Name: Un nuovo modello di ferita della pelle ovina ex vivo ad alta produttività per testare antibiotici emergenti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri un modello di ferita cutanea ovina ex vivo per testare antimicrobici contro Staphylococcus aureus. Questo metodo riduce l'uso di animali e accelera la traduzione clinica dei trattamenti topici.

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Gli autori desiderano ringraziare EPSRC (EP/R513313/1) per il finanziamento. Gli autori desiderano anche ringraziare R.B Elliot e Son Abattoir a Calow, Chesterfield, per aver fornito teste di agnelli e per essere stati così accomodanti nelle prime fasi del progetto, Kasia Emery per il suo supporto durante lo sviluppo di questo protocollo e Fiona Wright del Dipartimento di infezione, immunità e malattie cardiovascolari dell'Università di Sheffield per l'elaborazione dei campioni istologici e per essere stata così incredibilmente utile durante questo progetto.

Le teste di agnello del macello R.B Elliott and Son sono state utilizzate come fonte di campioni di pelle in questo progetto. Tutti gli agnelli venivano macellati per il consumo come cibo. Invece di scartare le teste, queste sono state riproposte per la ricerca. L'approvazione etica non era richiesta in quanto il tessuto proveniva da rifiuti scartati dai macelli.
1. Sterilizzazione
<ol><li>Disinfettare le pinze prima della raccolta delle teste prendendo una pinza pulita ed eseguendo la sterilizzazione a calore secco in un forno a 200 °C per 1 ora. Autoclavare tutti i bicchieri a 121 °C per 15 minuti prima dell'uso.</li>
	<li>Eseguire tutto il lavoro descritto all'interno di un armadio di classe 2 di microbiologia. Preparare tutti i reagenti secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>2. Raccolta dei campioni
<ol><li>Nel mattatoio, gli agnelli di Swaledale venivano macellati mediante stordimento usando l'elettricità o una pistola prigioniera ed essanguati. Raccogliere le teste di agnello non più di 4 ore dopo la macellazione.</li>
</ol>3. Preparazione delle teste
<ol><li>Disinfettare la sezione frontale dell'agnello versando circa 100 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm sull'area del campione. Rasare la sezione frontale della testa con tagliatrici elettriche e lavare l'area con 200 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm.</li>
	<li>Pulire l'area con etanolo e rotolo blu e coprire l'area del campione con crema depilatoria per 35 minuti. Raschiare delicatamente la crema depilatoria utilizzando uno strumento raschiante e valutare l'area del campione. Se rimane una quantità significativa di peli, ripetere il processo di depilazione.</li>
	<li>Utilizzare altri 200 ml di soluzione di biossido di cloro per risciacquare l'area, quindi risciacquare con etanolo e pulire con un rotolo blu.</li>
	<li>Utilizzando un punch bioptico sterile da 8 mm, ritagliare campioni di pelle da 8 mm dall'area preparata. Rimuovere i campioni utilizzando una pinza sterile e un bisturi a 15 lame, assicurando che tutto il grasso cutaneo venga rimosso.</li>
	<li>Mettere i campioni in un barattolo sterile da 0,5 L riempito con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), quindi trasferirli in provette sterili da 50 ml con 50 ml di soluzione di biossido di cloro da 200 ppm, capovolgere due volte e lasciare sterilizzare per 30 minuti.</li>
	<li>Rimuovere i campioni dalla soluzione di biossido di cloro e lavarli mettendoli in una provetta da 50 mL riempita con 40 mL di PBS sterile. Una volta lavato, posizionare ogni singolo campione di pelle in un pozzetto separato di una piastra da 24 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 350 μL di mezzo preriscaldato mantenendo il campione all'interfaccia aria-liquido. La composizione dei terreni è la seguente: terreni MK (Medium 199 con sali di Hanks, L-glutammato e 1,75 mg/mL di bicarbonato di sodio) e F12 di Ham in rapporto 1:1, con aggiunta di FBS (10% v/v), EGF (10 ng/mL), insulina (5 μg/mL), penicillina-streptomicina (100 U/mL) e amfotericina B (2,5 μg/mL).</li>
	<li>Sigillare le piastre a 24 pozzetti con una guarnizione a piastre permeabile ai gas e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 per un massimo di 24 ore.</li>
