Name: Uniniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Scopri un modello di demielinizzazione focale stabile nei topi mediante iniezione stereotassica di lisofosfatidilcolina nel corpo calloso. Questo metodo consente di studiare i meccanismi della sclerosi multipla e valutare potenziali terapie.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Sovvenzioni: 82071380, 81873743).

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina. Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 maschi e femmine (wild type, WT; 20-25 g; 8-10 settimane di età). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). I topi sono stati ospitati in una specifica struttura per animali privi di agenti patogeni (SPF) con acqua e cibo forniti ad libitum. Sono stati mantenuti in un periodo alternato di 12 ore di ciclo di luce e buio nelle condizioni standard di temperatura di 22 °C e umidità relativa del 55%-60%.
1. Preparazione della soluzione LPC
<ol><li>Sciogliere 25 mg di polvere di LPC (vedere Tabella dei materiali) con 250 μL di cloroformio e soluzione mista di metanolo (1:1) per ottenere una soluzione LPC al 10% e trasferirla in un tubo centrifugo da 500 μL. NOTA: Se l'LPC non è completamente disciolto, posizionare il tubo della centrifuga in un pulitore ad ultrasuoni e ultrasuoni a 40 kHz per ~ 1 ora per ottenere una soluzione uniforme.</li>
	<li>Dividere la soluzione in 3 μL/tubo e conservare a -80 °C. NOTA: la soluzione può essere conservata per ~ 2 anni.</li>
	<li>Prima dell'intervento chirurgico, diluire la soluzione (fase 1.2.) con 27 μL di soluzione di NaCl allo 0,9% e mantenere la soluzione a bagnomaria a temperatura costante a 37 °C. NOTA: Preparare la soluzione poco prima di iniziare l'iniezione.</li>
</ol>2. Preparazione chirurgica
<ol><li>Utilizzare un ago da 32 G, 2 pollici per collegarlo a una siringa da 5 μL (vedere Tabella dei materiali). Assicurarsi che la siringa del microlitro non sia ostruita. Prelevare 5 μL di soluzione LPC per la preparazione dell'iniezione.</li>
	<li>Anestetizzare il mouse in una camera di induzione collegata ad un vaporizzatore isoflurano con il 3% di isoflurano miscelato con ossigeno al 100% ad una velocità di circa 0,3 L/min.</li>
	<li>Confermare la profondità dell'anestesia dalla mancanza del riflesso del pizzico della punta mentre la respirazione è liscia.</li>
	<li>Rasare la testa del mouse tra le orecchie usando un rasoio elettrico. Applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza corneale durante la procedura.</li>
	<li>Quindi, posizionare il mouse in una cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali) con il lato dorsale verso l'alto e fissare la testa con un cono nasale e un morsetto dentale. Mantenere l'anestesia con 1,2% -1,6% di isoflurano attraverso il naso. NOTA: La concentrazione di isoflurano può essere regolata in base allo stato respiratorio dei topi.</li>
</ol>3. Procedura chirurgica
NOTA: gli animali vengono posizionati su una piastra riscaldante durante tutte le procedure.
