Name: Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca2+ nei miociti dei roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri come misurare la funzione contrattile nei miociti di ratto attraverso il rilevamento della lunghezza del sarcomero e i transitori di calcio. Questo protocollo consente di studiare la disfunzione cardiaca nelle malattie cardiovascolari.

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<li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+basis+of+Starling%27s+law+of+the+heart%3A+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li>
<li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li>
<li>Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shortening+and+%5BCa2%2B%5D+dynamics+of+left+ventricular+myocytes+isolated+from+exercise-trained+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).</li>
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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Il protocollo di stimolazione cronica delineato nella fase 1 estende il tempo utile per studiare miociti isolati e valutare l'impatto di trattamenti più lunghi. Nel nostro laboratorio, sono stati ottenuti risultati coerenti fino a 4 giorni dopo l'isolamento durante la misurazione della funzione contrattile utilizzando la lunghezza del sarcomero su miociti cronicamente stimolati. Tuttavia, la funzione contrattile dei miociti si deteriora rapidamente quando si utilizzano mezzi più vecchi di 1 settimana per accelerare i mio...

L'analisi della funzione della pompa cardiaca richiede spesso una serie di approcci per ottenere una visione adeguata, in particolare per i modelli animali di insufficienza cardiaca (HF). L'ecocardiografia o le misurazioni emodinamiche forniscono informazioni sulla disfunzione cardiaca in vivo 1, mentre gli approcci in vitro sono spesso impiegati per identificare se la disfunzione deriva da cambiamenti nel miofilamento e / o nel transitorio Ca2+ responsabile dell'eccitazione dell'accoppiamento, o del potenziale d'azione, con la funzione contrattile (ad esempio, accoppiamento eccitazione-contrazione [E-C]). Gli approcci in vitro offrono anche l'opportunità di esaminare la risposta funzionale ai neuroormoni, alle alterazioni genetiche indotte da vettori e ai potenziali agenti terapeutici2 prima di perseguire strategie di trattamento in vivo costose e/o laboriose.
Sono disponibili diversi approcci per studiare la funzione contrattile in vitro, comprese le misurazioni della forza nelle trabecole intatte3 o nei miociti permeabilizzati4, nonché l'accorciamento a vuoto e i transitori di Ca2+ in miociti intatti in presenza e assenza di HF 5,6. Ciascuno di questi approcci si concentra sulla funzione contrattile dei miociti cardiaci, che è direttamente responsabile della funzione della pompa cardiaca 2,7. Tuttavia, l'analisi sia della contrazione che dell'accoppiamento E-C insieme viene spesso eseguita misurando l'accorciamento della lunghezza muscolare e dei transitori di Ca 2+ in miociti adulti isolati e tolleranti a Ca2+. Il laboratorio utilizza un protocollo dettagliato pubblicato per isolare i miociti dai cuori di ratto per questa fase8.
Sia il Ca2+ transitorio che i miofilamenti contribuiscono ad accorciare e riallungare i miociti intatti e possono contribuire alla disfunzione contrattile 2,7. Pertanto, questo approccio è raccomandato quando l'analisi funzionale in vitro richiede un miocita intatto contenente il meccanismo ciclico Ca2+ più i miofilamenti. Ad esempio, miociti isolati intatti sono desiderabili per studiare la funzione contrattile dopo aver modificato il miofilamento o la funzione ciclica di Ca2+ tramite trasferimento genico9. Inoltre, viene suggerito un approccio miocitario intatto per analizzare l'impatto funzionale dei neuroormoni quando si studia l'impatto delle vie di segnalazione del secondo messaggero a valle e/o della risposta agli agenti terapeutici2. Una misura alternativa della forza dipendente dal carico nei singoli miociti viene spesso eseguita dopo la permeabilizzazione della membrana (o scuoiatura) a basse temperature (≤15 °C) per rimuovere il contributo transitorio di Ca2+ e concentrarsi sulla funzione del miofilamento10. La misurazione della forza dipendente dal carico più transitori Ca2+ nei miociti intatti è rara a causa in gran parte della sfida complessa e tecnica dell'approccio11, specialmente quando è necessaria una maggiore produttività, come per misurare le risposte alla segnalazione neuroormonale o come schermo per agenti terapeutici. L'analisi delle trabecole cardiache supera queste sfide tecniche, ma può anche essere influenzata da non-miociti, fibrosi e/o rimodellamento della matrice extracellulare2. Ciascuno degli approcci sopra descritti richiede una preparazione contenente miociti adulti perché i miociti neonatali e i miociti derivati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC) non esprimono ancora l'intero complemento delle proteine del miofilamento adulto e di solito mancano del livello di organizzazione del miofilamento presente nel miocita adulto a forma di bastoncello2. Ad oggi, l'evidenza nelle iPSC indica che la transizione completa alle isoforme adulte supera più di 134 giorni nella coltura12.
Dato il focus di questa raccolta sull'HF, i protocolli includono approcci e analisi per differenziare la funzione contrattile nei miociti intatti in fallimento rispetto a quelli non falliti. Esempi rappresentativi sono forniti da miociti di ratto studiati 18-20 settimane dopo una coartazione surrenale, descritta in precedenza 5,13. Vengono quindi effettuati confronti con miociti di ratti trattati con finzione.
Il protocollo e la piattaforma di imaging qui descritti sono utilizzati per analizzare e monitorare i cambiamenti nell'accorciamento e nei transitori Ca2+ nei miociti cardiaci a forma di bastoncello durante lo sviluppo di HF. Per questa analisi, 2 x 10 miociti tolleranti a forma di bastoncellotolleranti a 4 Ca 2+ sono placcati su vetrini (CS) rivestiti di laminina da22 mm e coltivati durante la notte, come descritto in precedenza8. I componenti assemblati per questa piattaforma di imaging, insieme ai supporti e ai buffer utilizzati per l'imaging ottimale, sono forniti nella tabella dei materiali. Qui viene fornita anche una guida per l'analisi dei dati utilizzando un software e i risultati rappresentativi. Il protocollo generale è suddiviso in sottosezioni separate, con le prime tre sezioni incentrate sui miociti isolati di ratto e sull'analisi dei dati, seguite da esperimenti transitori cellulari di Ca2+ e analisi dei dati nei miociti.