</ol>4. Mantenimento dei campioni di pelle
<ol><li>Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare i campioni in 500 μL di PBS sterile. Aggiungere terreni privi di antibiotici a ciascun campione e incubare a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 per 24 ore per rimuovere gli antibiotici residui nel campione.</li>
	<li>Se la torbidità o l'infezione fungina si sviluppano nei mezzi privi di antibiotici dopo 24 ore, scartare il campione.</li>
</ol>5. Preparazione dell'inoculo
<ol><li>Preparare un tubo da 50 ml con 10 ml di brodo di soia triptico sterile. Prendi un piatto di agar fresco di S. aureus e usa un tampone per trasferire diverse colonie nel brodo. Incubare per 18 h a 37 °C a 150 giri/min.</li>
	<li>Centrifugare a 4.000 x g per 3 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di PBS sterile. Ripetere due volte per garantire un adeguato lavaggio delle cellule.</li>
	<li>Regolare l'inoculo a 0,6 OD600 in PBS sterile. Confermare il carico dell'inoculo eseguendo un conteggio manuale delle piastre vitali.</li>
</ol>6. Infezione di campioni di pelle
<ol><li>Preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con 400 μL di terreno privo di antibiotici preriscaldato e aggiungere gli inserti a 24 pozzetti usando una pinza sterile.</li>
	<li>Rimuovere il terreno dai campioni di pelle, lavare con 500 μL di PBS sterile e rimuovere il lavaggio. Utilizzare una pinza sterile per tenere delicatamente il campione sul fondo del pozzetto.</li>
	<li>Utilizzare una biopsia di 4 mm per creare un lembo centrale della ferita, perforando fino a una profondità approssimativa di 1-2 mm. Quindi, utilizzare un bisturi a 15 lame e una pinza sterile dentata in tessuto allis per rimuovere lo strato superiore del lembo della ferita. La variabilità delle dimensioni della ferita può influenzare l'esito dell'infezione e le unità formanti colonie endpoint (CFU).</li>
	<li>Una volta che tutti i campioni sono stati feriti, trasferirli negli inserti a 24 pozzetti usando una pinza sterile. Pipettare 15 μL dell'inoculo batterico nel letto della ferita. Quindi, incubare per 24 ore a 37 °C in un incubatore tissutale umidificato al 5% di CO2 .</li>
	<li>Se sono necessari periodi di incubazione più lunghi, rimuovere il terreno e sostituirlo con terreno fresco ogni 24 ore e incubare nelle stesse condizioni.</li>
</ol>7. Determinazione della carica batterica
<ol><li>Rimuovere il supporto dal fondo dei pozzi. Con una pinza sterile, trasferire ciascun campione in una provetta separata da 50 ml riempita con 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Utilizzare un omogeneizzatore a punta fine per omogeneizzare la superficie del campione. Fare attenzione a garantire che il letto della ferita sia a diretto contatto con la punta dell'omogeneizzatore.</li>
	<li>Omogeneizzare ogni campione per 35 s su medio/alto. L'omogeneizzatore stacca i batteri dalla superficie del letto della ferita per consentire l'enumerazione della carica batterica.</li>
	<li>Una volta elaborati tutti i campioni, eseguire a turno il pipettaggio di ciascun campione, a turno. Questo per garantire che l'omogenato batterico sia miscelato.</li>
	<li>Pipettare 20 μL di omogenato a vortice nel pozzetto corrispondente di una piastra da 96 pozzetti contenente 180 μL di PBS sterile.</li>
	<li>Diluire in serie ciascun omogenato di campione a 1 x 10−7 e pipettare 10 μL di omogenato diluito su una piastra triplice di agar di soia triplice.</li>
	<li>Incubare la piastra di agar per 18 ore a 37 °C. Quindi, contare il numero di colonie per determinare il CFU per ciascun campione.</li>
</ol>

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<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Lo sviluppo di antimicrobici è un'impresa importante ma costosa che si stima costi circa 1 miliardo di dollari e richieda circa 15 anni per essere completata. Oltre il 90% della scoperta di farmaci antimicrobici e degli studi preclinici sull'efficacia dei farmaci antimicrobici sono condotti da ricercatori accademici e piccole e medie imprese con in genere meno di 50 dipendenti22. Questi team sono molto vincolati finanziariamente, il che rende disastroso il fallimento delle molecole guida nelle fas...