<ol><li>Fissare il mouse all'apparato stereotassico con barre auricolari bilaterali. Assicurarsi che le barre auricolari siano livellate e che la testa sia orizzontale e stabile.</li>
	<li>Disinfettare la pelle della testa pulendo più volte con iodoforo seguito da alcool in movimento circolare. Quindi utilizzare un bisturi per tagliare una piccola incisione di circa 1,5 cm lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.</li>
	<li>Pulire il cranio con un batuffolo di cotone immerso nell'1% di perossido di idrogeno fino a quando la bregma, la lambda e la fontanella posteriore sono esposte. Posizionare la siringa sull'apparecchio stereotassico. NOTA: Utilizzare il perossido di idrogeno con cura ed evitare di toccare i tessuti circostanti.</li>
	<li>Garantire il posizionamento orizzontale della testa dell'animale (sia anteriore che posteriore e sinistra e destra).<ol><li>Regolare la manopola dell'asse Z del telaio stereotassico in modo che la punta dell'ago e il cranio tocchino senza piegarsi, quindi misurare la coordinata dell'asse Z. Controllare le coordinate Z di bregma e fontanella posteriore.</li>
		<li>Regolare la barra auricolare in modo che la differenza tra le coordinate Z di bregma e fontanella posteriore non sia superiore a 0,02 mm. Quindi, seguire lo stesso metodo per misurare le coordinate Z delle posizioni corrispondenti sui lati sinistro e destro della linea mediana. Regola la barra delle orecchie per assicurarti che la sinistra e la destra siano allo stesso livello.</li>
	</ol></li>
	<li>Individuare il corpo calloso. Impostare l'origine XYZ su bregma. NOTA: il primo sito di iniezione è di 1,0 mm laterale al bregma, profondo 2,4 mm e anteriore di 1,1 mm. Il secondo sito di iniezione è laterale di 1,0 mm rispetto al bregma, profondo 2,1 mm e anteriore di 0,6 mm. Ad esempio, la coordinata del bregma è (0,0,0). Misurare la coordinata Z della posizione corrispondente contrassegnata come (-1, 1.1, X) e (-1, 0.6, Y). Si può determinare che la prima coordinata del sito di iniezione del corpo calloso è (-1, 1.1, −[X + 2.4]), e il secondo sito di iniezione è (-1, 0.6, −[Y + 2.1]).</li>
	<li>Una volta determinato il sito di iniezione, fare un segno con un marcatore sterile sul cranio e registrare le coordinate.</li>
	<li>Forare delicatamente il sito contrassegnato con un trapano a teschio (vedere Tabella dei materiali). Fare attenzione ad evitare qualsiasi sanguinamento.</li>
	<li>Spostare lentamente l'ago alle coordinate indicate e iniziare l'iniezione. Per indurre la demielinizzazione del corpo calloso, iniettare 2 μL di soluzione di LPC (fase 1.) in ogni sito di iniezione (fase 3.5.) ad una velocità di 0,4 μL/min.</li>
	<li>Dopo l'iniezione, tenere l'ago in ogni sito per altri 10 minuti. NOTA: Assicurarsi che l'intervallo di due iniezioni non sia superiore a 20 minuti.</li>
	<li>Sutura la pelle con una sutura 4-0 e attendi che l'animale si svegli entro 10 minuti. Somministrare analgesici postoperatoriamente in conformità con le normative istituzionali sulla cura degli animali. NOTA: Il tempo raccomandato per l'eutanasia può essere determinato in base allo scopo dell'esperimento.</li>
</ol>4. Estrazione del campione per la demielinizzazione focale
NOTA: per i dettagli relativi a questo passaggio, consultare il rapporto14 pubblicato in precedenza.
<ol><li>Sciogliere il colorante rosso neutro (vedere Tabella dei materiali) in una soluzione all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>ore prima di sacrificare i topi (per i dettagli, vedere il riferimento precedente10), iniettare 500 μL di colorante rosso neutro all'1% in PBS mediante iniezione intraperitoneale per ciascun topo.</li>
	<li>Eseguire la perfusione cardiaca12 con 30 ml di PBS allo 0,1% preraffreddati a 4 °C.</li>
	<li>Taglia il cervello in 1 mm con uno stampo cerebrale (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Visualizzare la lesione macchiata di rosso neutro al microscopio e dissociare la lesione. NOTA: Rimuovere il più possibile il tessuto normale circostante per migliorare l'accuratezza dell'analisi successiva. Il tessuto della lesione può essere esaminato con RT-PCR, microscopia elettronica e analisi western blot.</li>
</ol>5. Colorazione istologica e immunofluorescenza
<ol><li>Per la colorazione istologica e l'immunofluorescenza12, dopo la perfusione cardiaca (fase 4.3.), rimuovere il cervello10, fissare in PFA al 4% durante la notte (a 4 °C) e disidratare completamente in saccarosio al 30%.</li>
	<li>Tagliare in sezioni coronali del cervello di 20 mm utilizzando un'affettatricecongelata 10 a temperatura costante (-20 °C).</li>
	<li>Utilizzare le fette per la colorazione Luxol fast blue (LFB), l'immunofluorescenza e il western blot10.</li>
</ol>

<ol><li>Gaire, B. P., Choi, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+lysophospholipid+receptors+in+activation+of+neuroglia+and+their+neuroinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+mechanisms+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).</li>
<li>Filippi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43(2018).</li>
<li>Villoslada, P., Steinman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+targets+and+therapeutics+for+neuroprotection%2C+remyelination+and+repair+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).</li>
<li>Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+the+CNS%3A+From+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Remyelination in the CNS: From biology to therapy.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).</li>