<table><tbody><tr><td>MEDIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma (Roche)</td><td>3117057001</td><td>Concentrazione finale = 0,2% (p/v)Glutatione</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>Concentrazione finale = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td>Concentrazione finale = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M-2520</td><td>1 flacone fa 1 L; pH 7,45</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>Concentrazione finale = 4 mM</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td>Concentrazione finale = 100 U/mL di penicillina, 100 &mu; g/mL di streptomicina</td></tr><tr><td><forte>REAGENTI SPECIFICI PER Ca2+ IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (Sonde Molecolari)</td><td>F1221</td><td>50 &mu; g/fiala; &nbsp; Preparare la soluzione madre di 1 mM di Fura-2AM + 0,5 M di probenicid in DMSO; &nbsp; La concentrazione finale di Fura2-AM nei mezzi è 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>P36400</td><td>Aggiungere 7,2 mg di probenicid (0,5 M) a 1 mM di materiale Fura-2AM; La concentrazione finale nel terreno è di 2,5 mM</td></tr><tr><td>MATERIALI PER LA STIMOLAZIONE DEI MIOCITI DI RATTO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1 22&nbsp; mm2 vetrini coprioggetti</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td></td></tr> 3 <tr><td>x 36 pollici con jack a banana</td><td>Pomona Electronics</td><td>B-36-2</td><td>Figura supplementare 1, pannello C</td></tr><tr><td>Incubatore 37oC&nbsp; con 95% O2:5% CO2&nbsp;</td><td>Forma</td><td>3110</td><td>Figura supplementare 1, pannello E. Sono appropriati più modelli Cabina</td></tr> di <tr><td>biosicurezza Classe II A/B3 con lampada UV</td><td>Forma</td><td>1286</td><td>Sono appropriati più modelli</td></tr><tr><td>Pinze - Dumont #5 5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perline calde</td><td>Fine Science Tools</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito a basso ingrandimento</td><td>Leica</td><td>DM-IL&nbsp;</td><td>Posizionare questo microscopio adiacente all'incubatrice per monitorare i miociti stimolati per la contrazione all'inizio della stimolazione e dopo i cambi di media; Obiettivi consigliati 4X e 10X</td></tr><tr><td>Camera di stimolazione</td> Supplementare <td>personalizzato</td><td></td><td>Figura 1, pannello A. Il sistema Ionoptix C-pace è un'alternativa disponibile in commercio o vedere 22</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td><td>Supplemental Figura 1, pannello D.</td></tr><tr><td>MATERIALI PER FUNZIONE CONTRATTILE e/o Ca2+ ANALISI DI IMAGING</td><td></td><td></td><td>ID in Figura 2 supplementare & Alternative/Opzioni consigliate</td></tr><tr><td>Componenti aggiuntivi per l'analisi di imaging Ca2+</td> Componenti essenziali del sistema <td>Ionoptix</td><td>: -- Sistema di conteggio dei fotoni&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Alimentatore allo xeno con sorgente luminosa a doppia eccitazione&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Interfaccia a fluorescenza</td><td>&nbsp;- Il sistema di conteggio dei fotoni contiene un tubo fotomoltiplicatore (PMT) e uno specchio dicroico ed è installato adiacente alla telecamera CCD&nbsp; (pannello A #4).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - L'alimentazione per la sorgente luminosa della lampadina allo xeno (vedi pannello A #5 e pannello C, a sinistra) è integrata con un'interfaccia a doppia eccitazione (340/380 nm di eccitazione e 510 nm di emissione) mostrata nel pannello A #6. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - L'interfaccia di fluorescenza tra il computer e la sorgente luminosa è mostrata nel pannello B, #12.</td></tr><tr><td>Telecamera CCD con acquisizione immagini hardware e software (240 fotogrammi/s)</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Myocam con controller CCD&nbsp;</td><td>Myocam e il controller CCD sono mostrati nella Fig. 2 supplementare, pannello A #4&nbsp; e pannello A #5 e pannello C #5 (a destra), rispettivamente. Il controller è integrato con un sistema informatico PC (pannello B #14).