Name: Isolamento delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi dalle ossa di ratto mediante metodo di aderenza secondaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: Scopri il metodo di adesione secondaria per isolare cellule BMM dal midollo osseo di ratti SD. Questa tecnica consente l'estrazione efficiente e la differenziazione in osteoclasti per studi sull'osteoporosi.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (sovvenzione n. LY19H060001) e il Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (n. 2022ZB093).

Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati condotti in conformità con le linee guida per gli esperimenti sugli animali del Centro di ricerca sugli animali da laboratorio dell'Università medica cinese di Zhejiang (numero di approvazione: IACUC-20181029-11).
1. Estrazione cellulare
<ol><li>Metti i ratti Sprague-Dawley (ratti SD, 1-10 giorni, maschio o femmina) nelle gabbie di eutanasia riempite con CO2 ad un tasso equilibrato del 30% -70% volume contenitore / minuto. Dopo che i ratti perdono conoscenza (20-60 min), eutanasizzare il ratto per lussazione cervicale per garantire una morte indolore.</li>
	<li>Immergere i ratti in alcool al 75% per 10 minuti per la disinfezione.</li>
	<li>Rimuovere con cura tutti gli arti del ratto con forbici e pinze, aspirare con PBS usando una pipetta e lavare il sangue aderente agli arti.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di soluzione di penicillina/streptomicina in 500 mL di DMEM e mescolare bene. Prendere un tubo di centrifuga sterile da 50 mL, aggiungere 5 mL di FBS e 45 mL di mezzo DMEM e mescolare accuratamente per ottenere una soluzione di DMEM FBS al 10% contenente l'1% di penicillina/streptomicina. Aggiungere 2 mL del terreno di coltura di cui sopra in un tubo da 5 mL.</li>
	<li>Trasferire le ossa degli arti nel tubo da 5 ml. Utilizzare le forbici per tagliare le ossa degli arti nel tubo in piccoli pezzi (1-3 mm) e mescolare l'omogeneizzato per risospendere le cellule del midollo osseo nel terreno di coltura. Riposare per 5 minuti fino a quando i frammenti di tessuto si sono depositati sul fondo del tubo.</li>
	<li>Aggiungere 10 ml di DMEM FBS al 10% in una piastra di coltura da 100 mm, quindi trasferire il surnatante nel piatto di coltura. Quando si aspira il surnatante, evitare di trasferire i detriti tissutali nel piatto di coltura.</li>
	<li>Incubare a 37 °C e 5% CO2 per circa 24 ore. Dopo questo tempo di incubazione, la maggior parte delle cellule staminali mesenchimali aderirà alla parete del piatto di coltura e crescerà lentamente, mentre la maggior parte dei BBM sarà ancora sospesa nel terreno di coltura.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare nella piastra di coltura da 100 mm in un nuovo matraccio da25 cm 2 e continuare a coltivare le cellule a 37 °C e al 5% di CO2 per ulteriori 24 ore. I BMM aderiranno alla parete del pallone a 24-48 ore di coltura. Rimuovere con cura il vecchio mezzo e sostituirlo con un mezzo fresco dopo che i BBM hanno aderito alla parete del pallone.</li>
	<li>Sottocoltura quando le cellule nel pallone hanno raggiunto l'80% -90% di confluenza. NOTA: Tutte le cellule sono state coltivate a 37 °C e al 5% di CO2. Durante la coltura, la morfologia cellulare è stata gradualmente unificata. Le cellule erano grandi, di forma irregolare, crescevano radialmente e attaccate al pallone in una forma di disco, dove si potevano osservare più nuclei.</li>
</ol>2. Colorazione FACS della cellula
<ol><li>La tripsina digerisce utilizzando 1-2 mL di tripsina commerciale a 37 °C e 5% di CO2 per 5 minuti e conta le cellule aderenti secondarie per garantire un conteggio finale delle cellule di 100.000/campione (conta delle cellule con emocitometro Neubauer).</li>
	<li>Dividere le cellule in tre gruppi (500 μL di PBS contiene 100.000 celle): (1) il gruppo di controllo vuoto contenente cellule non macchiate; (2) il gruppo di controllo dell'isotipo; e (3) il gruppo sperimentale (colorazione CD11b/c).</li>
	<li>Incubare gli anticorpi primari (nessun anticorpo per il gruppo di controllo in bianco; controllo dell'isotipo anti-CD11 per il gruppo di controllo dell'isotipo, 0,6 μL di anticorpo/campione, 1 μg/campione; anti-CD11b/c per il gruppo sperimentale, 1 μL di anticorpo/campione, 1 μg/campione) sul ghiaccio per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare a 300-350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospescere le cellule con 500 μL di PBS. Ripetere la procedura di cui sopra una volta per assicurarsi che gli anticorpi primari non legati vengano lavati via.</li>
