Name: Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca2+ nei miociti dei roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Scopri come misurare la funzione contrattile nei miociti di ratto attraverso il rilevamento della lunghezza del sarcomero e i transitori di calcio. Questo protocollo consente di studiare la disfunzione cardiaca nelle malattie cardiovascolari.

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<li>Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ultrastructure+basis+of+Starling%27s+law+of+the+heart%3A+the+role+of+the+sarcomere+is+determining+ventricular+size+and+stroke+volume%5BTitle%5D)+AND+%22American+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume.</a> American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).</li>
<li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).</li>
<li>Zak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+myofibrillar+proteins+in+the+normal+and+hypertrophic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart.</a> Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).</li>
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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Il protocollo di stimolazione cronica delineato nella fase 1 estende il tempo utile per studiare miociti isolati e valutare l'impatto di trattamenti più lunghi. Nel nostro laboratorio, sono stati ottenuti risultati coerenti fino a 4 giorni dopo l'isolamento durante la misurazione della funzione contrattile utilizzando la lunghezza del sarcomero su miociti cronicamente stimolati. Tuttavia, la funzione contrattile dei miociti si deteriora rapidamente quando si utilizzano mezzi più vecchi di 1 settimana per accelerare i mio...

L'analisi della funzione della pompa cardiaca richiede spesso una serie di approcci per ottenere una visione adeguata, in particolare per i modelli animali di insufficienza cardiaca (HF). L'ecocardiografia o le misurazioni emodinamiche forniscono informazioni sulla disfunzione cardiaca in vivo 1, mentre gli approcci in vitro sono spesso impiegati per identificare se la disfunzione deriva da cambiamenti nel miofilamento e / o nel transitorio Ca2+ responsabile dell'eccitazione dell'accoppiamento, o del potenziale d'azione, con la funzione contrattile (ad esempio, accoppiamento eccitazione-contrazione [E-C]). Gli approcci in vitro offrono anche l'opportunità di esaminare la risposta funzionale ai neuroormoni, alle alterazioni genetiche indotte da vettori e ai potenziali agenti terapeutici2 prima di perseguire strategie di trattamento in vivo costose e/o laboriose.
Sono disponibili diversi approcci per studiare la funzione contrattile in vitro, comprese le misurazioni della forza nelle trabecole intatte3 o nei miociti permeabilizzati4, nonché l'accorciamento a vuoto e i transitori di Ca2+ in miociti intatti in presenza e assenza di HF 5,6. Ciascuno di questi approcci si concentra sulla funzione contrattile dei miociti cardiaci, che è direttamente responsabile della funzione della pompa cardiaca 2,7. Tuttavia, l'analisi sia della contrazione che dell'accoppiamento E-C insieme viene spesso eseguita misurando l'accorciamento della lunghezza muscolare e dei transitori di Ca 2+ in miociti adulti isolati e tolleranti a Ca2+. Il laboratorio utilizza un protocollo dettagliato pubblicato per isolare i miociti dai cuori di ratto per questa fase8.
Sia il Ca2+ transitorio che i miofilamenti contribuiscono ad accorciare e riallungare i miociti intatti e possono contribuire alla disfunzione contrattile 2,7. Pertanto, questo approccio è raccomandato quando l'analisi funzionale in vitro richiede un miocita intatto contenente il meccanismo ciclico Ca2+ più i miofilamenti. Ad esempio, miociti isolati intatti sono desiderabili per studiare la funzione contrattile dopo aver modificato il miofilamento o la funzione ciclica di Ca2+ tramite trasferimento genico9. Inoltre, viene suggerito un approccio miocitario intatto per analizzare l'impatto funzionale dei neuroormoni quando si studia l'impatto delle vie di segnalazione del secondo messaggero a valle e/o della risposta agli agenti terapeutici2. Una misura alternativa della forza dipendente dal carico nei singoli miociti viene spesso eseguita dopo la permeabilizzazione della membrana (o scuoiatura) a basse temperature (≤15 °C) per rimuovere il contributo transitorio di Ca2+ e concentrarsi sulla funzione del miofilamento10. La misurazione della forza dipendente dal carico più transitori Ca2+ nei miociti intatti è rara a causa in gran parte della sfida complessa e tecnica dell'approccio11, specialmente quando è necessaria una maggiore produttività, come per misurare le risposte alla segnalazione neuroormonale o come schermo per agenti terapeutici. L'analisi delle trabecole cardiache supera queste sfide tecniche, ma può anche essere influenzata da non-miociti, fibrosi e/o rimodellamento della matrice extracellulare2. Ciascuno degli approcci sopra descritti richiede una preparazione contenente miociti adulti perché i miociti neonatali e i miociti derivati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC) non esprimono ancora l'intero complemento delle proteine del miofilamento adulto e di solito mancano del livello di organizzazione del miofilamento presente nel miocita adulto a forma di bastoncello2. Ad oggi, l'evidenza nelle iPSC indica che la transizione completa alle isoforme adulte supera più di 134 giorni nella coltura12.
Dato il focus di questa raccolta sull'HF, i protocolli includono approcci e analisi per differenziare la funzione contrattile nei miociti intatti in fallimento rispetto a quelli non falliti. Esempi rappresentativi sono forniti da miociti di ratto studiati 18-20 settimane dopo una coartazione surrenale, descritta in precedenza 5,13. Vengono quindi effettuati confronti con miociti di ratti trattati con finzione.
Il protocollo e la piattaforma di imaging qui descritti sono utilizzati per analizzare e monitorare i cambiamenti nell'accorciamento e nei transitori Ca2+ nei miociti cardiaci a forma di bastoncello durante lo sviluppo di HF. Per questa analisi, 2 x 10 miociti tolleranti a forma di bastoncellotolleranti a 4 Ca 2+ sono placcati su vetrini (CS) rivestiti di laminina da22 mm e coltivati durante la notte, come descritto in precedenza8. I componenti assemblati per questa piattaforma di imaging, insieme ai supporti e ai buffer utilizzati per l'imaging ottimale, sono forniti nella tabella dei materiali. Qui viene fornita anche una guida per l'analisi dei dati utilizzando un software e i risultati rappresentativi. Il protocollo generale è suddiviso in sottosezioni separate, con le prime tre sezioni incentrate sui miociti isolati di ratto e sull'analisi dei dati, seguite da esperimenti transitori cellulari di Ca2+ e analisi dei dati nei miociti.