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Stimolatore a camera</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Myopacer</td><td>Panel B, #13; Alternativa:&nbsp; Grass modello S48</td></tr><tr><td>Camera di perfusione montata su vetrino coprioggetti</td><td>Camera personalizzata per vetrino coprioggetti da 22 mm2 con adattatore in silicone e 2-4 viti Phillips pan-head #0 (freccia, pannello F)</td><td></td><td>Pannello A #10 e pannello F; &nbsp; &nbsp; La temperatura della camera è calibrata a 37oC utilizzando una sonda TH-10Km e il regolatore di temperatura TC2BIP (vedi regolatore di temperatura).&nbsp; Alternative commerciali:&nbsp; Ionoptix FHD o C-stim cell&nbsp; Camere; Sistema di stimolazione delle colture Cell MicroControls</td></tr><tr><td>Computer e software dedicati per la raccolta e l'analisi dei dati di funzione/transitori di Ca2+</td><td>PC Ionoptix</td><td>con scheda PC Ionwizard e software</td><td>Pannello B, #14; La funzione contrattile viene misurata utilizzando i moduli di acquisizione SarcLen (lunghezza del sarcomero) o SoftEdge (lunghezza dei miociti) del software IonWizard. Il software Ionwizard include anche il software di acquisizione PMT per la misurazione raziometrica. Ca2+ imaging in myoyctes caricato con Fura-2AM. - Si consiglia un armadio elettronico a 4 montanti per montaggio su rack e ripiani per alloggiare il somputer e lo stimolatore cellulare. Anche l'interfaccia a fluorescenza per l'imaging Ca2+ è alloggiata in questo armadio (vedi sotto).</td></tr><tr><td>Pinze - Dumont #5 TI</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td>Pannello F</td></tr><tr><td>Supporto per tubo isolato per fluidi</td><td>Custom</td><td></td><td>Panel A #9; Questo supporto è facilmente assemblabile utilizzando polistirolo e un pacchetto di gel preriscaldato per mantenere caldi i supporti</td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro invertito</td><td>Nikon</td><td>TE-2000S</td><td>Installare una torretta rotante per l'epifluorescenza (pannello A #2) per l'imaging Ca2+. Si consiglia inoltre un filtro condensatore rosso intenso (590 nm) per ridurre al minimo lo sbiancamento della fluorescenza durante l'imaging Ca2+.</td></tr><tr><td>Tavolo Isolatore</td><td>TMC Controllo Vibrazioni</td><td>30 x 36 pollici</td><td>Pannello A, #1; Desiderabile:&nbsp; scaffalature rialzate, schermatura di Faraday&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Oculari e obiettivo per microscopio</td><td>Nikon</td><td>10X CFI oculari 40X acqua CFI Piano Obiettivo Fluor</td><td>Pannello A #3; obiettivo 40X:&nbsp; n.d. 0.08; w.d. 2 mm.&nbsp; Un riscaldatore dell'obiettivo Cell MicroControls HLS-1 è montato attorno all'obiettivo (vedere il regolatore di temperatura di seguito).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NOTA:&nbsp; Gli erogatori ad immersione in acqua sono ora disponibili anche per obiettivi a base d'acqua. &nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>Pannello A #8 e pannello E</td></tr><tr><td>piccola pesa barca</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore</td><td>di temperatura Cell MicroControls</td><td>TC2BIP</td><td>Pannello A #7; Pannello D. Questo regolatore di temperatura riscalda la camera del vetrino coprioggetto a 37oC. &nbsp; &nbsp; Per questa piattaforma si consiglia un preriscaldatore e un riscaldatore dell'obiettivo. Un preriscaldatore Cell MicroControls HPRE2 e&nbsp; Il riscaldatore dell'obiettivo HLS-1 è controllato&nbsp; dal regolatore di temperatura TC2BIP per i nostri studi.</td></tr><tr><td>Luce LED sotto l'armadio con sensore di movimento&nbsp;</td><td>Sylvania</td><td>#72423 Luce LED</td><td>Consigliata per la raccolta di dati durante l'imaging transitorio Ca2+ in condizioni di luce ambientale minima. &nbsp; Alternativa:&nbsp; Una torcia a clip/luce a libro con collo flessibile - sono disponibili più fornitori.</td></tr><tr><td>Linea per vuoto con pallone Ehrlenmeyer in linea e filtro protettivo</td><td>Tubo Fisher</td><td>Tygon - E363; &nbsp; pallone Ehrlenmeyer in polipropilene - 10-182-50B; Filtro sottovuoto - 09-703-90</td><td>Pannello A #11</td></tr></tbody></table>

analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori ca2+ nei miociti dei roditori

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

La disfunzione contrattile e i transitori di Ca2+ sono spesso analizzati a livello cellulare come parte di una valutazione completa della lesione indotta da cuore e / o del rimodellamento. Un approccio per valutare queste alterazioni funzionali utilizza l'accorciamento a vuoto e le analisi transitorie di Ca2+ nei miociti cardiaci primari adulti. Per questo approccio, i miociti adulti vengono isolati dalla digestione della collagenasi, resi tolleranti al Ca2+ e quindi aderenti a vetrini di copertura rivestiti di laminina, seguiti da stimolazione elettrica in mezzi privi di siero. Il protocollo generale utilizza miociti cardiaci di ratto adulto, ma può essere facilmente adattato per miociti primari di altre specie. Le alterazioni funzionali nei miociti da cuori feriti possono essere paragonate a miociti fittizi e/o a trattamenti terapeutici in vitro . La metodologia include gli elementi essenziali necessari per la stimolazione dei miociti, insieme alla camera cellulare e ai componenti della piattaforma. Il protocollo dettagliato per questo approccio incorpora le fasi per misurare l'accorciamento a vuoto mediante rilevamento della lunghezza del sarcomero e transitori cellulari Ca2+ misurati con l'indicatore raziometrico Fura-2 AM, nonché per l'analisi dei dati grezzi.