Le infezioni della pelle sono un importante problema globale, con grandi costi economici per gli operatori sanitari di tutto il mondo. Lo sviluppo della resistenza multifarmaco e la formazione di biofilm da parte di agenti patogeni gioca un ruolo chiave nella prevalenza di ferite non cicatrizzanti 1,2,3,4. Di conseguenza, le infezioni della pelle e dei tessuti molli sono uno dei motivi più comuni per il ricovero prolungato e la successiva riammissione5. I ritardi nella guarigione delle ferite sono costosi sia per il paziente che per gli operatori sanitari, con alcune stime che suggeriscono che circa 6,5 milioni di pazienti sono colpiti ogni anno negli Stati Uniti. Nel Regno Unito, le infezioni della pelle e le complicanze associate provocano circa 75.000 decessi all'anno 2,4,6.
Lo Staphylococcus aureus (S. aureus) è un formidabile patogeno della ferita spesso isolato dalle ferite del paziente 2,7. Il tasso di comparsa della resistenza multifarmaco è aumentato drasticamente negli anni 2000. Durante questo periodo, circa il 60% delle infezioni batteriche acute della pelle e della struttura della pelle erano positive alla coltura per S. aureus 1 resistente alla meticillina. Il crescente numero di ceppi multiresistenti tra gli stafilococchi e altri agenti patogeni negli ultimi 2 decenni indica un urgente bisogno di un rapido sviluppo di antibiotici con nuove modalità di azione in grado di superare la resistenza.
Tuttavia, dai primi anni 2000, i programmi di scoperta degli antibiotici sono stati dominati da tempi di sviluppo più lunghi e bassi tassi di successo, con solo il 17% dei nuovi antibiotici che entrano negli studi clinici negli Stati Uniti ottenendo l'approvazione del mercato8. Ciò suggerisce una disparità tra i risultati dei test in vitro sugli antibiotici emergenti e i loro risultati clinici. Si può sostenere che questa disparità è in gran parte dovuta alle differenze nella fisiologia batterica durante le infezioni in vivo e durante i metodi microbiologici convenzionali quando si verifica l'efficacia degli antibiotici nelle fasi precliniche in vitro . Pertanto, sono necessari nuovi metodi di laboratorio che siano più rappresentativi della fisiologia batterica durante l'infezione per migliorare le percentuali di successo nei programmi di scoperta di antibiotici.
I metodi attuali per studiare le infezioni cutanee includono studi su animali vivi (ad esempio, topi), modelli cutanei ex vivo (ad esempio, suini) e modelli cutanei 3D di ingegneria tissutale (ad esempio, umano)9,10,11,12. Gli studi su animali vivi sono strettamente regolamentati e hanno una produttività relativamente bassa. Nei modelli animali, ferite e infezioni causano disagio significativo agli animali e sollevano preoccupazioni etiche. I modelli di pelle umana, ex vivo o di ingegneria tissutale, richiedono l'approvazione etica, la conformità alla legislazione locale e globale (la legge sui tessuti umani, la dichiarazione di Helsinki) e vi è difficoltà nell'acquisizione di tessuti, con alcune richieste che richiedono anni per soddisfare13,14. Entrambi i tipi di modello sono ad alta intensità di manodopera e richiedono competenze significative per garantire il successo sperimentale. Alcuni attuali modelli di infezione cutanea ex vivo richiedono dischi pre-inoculati e additivi per il letto della ferita per consentire l'infezione; Sebbene questi modelli siano incredibilmente utili, ci sono limitazioni nel processo di infezione in quanto gli additivi limitano l'utilizzo del letto della ferita come fonte di nutrienti10,15,16,17. Il modello descritto in questo studio non utilizza additivi per il letto della ferita, il che garantisce che la patologia dell'infezione e la conta delle cellule vitali siano il risultato dell'utilizzo diretto del letto della ferita come unica fonte di nutrienti.
Data la necessità di nuovi metodi di laboratorio, è stato sviluppato un nuovo modello ex vivo di infezioni cutanee ovine, ad alto rendimento, da utilizzare nella valutazione dell'efficacia degli antibiotici emergenti. Gli studi sulle infezioni della pelle affrontano molte sfide: costi elevati, preoccupazioni etiche e modelli che non mostrano un quadro completo20,21. I modelli ex vivo e i modelli di espianto 3D consentono una migliore visualizzazione del processo patologico e dell'impatto che i trattamenti possono avere da un modello clinicamente più rilevante. Qui viene descritta la configurazione di un nuovo modello di pelle ovina, che è semplice, riproducibile e clinicamente rilevante e ha un alto rendimento. La pelle ovina è stata scelta poiché le pecore sono uno dei grandi mammiferi comunemente usati per modellare le risposte alle infezioni in vivo. Inoltre, sono facilmente reperibili dai macelli, garantendo una fornitura costante di pelle per la ricerca, e le loro carcasse non sono scottate, garantendo una buona qualità dei tessuti. Questo studio ha utilizzato S. aureus come patogeno esemplare; Tuttavia, il modello funziona bene con altri microrganismi.