<table><tbody><tr><td>MEDIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma (Roche)</td><td>3117057001</td><td>Concentrazione finale = 0,2% (p/v)Glutatione</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>G-6529</td><td>Concentrazione finale = 10 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td>Concentrazione finale = 15 mM</td></tr><tr><td>M199</td><td>Sigma</td><td>M-2520</td><td>1 flacone fa 1 L; pH 7,45</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S-8875</td><td>Concentrazione finale = 4 mM</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Fisher</td><td>15140122</td><td>Concentrazione finale = 100 U/mL di penicillina, 100 &mu; g/mL di streptomicina</td></tr><tr><td><forte>REAGENTI SPECIFICI PER Ca2+ IMAGING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Invitrogen (Sonde Molecolari)</td><td>F1221</td><td>50 &mu; g/fiala; &nbsp; Preparare la soluzione madre di 1 mM di Fura-2AM + 0,5 M di probenicid in DMSO; &nbsp; La concentrazione finale di Fura2-AM nei mezzi è 5 &mu; M</td></tr><tr><td>Probenicid</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>P36400</td><td>Aggiungere 7,2 mg di probenicid (0,5 M) a 1 mM di materiale Fura-2AM; La concentrazione finale nel terreno è di 2,5 mM</td></tr><tr><td>MATERIALI PER LA STIMOLAZIONE DEI MIOCITI DI RATTO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#1 22&nbsp; mm2 vetrini coprioggetti</td><td>Corning</td><td>2845-22</td><td></td></tr> 3 <tr><td>x 36 pollici con jack a banana</td><td>Pomona Electronics</td><td>B-36-2</td><td>Figura supplementare 1, pannello C</td></tr><tr><td>Incubatore 37oC&nbsp; con 95% O2:5% CO2&nbsp;</td><td>Forma</td><td>3110</td><td>Figura supplementare 1, pannello E. Sono appropriati più modelli Cabina</td></tr> di <tr><td>biosicurezza Classe II A/B3 con lampada UV</td><td>Forma</td><td>1286</td><td>Sono appropriati più modelli</td></tr><tr><td>Pinze - Dumont #5 5/45</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perline calde</td><td>Fine Science Tools</td><td>1800-45</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito a basso ingrandimento</td><td>Leica</td><td>DM-IL&nbsp;</td><td>Posizionare questo microscopio adiacente all'incubatrice per monitorare i miociti stimolati per la contrazione all'inizio della stimolazione e dopo i cambi di media; Obiettivi consigliati 4X e 10X</td></tr><tr><td>Camera di stimolazione</td> Supplementare <td>personalizzato</td><td></td><td>Figura 1, pannello A. Il sistema Ionoptix C-pace è un'alternativa disponibile in commercio o vedere 22</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>Ionoptix</td><td>Myopacer</td><td>Supplemental Figura 1, pannello D.</td></tr><tr><td>MATERIALI PER FUNZIONE CONTRATTILE e/o Ca2+ ANALISI DI IMAGING</td><td></td><td></td><td>ID in Figura 2 supplementare & Alternative/Opzioni consigliate</td></tr><tr><td>Componenti aggiuntivi per l'analisi di imaging Ca2+</td> Componenti essenziali del sistema <td>Ionoptix</td><td>: -- Sistema di conteggio dei fotoni&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Alimentatore allo xeno con sorgente luminosa a doppia eccitazione&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; --&nbsp; Interfaccia a fluorescenza</td><td>&nbsp;- Il sistema di conteggio dei fotoni contiene un tubo fotomoltiplicatore (PMT) e uno specchio dicroico ed è installato adiacente alla telecamera CCD&nbsp; (pannello A #4).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - L'alimentazione per la sorgente luminosa della lampadina allo xeno (vedi pannello A #5 e pannello C, a sinistra) è integrata con un'interfaccia a doppia eccitazione (340/380 nm di eccitazione e 510 nm di emissione) mostrata nel pannello A #6. &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - L'interfaccia di fluorescenza tra il computer e la sorgente luminosa è mostrata nel pannello B, #12.</td></tr><tr><td>Telecamera CCD con acquisizione immagini hardware e software (240 fotogrammi/s)</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Myocam con controller CCD&nbsp;</td><td>Myocam e il controller CCD sono mostrati nella Fig. 2 supplementare, pannello A #4&nbsp; e pannello A #5 e pannello C #5 (a destra), rispettivamente. Il controller è integrato con un sistema informatico PC (pannello B #14).