	<li>Incubare l'anticorpo secondario corrispondente (nessun anticorpo per il gruppo di controllo in bianco; IgG anti-coniglio di capra per il controllo dell'isotipo e i gruppi sperimentali, anticorpo/campione da 0,25 μL, 1:2.000) sul ghiaccio al buio per 30 min.</li>
	<li>Centrifugare a 300-350 x g per 5 minuti, scartare il surnatante e risospescere le cellule con 500 μL di PBS. Ripetere la procedura di cui sopra una volta per assicurarsi che i secondi anticorpi non legati vengano lavati via.</li>
	<li>Rileva le cellule CD11b/c positive mediante citometria a flusso (10.000 cellule/campione) e analizza i dati tramite software (ad esempio, FlowJo 7.5). NOTA: Per ottenere la percentuale finale di cellule CD11b/c+, è stata utilizzata la seguente formula: Percentuale di cellule CD11b /c+ nel gruppo sperimentale - la percentuale di cellule CD11+ nel gruppo di controllo isotipo.</li>
</ol>3. Colorazione Wright-Giemsa
<ol><li>Seminare le cellule secondarie aderenti che sono state passate tre volte su fogli rampicantia 2 cellule da 35 mm (1 × 106 cellule/pozzetto) e coltivare a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.</li>
	<li>Scartare il terreno di coltura e lavare tre volte con PBS.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione colorante Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) al foglio di arrampicata cellulare per 1 min.</li>
	<li>Mescolare il colorante con acqua distillata (0,5 ml-0,8 ml) con un batuffolo di cotone e riposare per 10 minuti.</li>
	<li>Lavare la soluzione colorante con acqua distillata e quindi asciugare per 1-3 minuti. Osservare al microscopio.</li>
</ol>4. Colorazione TRAP
<ol><li>Seminare le cellule secondarie aderenti che sono state passate tre volte su fogli rampicantia 2 cellule da 35 mm (1 × 106 cellule/pozzetto) e coltivare a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore.</li>
	<li>Sostituire il vecchio mezzo con il 10% FBS DMEM o osteoclast induction medium integrato con 50 ng/mL attivatore del recettore del ligando nucleare fattore-κB (RANKL) e 30 ng/mL del fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF), e coltura a 37 °C e 5% CO2 per altri 7 giorni.</li>
	<li>Macchiare le cellule con il kit di colorazione TRAP secondo il protocollo del produttore e osservarle al microscopio. NOTA: le cellule TRAP-positive sono state definite osteoclasti, che erano viola al microscopio ottico. Il numero di cellule TRAP-positive è stato misurato utilizzando il software ImageJ.</li>
</ol>5. Macchia occidentale
<ol><li>Seminare le cellule secondarie aderenti che sono state passate tre volte su fogli rampicantia 2 cellule da 35 mm (1 × 106 cellule / pozzetto) e coltivare per 24 ore.</li>
	<li>Sostituire il vecchio mezzo con dmEM FBS fresco al 10% o mezzo di induzione osteoclasto (50 ng/mL di RANKL e 30 ng/mL di M-CSF) e la coltura per altri 7 giorni a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Estrarre proteine cellulari totali con tampone RIPA, separate dal 10% SDS-PAGE, e trasferirle alle membrane di polivinilidene fluoruro 18,19.</li>
	<li>Bloccare con polvere scremata al 5% (25 mL) per 2 ore e lavare tre volte, per 10 minuti ogni volta, con TBS-Tween 20 (TBST).</li>
	<li>Incubare gli anticorpi primari a 4 °C durante la notte (anti-β-actina, anti-TRAP e anti-catepsina K; tutti gli anticorpi primari sono stati diluiti 1:1.000, 10 mL di anticorpo/banda diluita) e lavare tre volte con TBST.</li>
	<li>Incubare l'anticorpo secondario (IgG anti-coniglio di capra, diluizione 1:2.000, 10 ml di anticorpo/banda diluita) a temperatura ambiente per 2 ore e lavare tre volte con TBST. Visualizza le bande proteiche utilizzando una soluzione in via di sviluppo. NOTA: I livelli di espressione delle proteine di cui sopra sono stati normalizzati a β-actina.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Gli osteoclasti sono uno dei tipi di cellule più significativi coinvolti nell'insorgenza e nello sviluppo di malattie ossee, nonché uno degli oggetti primari della ricerca sulle malattie ossee20. Monociti / macrofagi possono differenziarsi in osteoclasti. Poiché i macrofagi mononucleati (cellule RAW264.7) sono troppo costosi da acquistare e si attivano facilmente durante la coltura, è difficile eseguire esperimenti di differenziazione in vitro utilizzando questa linea cellulare. Sebbene s...