<table><tbody><tr><td>Piastra di accompagnamento a 24 pozzetti</td><td>SLS&nbsp;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>Punzone per biopsia da 4 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 50 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>Punzone per biopsia da 8 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di amfotericina B, sterile</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Tagliacapelli senza fili Colour Pro Style</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td><td>Tagliacapelli Incubatore</td></tr><tr><td>a doppio forno</td><td>SLS</td><td>OVe1020</td><td>Forno sterilizzante</td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico&nbsp;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N4888</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Fisher Scientific</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet</td><td>Non applicabile</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp;</td><td>Incubatore per coltura tissutale</td></tr><tr>Omogeneizzatore <td>per centrifuga</td> <td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td></tr><tr><td>220,</td> omogeneizzatore portatile <td>Fisher Scientific</td><td>15575809</td><td></td></tr><tr><td>220, coni di miscelazione in plastica</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>Inserto Individuale 24 pozzetti 0,4um</td> membrana <td>VWR International</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Insulina, ricombinante Umano</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Terreno 199 (MK media)</td><td>Sigma</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra, coltura cellulare Costar 96 pozzetti</td><td>Fisher</td><td>Scientific 10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>Non applicabile</td><td>Incubatore batterico</td></tr><tr><td>Compresse PBS</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>SLS&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni per piastre</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Safe 2020</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td><td>Cabina di sicurezza per microbiologia di classe II</td></tr><tr><td>Lama per bisturi numero 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi Swann Morton</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti Allis dentate</td><td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Soia triptica Agar</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di soia triptico</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba Compresse</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

un nuovo modello di ferita della pelle ovina ex vivo ad alta produttività per testare antibiotici emergenti

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Lo sviluppo di antimicrobici è un processo costoso con tassi di successo sempre più bassi, il che rende meno attraenti ulteriori investimenti nella ricerca sulla scoperta di antimicrobici. La scoperta di farmaci antimicrobici e la successiva commercializzazione possono essere rese più redditizie se un approccio fail-fast-and-fail-cheap può essere implementato all'interno delle fasi di ottimizzazione del piombo in cui i ricercatori hanno un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci. In questo articolo, viene descritta la configurazione di un modello di pelle ferita ovina ex vivo infettata da Staphylococcus aureus, che è semplice, economica, ad alta produttività e riproducibile. La fisiologia batterica nel modello imita che durante l'infezione come proliferazione batterica dipende dalla capacità del patogeno di danneggiare il tessuto. L'instaurazione dell'infezione della ferita è verificata da un aumento della conta batterica vitale rispetto all'inoculo. Questo modello può essere utilizzato come piattaforma per testare l'efficacia degli antimicrobici emergenti nella fase di ottimizzazione del piombo. Si può sostenere che la disponibilità di questo modello fornirà ai ricercatori che sviluppano antimicrobici un modello fail-fast-and-fail-cheap, che contribuirà ad aumentare i tassi di successo nelle successive sperimentazioni sugli animali. Il modello faciliterà inoltre la riduzione e il perfezionamento dell'uso animale per la ricerca e, in ultima analisi, consentirà una traduzione più rapida ed economica di nuovi antimicrobici per le infezioni della pelle e dei tessuti molli in clinica.

L'identificazione di un percorso per sterilizzare la pelle prima di impostare il modello di infezione della ferita è stata impegnativa. La sfida consisteva nel sterilizzare la pelle senza danneggiare i diversi strati cutanei, che possono quindi avere conseguenze indesiderate nell'esito dell'infezione. Per identificare un regime di sterilizzazione appropriato, sono stati provati diversi trattamenti per periodi di tempo variabili, come indicato nella Tabella 1. La contaminazione è stata registrata come lo ...