Gli studi sulla funzionalità contrattile vengono eseguiti su miociti di ratto a partire dal giorno dopo l'isolamento (giorno 2) fino a 4 giorni dopo l'isolamento. Sebbene i miociti possano essere registrati il giorno dopo l'isolamento (cioè il giorno 2), sono spesso necessari tempi di coltura più lunghi dopo il trasferimento genico o i trattamenti per modificare la funzione contrattile8. Per i miociti coltivati per più di 18 ore dopo l'isolamento, il protocollo di stimolazione descritto nella sezi...

Viene presentata una serie di protocolli che descrivono la misurazione della funzione contrattile tramite il rilevamento della lunghezza del sarcomero insieme alla misurazione transitoria del calcio (Ca2+) nei miociti isolati di ratto. È inclusa anche l'applicazione di questo approccio per studi su modelli animali di insufficienza cardiaca.

Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca2+ nei miociti dei roditori

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Questo approccio rileva i cambiamenti nella funzione contrattile durante lo sviluppo dell'insufficienza cardiaca. Anche la risposta funzionale nei miociti ai neuroormoni e ai potenziali agenti terapeutici può essere sottoposta a screening. Il posizionamento del miocita può richiedere pratica, ma è essenziale per ottenere una imaging coerente della lunghezza del sarcomero.A dimostrare la procedura è Margaret Westfall, professore associato e ricercatore principale del laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare un impacco di gel e un supporto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Accendere i componenti della piattaforma della funzione contrattile come menzionato nel manoscritto e assemblare i tubi nella pompa peristaltica.Quindi, trasferire il pacco di gel preriscaldato nel supporto del tubo e accendere il vuoto nell'alimentazione dello stimolatore cellulare. Posizionare un tubo da 50 millilitri con il fluido nel supporto del tubo isolato per iniziare la perfusione a 0,5 millilitri al minuto attraverso il tubo della pompa peristaltica. Quindi, aggiungere due millilitri di fluido preriscaldato a una piccola barca di pesatura e trasferire un vetrino di copertura contenente miociti dalla camera di stimolazione al battello di pesatura.Riportare la camera di stimolazione nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Rimuovere il vetrino di copertura dal contenitore di pesatura e pulire delicatamente la parte inferiore prima di trasferirlo in una camera di copertura appena unta e aggiungere una goccia di supporto sul vetrino di copertura. Posizionare un supporto per elettrodo di platino sopra la linguetta del coperchio, quindi posizionare una nuova sottoveste di copertura sopra la parte superiore con una pinza e posizionare un supporto superiore sopra il sandwich della sottoveste di copertura.Installare due o quattro viti a testa di panhead numero zero per completare l'assemblaggio della camera. Nella pompa peristaltica, quando il fluido è presente in tutto il tubo, collegare il tubo al preriscaldatore e il preriscaldatore alla camera di scorrimento del coperchio. Quindi, iniziare la perfusione a 0,5 millilitri al minuto e posizionare una salvietta di tessuto sotto la camera per garantire che non ci siano perdite.Dopo aver posizionato la camera di scorrimento del coperchio nell'adattatore di palcoscenico del microscopio, accendere l'impianto di riscaldamento ed equilibriare il gruppo per cinque-10 minuti per ottenere una temperatura costante del fluido di 37 gradi Celsius al centro della camera. Osservare il mezzo perfuso che viene raccolto all'estremità opposta della camera con tubi collegati a un sistema di vuoto. Durante il tempo di equilibrio, visualizzare i miociti con l'obiettivo di immersione in acqua 40x sul microscopio.Per attivare lo stimolatore di stimolazione, impostare la tensione da 35 a 40 volt e regolare la frequenza di stimolazione a 0,2 hertz per ottimizzare la funzione contrattile e la sopravvivenza dei miociti. Per raccogliere le tracce di accorciamento del sarcomero, aprire il software sul computer e selezionare OK, file e nuove schede. Preparare un modello di schermo selezionando le tracce, modificare