Isolamento delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi dalle ossa di ratto mediante metodo di aderenza secondaria
13 luglio 2022
Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento dei BMM dai ratti SD, chiamato metodo di aderenza secondaria.
In questo protocollo, le cellule monociti-macrofagi del midollo osseo vengono estratte con il metodo di aderenza secondaria. Le cellule monocita-macrofagi del midollo osseo possono differenziarsi con successo in osteoclasti, il che fornisce un modello cellulare stabile per lo studio degli osteoclasti in vitro. Questo metodo è adatto per piccoli campioni di midollo osseo e può estrarre le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo dal midollo osseo in modo semplice e rapido senza richiedere attrezzature di laboratorio ad alta tecnologia.
L'aumento degli osteoclasti può essere la potenziale patogenesi dell'osteoporosi. Le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo hanno un certo valore di ricerca come cellule precursori degli osteoclasti. Per iniziare, immergere i ratti eutanasizzati in alcool al 75% per 10 minuti per la disinfezione.
Dopo aver accuratamente rimosso tutti gli arti del ratto con forbici e pinze, aspirare con PBS usando una pipetta e lavare il sangue aderente agli arti. Quindi a due millilitri del DMEM 10% FBS in un tubo da cinque millilitri. Dopo aver trasferito le ossa degli arti nel tubo da cinque millilitri, utilizzare le forbici per tagliare le ossa degli arti nel tubo in piccoli pezzi e mescolare l'omogeneizzato per risospescere le cellule del midollo osseo nel terreno di coltura.
Riposare per cinque minuti fino a quando i frammenti di tessuto si sono depositati sul fondo del tubo. Quindi, aggiungere 10 millilitri di DMEM 10% FBS in un piatto di coltura da 100 millimetri, quindi trasferire il surnatante nel piatto di coltura. Incubare a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per circa 24 ore.
Dopo questo tempo di incubazione, la maggior parte delle cellule staminali mesenchimali aderirà alla parete del piatto di coltura e crescerà lentamente, mentre la maggior parte delle cellule monociti-macrofagi del midollo osseo sarà ancora sospesa nel terreno di coltura. Trasferire la sospensione cellulare nel piatto di coltura da 100 millimetri in un nuovo pallone quadrato di 25 centimetri e continuare a coltivare le cellule a 37 gradi Celsius nel 5% di anidride carbonica per altre 24 ore. Dopo aver rimosso il vecchio mezzo con attenzione, sostituire con mezzo fresco dopo che le cellule monocitarie-macrofagi del midollo osseo hanno aderito alla parete del pallone.
La citometria a flusso ha mostrato che la percentuale di cellule che esprimono CD11b e c, un marcatore molecolare sulla superficie delle cellule di lignaggio monociti-macrofagi era di circa il 37,94%Con la proliferazione cellulare continua, la maggior parte delle cellule è diventata più grande all'interno di una forma irregolare ed è cresciuta in un disco aderente radiale. I risultati della colorazione TRAP hanno mostrato che rispetto al gruppo di controllo, il numero di granuli rosso porpora intracellulare era significativamente aumentato nelle cellule indotte con attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare kappa B e del fattore stimolante della colonia macrofagica. L'analisi Western blot ha dimostrato che i livelli di espressione delle proteine specifiche dell'osteoclasto TRAP e della catepsina K erano significativamente aumentati nelle cellule trattate rispetto al gruppo di controllo.
La cosa più importante in questa procedura è il tempo di raccogliere le cellule aderenti secondarie in 24-48 ore di coltura primaria, le cellule monociti-macrofagi del midollo osseo iniziano ad aderire completamente. Le cellule monocita-macrofagi del midollo osseo isolate con questo metodo possono essere indotte in osteoclasti in vitro, fornendo un modello cellulare stabile per lo studio dell'osteoporosi.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
Questo protocollo descrive il metodo di adesione secondaria per l'isolamento di cellule monocyte-macrofagiche del midollo osseo (BMM) da ratti SD. Questa tecnica consente un'efficace estrazione e differenziazione delle BMM in osteoclasti, fornendo un modello prezioso per lo studio della biologia degli osteoclasti in vitro.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Ematologia
- Biologia ossea
Sfondo
- Le cellule mononucleate del midollo osseo sono precursori degli osteoclasti.