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per impostare un modello di pelle ferita ovina ex vivo infettata da Staphylococcus aureus. Questo modello ad alto rendimento simula meglio le infezioni in vivo rispetto alle tecniche di microbiologia convenzionali e presenta ai ricercatori una piattaforma fisiologicamente rilevante per testare l'efficacia degli antimicrobici emergenti.

Un nuovo modello di ferita della pelle ovina ex vivo ad alta produttività per testare antibiotici emergenti

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Questo modello consentirà ai ricercatori nelle fasi precliniche critiche di determinare con maggiore precisione l'efficacia antimicrobica delle nuove formulazioni e offre ai ricercatori un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci. Questo modello consente risultati rapidamente riproducibili in un ambiente di ferita rappresentativo. Riduce la necessità di animali allevati appositamente e facilita la traduzione più rapida degli antimicrobici topici per le infezioni delle ferite in clinica.Le sfide principali sono la contaminazione e la destrezza. Una rigorosa tecnica asettica e pazienza con la lavorazione dei tessuti sono essenziali; per il successo di questo metodo è necessaria una rimozione precisa e mirata del lembo. Inizia con la disinfezione delle pinze esponendoli alla sterilizzazione a calore secco a 200 gradi Celsius per un'ora.Autoclavare tutti i bicchieri a 121 gradi Celsius per 15 minuti prima dell'uso. Disinfettare la sezione frontale della lampada versando circa 100 millilitri di soluzione di biossido di cloro da 200 PPM sull'area del campione. Rasare la sezione della fronte con tagliatrici elettriche, seguita da un lavaggio con 200 millilitri di soluzione di biossido di cloro da 200 PPM.Pulire l'area con etanolo e un rotolo blu e coprire l'area del campione con una crema depilatoria. Dopo 35 minuti, raschiare delicatamente la crema depilatoria utilizzando uno strumento raschiante e valutare l'area del campione. Ripetere il processo di depilazione se rimane una quantità significativa di peli.Risciacquare l'area del campione pulita con 200 millilitri di soluzione di biossido di cloro seguita da etanolo e un rotolo blu. Utilizzare un pugno sterile da otto millimetri per biopsia per ritagliare un campione di pelle di otto millimetri dall'area preparata. Quindi rimuovere il campione utilizzando una pinza sterile e un bisturi a lama numero 15, assicurandosi che tutto il grasso cutaneo venga rimosso.Mettere i campioni in un barattolo sterile da 0,5 litri riempito con PBS sterile. Quindi trasferirli in tubi sterili da 50 millilitri riempiti con 50 millilitri di soluzione di biossido di cloro da 200 PPM. Capovolgere il tubo due volte e lasciarlo sterilizzare per 30 minuti.Trasferire i campioni in una provetta da 50 millilitri riempita con 40 millilitri di PBS sterile. Dopo il lavaggio PBS, posizionare ciascun campione di pelle in un pozzetto separato di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 350 microlitri del mezzo preriscaldato in un pozzetto, mantenendo il campione all'interfaccia aria-liquido.Sigillare le piastre a 24 pozzetti con una guarnizione a piastra permeabile al gas prima di posizionare la piastra per l'incubazione in un incubatore di tessuto umidificato al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare i campioni in 500 microlitri di PBS sterile. Rimuovere gli antibiotici residui dal campione trattandoli con terreni privi di antibiotici al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius per 24 ore.Se la torbidità o l'infezione fungina si sviluppa nei mezzi privi di antibiotici, scartare il campione. Quindi, preparare un tubo da 50 millilitri con 10 millilitri di brodo di soia tripttico sterile. Quindi trasferire diverse colonie di Staphylococcus aureus da una piastra di agar fresco di S.aureus al brodo e incubare il tubo a 37 gradi Celsius e 150 RPM per 18 ore.Dopo aver centrifugato i tubi a 4.000 G per tre minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di PBS sterile. Ripetere il lavaggio PBS due volte prima di regolare l'inoculo a 0,6 densità ottica a lunghezze d'onda di 600 nanometri utilizzando PBS sterile. Confermare il carico dell'inoculo mediante un conteggio manuale delle piastre.Per infettare il campione di pelle, preparare una