È stato riportato che le cellule di lignaggio monociti-macrofagi esistenti nel midollo osseo possono differenziarsi in monociti del sangue e macrofagi tissutali 1,2. Le cellule di cui sopra, che possono differenziarsi in osteoclasti per bilanciare la crescita e lo sviluppo osseo, sono comunemente usate come modello cellulare per indurre osteoclasti in vivo 3,4. Il midollo osseo è un tessuto speciale contenente diversi tipi di cellule, che includono, ma non sono solo limitate alle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo, alle cellule monociti-macrofagi del midollo osseo (BMM), alle cellule staminali ematopoietiche, alle cellule endoteliali e alle cellule immunitarie. In effetti, diversi studi precedenti hanno suggerito che le cellule aderenti si sono precipitate fuori dalla cavità del midollo osseo dell'osso lungo potrebbero differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti 5,6,7,8. Sebbene siano stati utilizzati diversi metodi di isolamento e coltura per produrre diverse popolazioni cellulari omogenee, ci sono ancora grandi sfide nell'isolamento e nella coltura di BMM da una varietà di diversi tipi di cellule.
Sono stati sviluppati diversi metodi per estrarre macrofagi mononucleati del midollo osseo (BMSC). Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono complessi 9,10,11. Ad esempio, la centrifugazione a gradiente di densità richiede un kit specializzato e l'operazione richiede tempo e ingombro. Questo metodo è adatto per l'isolamento di BMM da campioni di sangue ad alto volume, ma non da campioni di midollo osseo 9,12,13. Inoltre, l'estrazione di campioni di tessuto utilizzando la digestione della collagenasi è una procedura complessa e dispendiosa in termini di tempo; questo metodo non è raccomandato per l'isolamento di BMM da campioni di midollo osseo14,15. Inoltre, sebbene la separazione del flusso possa portare a popolazioni di monociti / macrofagi altamente purificate, richiede dimensioni del campione molto grandi e requisiti elevati di strumenti e attrezzature10,16. Inoltre, il metodo di arricchimento delle microsfere è estremamente costoso e non è fattibile in un laboratorio generale17.
Pertanto, nel presente studio è stato proposto un metodo conveniente, veloce ed economico per l'isolamento dei macrofagi mononucleati dal midollo osseo. Le cellule del midollo osseo aderenti per diversi punti temporali sono state utilizzate per isolare i BMM utilizzando un metodo di aderenza secondaria. I BMM estratti con il metodo di cui sopra potrebbero indurre la formazione di osteoclasti in vitro, fornendo così un modello cellulare semplice e conveniente per il futuro studio dell'osteoporosi in vitro.