- Comprendere la differenziazione degli osteoclasti è fondamentale per la ricerca sull'osteoporosi.
- Il metodo di adesione secondaria è un approccio semplice per l'isolamento cellulare.
- Questo metodo non richiede attrezzature di laboratorio avanzate.
Scopo dello studio
- Isolare macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) dal midollo osseo di ratto per scopi di ricerca.
- Facilitare lo studio della differenziazione e della funzione degli osteoclasti.
- Fornire un modello affidabile per la ricerca sull'osteoporosi.
Metodi Utilizzati
- Immergere i ratti eutanasizzati in alcol al 75% per la disinfezione.
- Estrazione del midollo osseo mediante il metodo di adesione secondaria.
- Isolamento dei BMM per la successiva differenziazione in osteoclasti.
- Utilizzo di piccoli campioni di midollo osseo per un'elaborazione efficiente.
Risultati principali
- I BMM possono essere isolati con successo utilizzando il metodo descritto.
- I BMM isolati possono differenziarsi in osteoclasti in vitro.
- Questo metodo fornisce un modello cellulare stabile per lo studio degli osteoclasti.
- L'aumento degli osteoclasti può essere correlato alla patogenesi dell'osteoporosi.
Conclusioni
- Il metodo di adesione secondaria è efficace per l'isolamento dei BMM.
- I BMM isolati sono preziosi per lo studio della biologia degli osteoclasti.
- Questo protocollo può essere utile nella ricerca sull'osteoporosi e negli studi correlati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento efficiente delle cellule monocyte-macrofagiche del midollo osseo (BMMs) è fondamentale per generare modelli in vitro affidabili di differenziazione degli osteoclasti, influenzando direttamente la ricerca sulle malattie ossee nelle fasi iniziali. Il metodo di adesione secondaria consente la preparazione su larga scala di cellule precursori per studi meccanicistici, sostenendo la previsione nei percorsi di osteoporosi e rimodellamento osseo. Questo approccio risolve un collo di bottiglia chiave nella validazione degli obiettivi e nello sviluppo dei saggi per i portafogli di biologia ossea.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei percorsi di osteoclastogenesi utilizzando BMM primari come sistema rilevante per la patologia.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo una popolazione precursore stabile per la validazione funzionale delle proteine bersaglio.
- Facilita una previsione affidabile sui meccanismi di riassorbimento osseo rilevanti per la ricerca sull'osteoporosi.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara popolazioni di BMM validate per saggi successivi di differenziamento in osteoclasti.
- Migliora la riproducibilità del saggio standardizzando le condizioni di isolamento e coltura cellulare.
- Consente letture quantitative mediante citometria a flusso, colorazione per TRAP e analisi mediante western blot.
- Permette una valutazione affidabile di composti in campagne di screening mirate agli osteoclasti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Fornisce un modello in vitro meccanicamente rilevante per lo studio della perdita ossea mediata dagli osteoclasti.
- Si allinea alle strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo la validazione a livello proteico (ad esempio, TRAP, cathepsina K).
- Facilita la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica nei modelli di malattie ossee.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica fornendo BMM standardizzati per la differenziazione degli osteoclasti, saggi funzionali e studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nell'osteocitogenesi.
- Screening: Fornisce popolazioni cellulari riproducibili per saggi quantitativi di differenziazione.
- Analisi: Consente l'analisi mediante citometria a flusso ed espressione proteica per confronti robusti tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a modelli preclinici di malattie ossee attraverso output cellulari validati.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per la generazione di precursori degli osteoclasti in diversi programmi di biologia ossea.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sugli osteoclasti.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento cellulare, migliorando la riproducibilità e la scalabilità per i team di ricerca e sviluppo.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di tipo go/no-go nei portafogli di target per le malattie ossee.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio degli asset mirati agli osteoclasti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di isolamento e coltura di cellule primarie.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture di base per la coltura cellulare e alla citometria a flusso per la validazione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi e le modalità di manipolazione, al fine di ottenere risultati riproducibili.
- Adattabile a campioni ridotti di midollo osseo, facilitandone l'utilizzo in contesti con risorse limitate.
- Dipende da una tempistica precisa durante l'adesione secondaria per massimizzare resa e purezza delle BMM.