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Stimolatore a camera</td><td>Ionoptix&nbsp;</td><td>Myopacer</td><td>Panel B, #13; Alternativa:&nbsp; Grass modello S48</td></tr><tr><td>Camera di perfusione montata su vetrino coprioggetti</td><td>Camera personalizzata per vetrino coprioggetti da 22 mm2 con adattatore in silicone e 2-4 viti Phillips pan-head #0 (freccia, pannello F)</td><td></td><td>Pannello A #10 e pannello F; &nbsp; &nbsp; La temperatura della camera è calibrata a 37oC utilizzando una sonda TH-10Km e il regolatore di temperatura TC2BIP (vedi regolatore di temperatura).&nbsp; Alternative commerciali:&nbsp; Ionoptix FHD o C-stim cell&nbsp; Camere; Sistema di stimolazione delle colture Cell MicroControls</td></tr><tr><td>Computer e software dedicati per la raccolta e l'analisi dei dati di funzione/transitori di Ca2+</td><td>PC Ionoptix</td><td>con scheda PC Ionwizard e software</td><td>Pannello B, #14; La funzione contrattile viene misurata utilizzando i moduli di acquisizione SarcLen (lunghezza del sarcomero) o SoftEdge (lunghezza dei miociti) del software IonWizard. Il software Ionwizard include anche il software di acquisizione PMT per la misurazione raziometrica. Ca2+ imaging in myoyctes caricato con Fura-2AM. - Si consiglia un armadio elettronico a 4 montanti per montaggio su rack e ripiani per alloggiare il somputer e lo stimolatore cellulare. Anche l'interfaccia a fluorescenza per l'imaging Ca2+ è alloggiata in questo armadio (vedi sotto).</td></tr><tr><td>Pinze - Dumont #5 TI</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td>Pannello F</td></tr><tr><td>Supporto per tubo isolato per fluidi</td><td>Custom</td><td></td><td>Panel A #9; Questo supporto è facilmente assemblabile utilizzando polistirolo e un pacchetto di gel preriscaldato per mantenere caldi i supporti</td></tr><tr><td>Microscopio a campo chiaro invertito</td><td>Nikon</td><td>TE-2000S</td><td>Installare una torretta rotante per l'epifluorescenza (pannello A #2) per l'imaging Ca2+. Si consiglia inoltre un filtro condensatore rosso intenso (590 nm) per ridurre al minimo lo sbiancamento della fluorescenza durante l'imaging Ca2+.</td></tr><tr><td>Tavolo Isolatore</td><td>TMC Controllo Vibrazioni</td><td>30 x 36 pollici</td><td>Pannello A, #1; Desiderabile:&nbsp; scaffalature rialzate, schermatura di Faraday&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Oculari e obiettivo per microscopio</td><td>Nikon</td><td>10X CFI oculari 40X acqua CFI Piano Obiettivo Fluor</td><td>Pannello A #3; obiettivo 40X:&nbsp; n.d. 0.08; w.d. 2 mm.&nbsp; Un riscaldatore dell'obiettivo Cell MicroControls HLS-1 è montato attorno all'obiettivo (vedere il regolatore di temperatura di seguito).&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NOTA:&nbsp; Gli erogatori ad immersione in acqua sono ora disponibili anche per obiettivi a base d'acqua. &nbsp;</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>Pannello A #8 e pannello E</td></tr><tr><td>piccola pesa barca</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore</td><td>di temperatura Cell MicroControls</td><td>TC2BIP</td><td>Pannello A #7; Pannello D. Questo regolatore di temperatura riscalda la camera del vetrino coprioggetto a 37oC. &nbsp; &nbsp; Per questa piattaforma si consiglia un preriscaldatore e un riscaldatore dell'obiettivo. Un preriscaldatore Cell MicroControls HPRE2 e&nbsp; Il riscaldatore dell'obiettivo HLS-1 è controllato&nbsp; dal regolatore di temperatura TC2BIP per i nostri studi.</td></tr><tr><td>Luce LED sotto l'armadio con sensore di movimento&nbsp;</td><td>Sylvania</td><td>#72423 Luce LED</td><td>Consigliata per la raccolta di dati durante l'imaging transitorio Ca2+ in condizioni di luce ambientale minima. &nbsp; Alternativa:&nbsp; Una torcia a clip/luce a libro con collo flessibile - sono disponibili più fornitori.</td></tr><tr><td>Linea per vuoto con pallone Ehrlenmeyer in linea e filtro protettivo</td><td>Tubo Fisher</td><td>Tygon - E363; &nbsp; pallone Ehrlenmeyer in polipropilene - 10-182-50B; Filtro sottovuoto - 09-703-90</td><td>Pannello A #11</td></tr></tbody></table>

analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori ca2+ nei miociti dei roditori

Analysis of Cardiac Contractile Dysfunction and Ca2+ Transients in Rodent Myocytes

La disfunzione contrattile e i transitori di Ca2+ sono spesso analizzati a livello cellulare come parte di una valutazione completa della lesione indotta da cuore e / o del rimodellamento. Un approccio per valutare queste alterazioni funzionali utilizza l'accorciamento a vuoto e le analisi transitorie di Ca2+ nei miociti cardiaci primari adulti. Per questo approccio, i miociti adulti vengono isolati dalla digestione della collagenasi, resi tolleranti al Ca2+ e quindi aderenti a vetrini di copertura rivestiti di laminina, seguiti da stimolazione elettrica in mezzi privi di siero. Il protocollo generale utilizza miociti cardiaci di ratto adulto, ma può essere facilmente adattato per miociti primari di altre specie. Le alterazioni funzionali nei miociti da cuori feriti possono essere paragonate a miociti fittizi e/o a trattamenti terapeutici in vitro . La metodologia include gli elementi essenziali necessari per la stimolazione dei miociti, insieme alla camera cellulare e ai componenti della piattaforma. Il protocollo dettagliato per questo approccio incorpora le fasi per misurare l'accorciamento a vuoto mediante rilevamento della lunghezza del sarcomero e transitori cellulari Ca2+ misurati con l'indicatore raziometrico Fura-2 AM, nonché per l'analisi dei dati grezzi.

Gli studi sulla funzionalità contrattile vengono eseguiti su miociti di ratto a partire dal giorno dopo l'isolamento (giorno 2) fino a 4 giorni dopo l'isolamento. Sebbene i miociti possano essere registrati il giorno dopo l'isolamento (cioè il giorno 2), sono spesso necessari tempi di coltura più lunghi dopo il trasferimento genico o i trattamenti per modificare la funzione contrattile8. Per i miociti coltivati per più di 18 ore dopo l'isolamento, il protocollo di stimolazione descritto nella sezi...

Viene presentata una serie di protocolli che descrivono la misurazione della funzione contrattile tramite il rilevamento della lunghezza del sarcomero insieme alla misurazione transitoria del calcio (Ca2+) nei miociti isolati di ratto. È inclusa anche l'applicazione di questo approccio per studi su modelli animali di insufficienza cardiaca.

Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca2+ nei miociti dei roditori

Contractile dysfunction and Ca2+ transients are often analyzed at the cellular level as part of a comprehensive assessment of cardiac-induced injury ...