piastra fresca a 24 pozzetti con 400 microlitri di mezzi privi di antibiotici preriscaldati e aggiungere i 24 inserti del pozzetto usando una pinza sterile. Rimuovere il supporto dai campioni di pelle. Lavarli con 500 microlitri di PBS sterile e rimuovere il lavaggio.Utilizzare una pinza sterile per tenere delicatamente il campione sul fondo del pozzetto. Utilizzare una biopsia di perforazione di quattro millimetri per perforare il campione di pelle a una profondità approssimativa di uno o due millimetri e creare un lembo centrale della ferita. Quindi utilizzare un bisturi a lama numero 15 e una pinza di tessuto Allis dai denti sterili per rimuovere lo strato superiore del lembo della ferita.Una volta che tutti i campioni sono stati feriti, trasferirli nei 24 inserti del pozzetto usando una pinza sterile. Pipettare 15 microlitri di inoculo batterico nel letto della ferita prima di incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore di tessuto umidificato. Per periodi di incubazione più lunghi, rimuovere il supporto, sostituirlo con terreni freschi ogni 24 ore e incubare le piastre nelle stesse condizioni.Per determinare la carica batterica, rimuovere il mezzo dal fondo dei pozzetti. E usando una pinza sterile, trasferire ogni campione in un tubo separato da 50 millilitri riempito con un millilitro di PBS sterile. Quindi staccare i batteri dalla superficie del letto della ferita omogeneizzando la superficie del campione con un omogeneizzatore a punta fine.Assicurarsi che il letto della ferita sia a diretto contatto con la punta dell'omogeneizzatore. Una volta elaborati tutti i campioni, vortice ogni campione prima di trasferire 20 microlitri di omogenato nel pozzetto corrispondente di una piastra a 96 pozzetti contenente 180 microlitri di PBS sterile. Diluire in serie ogni omogenato di campione a 1 volte 10 fino al negativo 7 e pipettare 10 microlitri di omogenato diluito su una piastra di Agar di soia triplice in triplice copia.Incubare la piastra di Agar di soia triptica a 37 gradi Celsius e, dopo 18 ore, contare il numero di colonie per determinare le unità formanti colonie o CFU per ciascun campione. È stato identificato un adeguato regime di sterilizzazione della pelle utilizzando diversi trattamenti per periodi di tempo variabili. L'integrità dei tessuti è stata monitorata mediante istologia, seguita da colorazione con ematossilina ed eosina immediatamente dopo il trattamento.Un trattamento di 30 minuti con biossido di cloro è stato il trattamento più efficace, con sterilizzazione riproducibile del tessuto cutaneo preservando l'integrità del tessuto. Una pellicola bianca nel letto della ferita era evidente sul tessuto 48 ore dopo l'infezione. Sebbene il modello scratch ospitasse un numero medio più elevato di CFU dopo 24 ore, la tecnica di rimozione del lembo ha prodotto risultati più coerenti.Dopo 48 ore, circa 100 volte più CFU batteriche sono state recuperate dal tessuto ferito rispetto all'inoculo, indicando un'infezione riuscita. Le sezioni istologiche colorate di Gram del tessuto infetto indicavano la presenza di cellule S.aureus nel letto della ferita, che era assente nelle sezioni di tessuto non infetto. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire l'immunoistochimica per studiare la risposta tissutale, la colorazione di gram modificata per visualizzare la localizzazione batterica e la conta delle piastre vitali dopo l'esposizione antimicrobica per testare l'efficacia antimicrobica.Per i ricercatori che sviluppano nuovi antimicrobici, questo modello fornirà un maggiore controllo dell'ottimizzazione del piombo, ridurrà la dipendenza da sperimentazioni costose e strettamente regolamentate sugli animali e consentirà la rapida traduzione degli antimicrobici nella clinica.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: de Vries, C. R., et.al. Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica della ferita da Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Esp. (2020)Questo video mostra l'inoculazione ritardata di Pseudomonas aeruginosa luminosa in un topo con due ferite dorsali a spessore totale coperte da una medicazione trasparente. Questo facilita la formazione di biofilm e l'instaurazione di infezioni croniche. Il monitoraggio regolare della bioluminescenza consente la quantificazione del carico...