<table><tbody><tr><td>fette rampicanti cellulari da 35 mm2</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-catepsina K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Controllo isotipo anti-CD11</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &mu; g/test, 1,675 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-CD11b/c</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&nbsp; 1&mu; g/test, 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actina</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; AF5003</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Fette rampicanti cellulari</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari</td><td>corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari</td><td></td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio IgG</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>per IF, 1:2.000</td></tr><tr><td>capra anti-coniglio IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>per WB, 1:2.000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro tech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro tech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD rat</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd</td><td></td><td>1-10 giorni</td></tr><tr><td>Kit di preparazione gel SDS-PAGE</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione TRAP/ALP</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripsina-EDTA</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Wright-Giemsa</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi dalle ossa di ratto mediante metodo di aderenza secondaria

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

Con una diminuzione della densità minerale ossea, le ossa hanno maggiori probabilità di fratturarsi, influenzando così negativamente la qualità della vita di un paziente. La crescita e lo sviluppo delle ossa sono regolati principalmente da osteoblasti e osteoclasti. È stato ampiamente accettato che gli osteoclasti sono derivati da cellule monociti-macrofagi del midollo osseo (BMM). BMM e altre cellule staminali ematopoietiche si trovano nella cavità del midollo osseo. Pertanto, isolare singoli BBM stabili da popolazioni cellulari diverse ed eterogenee è una sfida enorme. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria. Sono state raccolte cellule aderenti coltivate per 24-48 ore in coltura primaria. L'analisi citometrica a flusso ha mostrato che circa il 37,94% delle cellule erano CD11b/c+ (antigene di superficie monocita-macrofago). La colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) e l'analisi western blot hanno dimostrato che i BMM potrebbero differenziarsi in osteoclasti in vitro. I risultati di cui sopra hanno suggerito che le cellule di aderenza secondaria potrebbero essere considerate come un modello cellulare adatto per la ricerca sulla differenziazione degli osteoclasti.

La popolazione cellulare aderente secondaria era stabile e uniforme. Con la continua proliferazione cellulare, la maggior parte delle cellule è diventata più grande, con forma irregolare ed è cresciuta in un disco aderente radiale (Figura 2C, D). La citometria a flusso ha mostrato che la percentuale di cellule che esprimono CD11b/c, un marcatore molecolare sulla superficie delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi, era di circa il 37,94% ...

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria.

Isolamento delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi dalle ossa di ratto mediante metodo di aderenza secondaria