<li>Gentile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+exercise+in+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+microglial+Hv1+channel+is+associated+with+activation+of+autophagic+pathway+and+ROS+production+in+LPC-induced+demyelination+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+easily+reproducible+model+of+focal+white+matter+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).</li>
<li>Blakemore, W. F., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+experimental+models+of+toxin-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).</li>
<li>Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+relaxation+characteristics+during+preacute+stage+of+lysophosphatidyl+choline-induced+demyelinating+lesion+in+rat+brain%3A+An+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis.</a> Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination%3A+A+primary+lipid+disrupting+myelinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy.</a> Glia. 66 (2), 327-347 (2018).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Kassis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+expression+in+white+matter+oligodendrocytes+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke.</a> Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).</li>
<li>Vorhees, C. V., Williams, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morris+water+maze%3A+Procedures+for+assessing+spatial+and+related+forms+of+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory.</a> Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).</li>
<li>Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+focal+EAE+model+of+cortical+demyelination%3A+multiple+sclerosis-like+lesions+with+rapid+resolution+of+inflammation+and+extensive+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination.</a> Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+macrophages+in+progressive+multiple+sclerosis%3A+Relationship+to+neurodegeneration+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Kutzelnigg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+and+diffuse+white+matter+injury+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis.</a> Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).</li>
<li>Lassmann, H., Bradl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%3A+Experimental+models+and+reality%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis: Experimental models and reality).</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).</li>
<li>Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).</li>
<li>Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model+for+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurologica+Scandinavica.+Supplementum%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model for demyelination.</a> Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).</li>
<li>Zhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cuprizone+model%3A+Dos+and+do+nots%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The cuprizone model: Dos and do nots.</a> Cells. 9 (4), 843(2020).</li>
<li>Torre-Fuentes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+demyelination+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologia+%28Barcelona%2C+Spain%29%22%5BJournal%5D)">Experimental models of demyelination and remyelination.</a> Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).</li>
<li>Merkler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-induced+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+the+common+marmoset+reflects+the+immunopathology+of+pattern+II+multiple+sclerosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Journal%22%5BJournal%5D)">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions.</a> Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).</li>
<li>Ucal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+cortical+demyelination+of+both+hemispheres+can+be+induced+by+injection+of+pro-inflammatory+cytokines+via+an+implanted+catheter+in+the+cortex+of+MOG-immunized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats.</a> Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La SM, una malattia demielinizzante cronica del SNC, è una delle cause più comuni di disfunzione neurologica nei giovani adulti20. Clinicamente, circa il 60%-80% dei pazienti con SM sperimenta il ciclo di recidive e remissioni prima di sviluppare una SM21,22 secondaria-progressiva, e alla fine porta a disturbi cumulativi del movimento e deficit cognitivi nel tempo23. Attualmente, nessun singolo modello sperimentale ...

La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore coinvolge diversi processi fisiologici di quasi tutti i sistemi di organi1. Nel sistema nervoso centrale (SNC), questa segnalazione svolge un ruolo fondamentale nella patogenetà delle malattie neurologiche autoimmuni come la sclerosi multipla (SM). La sclerosi multipla è una malattia cronica immuno-mediata caratterizzata da demielinizzazione patologica e risposta infiammatoria, che causa disfunzione neurologica e deterioramento cognitivo 2,3. Dopo continue recidive e remittenti durante la malattia precoce, la maggior parte dei pazienti alla fine progredisce allo stadio secondario-progressivo, che potrebbe causare danni irreversibili al cervello e conseguente disabilità4. Si ritiene che il segno patologico del decorso secondario-progressivo sia la demielinizzazione delle placche causate da lesioni infiammatorie5. I trattamenti esistenti per la SM possono ridurre significativamente il rischio di recidiva. Tuttavia, non esiste ancora una terapia efficace per il danno demielinizzante a lungo termine causato dalla SM6 progressiva. Pertanto, è necessario un modello stabilmente stabilito e facilmente riproducibile per studiare terapie precliniche che si concentrano sulla degenerazione della sostanza bianca.