Sviluppo di un modello topino di infezione cutanea cronica da Pseudomonas aeruginosa 

Questo video descrive un protocollo per impostare un modello ex vivo per la cheratite batterica utilizzando un bottone corneosclerale sezionato dall'occhio suino. I batteri inoculati attraversano le incisioni epiteliali corneali per invadere lo stroma sottostante e stabilire un'infezione all'interno dei tessuti corneali che imita l'infezione in vivo.

Modello di cornea suina ex vivo di cheratite batterica: una tecnica per stabilire l'infezione batterica nelle cellule epiteliali corneali

Questo video mostra una tecnica per generare un modello murino di infezione della ferita cutanea. Dopo aver infettato i topi, ingegnerizzati per esprimere una proteina fluorescente nei neutrofili, con uno Staphylococcus aureus bioluminescente geneticamente modificato, un batterio patogeno. La carica batterica nel sito di infezione e le dinamiche di reclutamento dei neutrofili possono essere studiate utilizzando l'imaging dell'intero animale.

Un modello di infezione da ferita cutanea murina per studiare la risposta immunitaria contro un patogeno batterico

Il video dimostra la generazione di un modello di pelle ovina ex vivo infettato da Staphylococcus aureus. Ciò comporta il trattamento della sezione bioptica cutanea della fronte di un agnello con antibiotici, la creazione di un letto della ferita, il posizionamento su una membrana permeabile in una piastra multipozzetto con terreno privo di antibiotici e l'instaurazione di un'infezione batterica nella ferita cutanea.

Generazione di un modello di pelle ovina ferita ex vivo infettato da un patogeno batterico

Qui descriviamo un nuovo modello murino diabetico utilizzando topi glabri per il monitoraggio in tempo reale, non invasiva, di infezioni di ferita di biofilm di bioluminescenti Pseudomonas aeruginosa. Questo metodo può essere adattato ad infezione di altre specie di batteri e microrganismi geneticamente modificati, inclusi i biofilm multi-specie, di valutare e testare l'efficacia delle strategie di antibiofilm.

Vieni nel lato di luce: In Vivo monitoraggio di Pseudomonas aeruginosa Biofilm infezioni nelle ferite croniche in un modello murino Hairless diabetico

Un protocollo per un ex vivo modello di cultura di organo corneale utile per studi di guarigione della ferita è descritto. Questo sistema modello può essere utilizzato per valutare gli effetti degli agenti per promuovere la guarigione rigenerativa o tossicità della droga in un ambiente organizzato di pluricellulare 3D.

Ex Vivo modello di cultura di organo corneale per la guarigione delle ferite studi

Qui vengono descritti due modelli di guarigione delle ferite murine, uno progettato per valutare le risposte di guarigione della ferita cellulare e citochina e l'altro per quantificare il tasso di chiusura della ferita. Questi metodi possono essere utilizzati con modelli di malattia complessi come il diabete per determinare i meccanismi di vari aspetti della scarsa guarigione delle ferite.

Valutazione della guarigione acuta delle ferite utilizzando l'impianto di spugna alcolica sottocutaneo dorsale e modelli di ferite cutanee della coda excisionali.

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

Qui dimostriamo una tecnica ottimizzata per valutare la riparazione delle ferite utilizzando la pelle umana ex vivo combinata con un approccio di colorazione a montaggio intero. Questa metodologia fornisce una piattaforma pre-clinica per la valutazione di potenziali terapie delle ferite.

Modello di ferita umana ex vivo e approccio di colorazione a montaggio intero per valutare con precisione la riparazione della pelle

Le ferite croniche resistenti agli antibiotici rappresentano una grave minaccia per il sistema sanitario. Le infezioni da biofilm sono ostinate e ostili e possono causare una chiusura funzionale carente della ferita. Riportiamo un modello suino clinicamente rilevante di ferite croniche a tutto spessore infette da biofilm. Questo modello è potente sia per gli studi meccanicistici che per testare gli interventi.

Modello suino di infezione da biofilm e ferite invisibili

Un dispositivo LED a luce blu da 405 nm dimostra efficacia antimicrobica contro un'ampia gamma di patogeni della ferita quando valutato su un modello cutaneo sintetico a base di collagene. Questo approccio semplificato in vitro offre un'alternativa riproducibile ed eticamente valida per la valutazione nelle fasi iniziali delle terapie antimicrobiche basate sulla luce.

Indagine di un dispositivo LED a luce blu per sopprimere patogeni delle ferite utilizzando un modello cutaneo sintetico a base di collagene

Scopri un modello di ferita cutanea ovina ex vivo per testare antimicrobici contro Staphylococcus aureus. Questo metodo riduce l'uso di animali e accelera la traduzione clinica dei trattamenti topici.

Un nuovo modello di ferita della pelle ovina ex vivo ad alta produttività per testare antibiotici emergenti

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