione di proteina di superficie per cellula T espansione ex vivo o in vivo .

Fabbricazione di anisotropo polimerici artificiali Antigen Presenting Cells per l'attivazione delle cellule T CD8 +

Presentato qui è un set-up biostampa tridimensionale semplice da usare, nucleo/guscio, tridimensionale per la fabbricazione in un solo passaggio di scaffold cavi, adatto per l'ingegneria tissutale di strutture vascolari e altre strutture tubolari.

Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Le barre di microgel con gruppi reattivi complementari sono prodotte tramite microfluidica con la capacità di interlegarsi in soluzione acquosa. I microgel anisometrici si inceppano e si interconnettono in costrutti stabili con pori più grandi rispetto ai sistemi basati su sferiche. Microgel modificati con GRGDS-PC formano costrutti 3D macroporosi che possono essere utilizzati per la coltura cellulare.

Scaffold 3D macroporosi interconnessi da barre di microgel

Impara a creare scaffold di alginato macroporoso secco (Drydux) per la trasduzione virale efficiente delle cellule T attivate. Questo metodo semplifica l'ingegneria genetica e offre un'alternativa economica alla spinoculazione su piastriche rivestite con RetroNectin.

Fabbricazione e utilizzo di scaffold di alginato macroporoso secco per la trasduzione virale delle cellule T

Esplora altri video