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

In questo protocollo, le cellule monociti-macrofagi del midollo osseo vengono estratte con il metodo di aderenza secondaria. Le cellule monocita-macrofagi del midollo osseo possono differenziarsi con successo in osteoclasti, il che fornisce un modello cellulare stabile per lo studio degli osteoclasti in vitro. Questo metodo è adatto per piccoli campioni di midollo osseo e può estrarre le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo dal midollo osseo in modo semplice e rapido senza richiedere attrezzature di laboratorio ad alta tecnologia.L'aumento degli osteoclasti può essere la potenziale patogenesi dell'osteoporosi. Le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo hanno un certo valore di ricerca come cellule precursori degli osteoclasti. Per iniziare, immergere i ratti eutanasizzati in alcool al 75% per 10 minuti per la disinfezione.Dopo aver accuratamente rimosso tutti gli arti del ratto con forbici e pinze, aspirare con PBS usando una pipetta e lavare il sangue aderente agli arti. Quindi a due millilitri del DMEM 10% FBS in un tubo da cinque millilitri. Dopo aver trasferito le ossa degli arti nel tubo da cinque millilitri, utilizzare le forbici per tagliare le ossa degli arti nel tubo in piccoli pezzi e mescolare l'omogeneizzato per risospescere le cellule del midollo osseo nel terreno di coltura.Riposare per cinque minuti fino a quando i frammenti di tessuto si sono depositati sul fondo del tubo. Quindi, aggiungere 10 millilitri di DMEM 10% FBS in un piatto di coltura da 100 millimetri, quindi trasferire il surnatante nel piatto di coltura. Incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per circa 24 ore.Dopo questo tempo di incubazione, la maggior parte delle cellule staminali mesenchimali aderirà alla parete del piatto di coltura e crescerà lentamente, mentre la maggior parte delle cellule monociti-macrofagi del midollo osseo sarà ancora sospesa nel terreno di coltura. Trasferire la sospensione cellulare nel piatto di coltura da 100 millimetri in un nuovo pallone quadrato di 25 centimetri e continuare a coltivare le cellule a 37 gradi Celsius nel 5% di anidride carbonica per altre 24 ore. Dopo aver rimosso il vecchio mezzo con attenzione, sostituire con mezzo fresco dopo che le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo hanno aderito alla parete del pallone.La citometria a flusso ha mostrato che la percentuale di cellule che esprimono CD11b e c, un marcatore molecolare sulla superficie delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi era di circa il 37,94%Con la proliferazione cellulare continua, la maggior parte delle cellule è diventata più grande all'interno di una forma irregolare ed è cresciuta in un disco aderente radiale. I risultati della colorazione TRAP hanno mostrato che rispetto al gruppo di controllo, il numero di granuli rosso porpora intracellulare era significativamente aumentato nelle cellule indotte con attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare kappa B e del fattore stimolante della colonia macrofagica. L'analisi Western blot ha dimostrato che i livelli di espressione delle proteine specifiche dell'osteoclasto TRAP e della catepsina K erano significativamente aumentati nelle cellule trattate rispetto al gruppo di controllo.La cosa più importante in questa procedura è il tempo di raccogliere le cellule aderenti secondarie in 24-48 ore di coltura primaria, le cellule monociti-macrofagi del midollo osseo iniziano ad aderire completamente. Le cellule monocita-macrofagi del midollo osseo isolate con questo metodo possono essere indotte in osteoclasti in vitro, fornendo un modello cellulare stabile per lo studio dell'osteoporosi.

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Un nuovo metodo per ottenere i macrofagi da colture primarie di cellule di fegato di ratto è descritto. Questo metodo utilizza la proliferazione dei macrofagi nella cultura, seguita da agitazione di palloni cultura e la purificazione di attaccamento selettivo ai piatti di plastica. Questa tecnica fornisce in modo efficiente i macrofagi del fegato, senza attrezzature complesse e competenze.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

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Isolamento di CD146<sup&gt; +</sup&gt; cellule residenti del polmone mesenchimali stromali da Rat Polmoni

Gli osteoclasti sono polykaryons di macrofage specifici del tessuto derivato dal lignaggio dei monociti-macrofage delle cellule staminali ematopoietiche. Questo protocollo descrive come isolare le cellule del midollo osseo in modo da ottenere grandi quantità di osteoclasti riducendo il rischio di incidenti riscontrati nei metodi tradizionali.

Isolamento, purificazione e differenziazione dei precursori dell'osteoclast dal midollo osseo del ratto

Questo articolo presenta un metodo che combina l'aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento della citometria del flusso per isolare, coltivare, smistare e identificare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo dalle mattidi di ratto.

Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

Presentato qui è un protocollo per l'aggiunta di peptide CD47 (pepCD47) a stent metallici usando la chimica del polibisfosfonato. La funzionalizzazione degli stent metallici utilizzando pepCD47 impedisce l'attacco e l'attivazione di cellule infiammatorie migliorando così la loro biocompatibilità.

Mitigazione dell'attaccamento delle cellule trasmesse dal sangue agli impianti metallici attraverso l'immobilizzazione peptidica derivata da CD47

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Questa ricerca delinea due tecniche per isolare abbondanti trappole extracellulari neutrofile (NET) dal midollo osseo di ratto. Un metodo combina un kit commerciale di isolamento dei neutrofili con la centrifugazione a gradiente di densità, mentre l'altro impiega solo la centrifugazione a gradiente di densità. Entrambi gli approcci producono NET funzionali che superano quelli dei neutrofili del sangue periferico.

Approccio unico per l'isolamento di neutrofili del midollo osseo di ratto con capacità comparabili

Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

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