i limiti utente e la lunghezza del sarcomero.Registrare le tracce di lunghezza del sarcomero con il file e le nuove linguette, identificare un miocita in contrazione e posizionare il miocita lungo l'asse longitudinale della telecamera in modo che il modello di striatura sia verticale. Utilizzare il mouse del computer per posizionare la regione di interesse o la casella ROI sul miocita. Selezionare raccogliere e iniziare a registrare la funzione contrattile.Registrare l'accorciamento per 60 secondi da ciascun miocita a basse frequenze di stimolazione di 0,5 hertz. Registra l'accorciamento del sarcomero da cinque a 10 celle per vetrina. Per misurare l'accorciamento su un intervallo di frequenze, posizionare i miociti su ciascuna frequenza per ottenere un accorciamento dello stato stazionario prima della registrazione.Raddoppia la velocità di perfusione e inizia a registrare da 15 a 20 secondi dopo la stimolazione a una nuova frequenza nell'intervallo da 0,2 a due hertz e registra non più di due miociti per vetrino di copertura per accorciare la gamma data di frequenze di stimolazione. Registrare almeno sette contrazioni per cellula per ottenere dati mediati del segnale affidabili. Selezionare il file, scegliere una traccia registrata e quindi selezionare Apri.Selezionare la scheda uno della traccia di base e quindi impostare il pannello giallo nella parte superiore della traccia per ottenere la lunghezza sarc. Preparare un modello di analisi con le opzioni di analisi temporanea monotona delle operazioni e il segno di evento TTL nella casella definizione di T Zero nelle opzioni necessarie dal menu. Salvare queste opzioni di analisi selezionando i modelli e salvare il modello di analisi con un identificatore.Caricare il modello di analisi prima di analizzare ogni traccia. Per analizzare i dati, selezionare i segni, il gate, aggiungere i transienti, quindi convertire dal contrassegno di evento e dall'intervallo di analisi. Impostare l'intervallo di tempo da meno 0,01 a 1,20 secondi per i miociti a 0,2 hertz.Selezionare un intervallo di tempo più breve per i miociti stimolati a frequenze più elevate. Selezionare le operazioni e gli eventi medi per produrre una registrazione media del segnale al di sotto della traccia di base originale. Quindi, selezionare la scheda uno della traccia media del segnale, quindi andare ai segni nel menu superiore seguita da aggiungi transitorio, scegliere operazioni e analisi transitoria monotona per visualizzare i valori medi del segnale per i parametri del sarcomero di base nel pannello di visualizzazione del segnale mediato.Selezionare l'esportazione dell'analisi dei transitori monotoni e della corrente degli appunti e trasferire l'analisi del sarcomero transitorio in un foglio di calcolo per l'analisi composita di più miociti. Per copiare la traccia media del segnale, selezionare Esporta, Traccia corrente, quindi Appunti e schede delle opzioni in ordine e impostare le cifre decimali su cinque. Scegliere il delimitatore di schede e fare clic su OK.Accelera la media delle tracce del segnale per ogni registrazione di miociti in un secondo foglio di calcolo. Lo studio ha dimostrato che il sovraccarico di pressione o PO, ha ridotto la funzione contrattile dei miociti rispetto al gruppo fittizio. Tuttavia, quattro giorni dopo il trasferimento genico della troponina cardiaca IT 144D o cTnIT144D, la capacità contrattile nei miociti PO è tornata verso livelli fittizi, indicando che la funzione dei miociti potrebbe essere ripristinata.Negli studi iniziali, il trasferimento genico di cTnIT144D ha migliorato l'accorciamento del picco e livelli diastolici elevati di calcio rispetto a CTnI. Spesso sono necessari aggiustamenti fini nel posizionamento del miocita cardiaco per ottenere chiare tracce di accorciamento. Questo protocollo può anche essere eseguito su miociti cardiaci caricati con coloranti fluorescenti sensibili al calcio come Fura-2 AM per rilevare transitori di calcio oltre all'accorciamento.

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Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca²⁺ nei miociti dei roditori

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