Questo approccio rileva i cambiamenti nella funzione contrattile durante lo sviluppo dell'insufficienza cardiaca. Anche la risposta funzionale nei miociti ai neuroormoni e ai potenziali agenti terapeutici può essere sottoposta a screening. Il posizionamento del miocita può richiedere pratica, ma è essenziale per ottenere una imaging coerente della lunghezza del sarcomero.A dimostrare la procedura è Margaret Westfall, professore associato e ricercatore principale del laboratorio. Prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare un impacco di gel e un supporto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Accendere i componenti della piattaforma della funzione contrattile come menzionato nel manoscritto e assemblare i tubi nella pompa peristaltica.Quindi, trasferire il pacco di gel preriscaldato nel supporto del tubo e accendere il vuoto nell'alimentazione dello stimolatore cellulare. Posizionare un tubo da 50 millilitri con il fluido nel supporto del tubo isolato per iniziare la perfusione a 0,5 millilitri al minuto attraverso il tubo della pompa peristaltica. Quindi, aggiungere due millilitri di fluido preriscaldato a una piccola barca di pesatura e trasferire un vetrino di cop

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Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

Singoli cardiomiociti di topi wild type e mutanti possono essere isolati dal cuore per studiare la loro contrattilità e i transitori del calcio. Ciò consente di caratterizzare il contributo della disfunzione cellulare alla disfunzione cardiaca da qualsiasi causa.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Murine sinistra muscolo papillare ventricolare può essere usato per studiare la contrattilità cardiaca in vitro. Questo articolo descrive in dettaglio l'isolamento e protocolli sperimentali per studiare le caratteristiche contrattili cardiaci.

Misure contrattilità isolati su muscoli papillari per le inchieste sui Cardiac inotropo nei topi

Questo articolo viene descritto il protocollo dettagliato e le attrezzature necessarie per la mappatura ottica doppio di transmembrana potenziale (V m) e senza reticolo intra-sarcoplasmatico (SR) Ca 2+ nel cuore di coniglio Langendorff-perfusione. Questo metodo consente l'osservazione diretta e la quantificazione delle Vm e SR Ca 2+ dinamica nel cuore intatto.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Questo articolo descrive un protocollo che valuta i cambiamenti della sensibilità del miofilamento Ca2+ durante la contrazione in miociti cardiaci isolati dal cuore di ratto. Insieme all'elettrofisiologia cardiaca, ai livelli di citosol sistolico/diastolico Ca2+ e alla contrazione/rilassamento, questa misurazione è fondamentale per sostenere i meccanismi che mediano l'accoppiamento eccitazione-contrazione cardiaca nei cuori sani e malati.

Valutazione della myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilità Alla base Cardiac eccitazione-contrazione Accoppiamento

Presentiamo la metodologia per l'isolamento dei miociti murini e come ottenere tracce di tensione o calcio contemporaneamente con tracce di accorciamento sarcomero utilizzando la fotometria a fluorescenza con misurazioni simultanee della geometria cellulare digitale.

Imaging ottico di miociti Murine Ventricolari isolati

Questo protocollo mira a descrivere passo dopo passo la tecnica di estrazione e valutazione della funzione cardiaca utilizzando cardiomiociti scuoiati. Questa metodologia consente la misurazione e la modifica acuta della funzione di miofilamento utilizzando piccole biopsie congelate che possono essere raccolte da diverse posizioni cardiache, dai topi agli uomini.

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

Presentiamo un protocollo per valutare gli effetti elettromeccanici dell'attivazione di GtACR1 nei cardiomiociti del coniglio. Forniamo informazioni dettagliate sull'isolamento cellulare, la coltura e la trasduzione adenovirale, e sugli esperimenti funzionali con le tecniche patch-clamp e fibra di carbonio.

Valutazione elettromeccanica dell'attività cardiomiocite ottogeneticamente modulata

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Questo protocollo introduce la mappatura ottica a doppio colorante di cuori di topo ottenuti da animali wild-type e knock-in affetti da tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica, comprese le misurazioni elettrofisiologiche del voltaggio transmembrana e dei transitori intracellulari di Ca2+ con un'elevata risoluzione temporale e spaziale.

Mappatura ottica a doppio colorante di cuori da topi knock-in RyR2R2474S di tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica

Qui, viene descritto un metodo consolidato per eseguire misurazioni della contrattilità e del calcio in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando una piattaforma basata sull'ottica. Questa piattaforma consente ai ricercatori di studiare l'effetto delle mutazioni e la risposta a vari stimoli in modo rapido e riproducibile.

Misurazioni in tempo reale dei parametri di calcio e contrattilità in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Scopri come misurare la funzione contrattile nei miociti di ratto attraverso il rilevamento della lunghezza del sarcomero e i transitori di calcio. Questo protocollo consente di studiare la disfunzione cardiaca nelle malattie cardiovascolari.

Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca²⁺ nei miociti dei roditori

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