La demielinizzazione e la rimielinizzazione sono due importanti processi patologici nello sviluppo della sclerosi multipla. La demielinizzazione è la perdita della guaina mielinica intorno agli assoni indotta da microglia con fenotipi pro-infiammatori7, e porta a una lenta conduzione degli impulsi nervosi e provoca la perdita di neuroni e disturbi neurologici. La rimielinizzazione è una risposta di riparazione endogena mediata da oligodendrociti, in cui i disturbi potrebbero portare a neurodegenerazione e deterioramento cognitivo8. La risposta infiammatoria è cruciale per l'intero processo, influenzando sia il grado di danno mielinico che la riparazione.
Pertanto, un modello animale stabile di demielinizzazione infiammatoria persistente è significativo per un'ulteriore esplorazione delle strategie terapeutiche per la SM. A causa della complessità della SM, sono stati stabiliti vari tipi di modelli animali per imitare le lesioni demielinizzanti in vivo, tra cui l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), i modelli tossico-demielinizzanti, il cuprizone (CPZ) e la lisofosfatidilcolina (LPC)9 . LPC è un lisofosfolipide endogeno associato all'infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Sulla base di precedenti rapporti e ricerche10,11, viene fornito un protocollo dettagliato di iniezione a due punti con alcune modifiche. Generalmente, il classico modello di iniezione LPC a un punto produce solo demielinizzazione locale nel sito di iniezione ed è spesso accompagnato da rimielinizzazione spontanea12,13. Tuttavia, il modello LPC a iniezione a due punti può dimostrare che l'LPC può indurre direttamente demielinizzazione nel corpo calloso del topo e causare demielinizzazione più duratura con poca rigenerazione della mielina.

<table><tbody><tr><td>L-&alfa;-Lisofosfatidilcolina da tuorlo d'uovo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td>32 gauge Ago</td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l siringa</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>trapano cranio ad alta velocità</td><td>forte, corea</td><td>strong204</td><td></td></tr><tr><td>trapano</td><td>Hager & Meisinger, Germania&nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Matrx Ventilatore per anestesia animale</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Strumento stereotassico portatile per topi</td><td>Reward</td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>Micro siringa</td><td>Reward</td><td>KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL fast bLue</td><td>Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>Stampo cerebrale</td><td>Reward</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Fissativo</td> <td>per microscopio elettronicoServicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rosso neutro (C.I. 50040), per microscopia Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-proteina basica della mielina&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr> Anticorpo monoclonale <tr><td>anti-GST-P pAb</td><td>MBL</td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (SolA15)</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific</td><td>14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale beta actina</td><td>Proteintech</td><td>66009-1-ig&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Proteina di base della mielina Anticorpo policlonale</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 Anticorpo policlonale</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; AffiniPure&nbsp; Asino anti-Coniglio&nbsp; IgG (H+L)</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594&nbsp; AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP Capra Anti-Coniglio IgG (H+L)</td><td>abclonale</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Capra Anti-Topo IgG (H+L)&nbsp;</td><td>abclonale</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Adulto C57BL / 6 topi maschi e femmine</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un'iniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie neurologiche, in particolare la sclerosi multipla (SM). La lisofosfatidilcolina (LPC) è un lisofosfolipide endogeno associato all'infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per l'iniezione stereotassica di LPC a due punti che potrebbe causare direttamente una grave demielinizzazione e replicare la lesione da demielinizzazione sperimentale in modo rapido e stabile nei topi mediante procedura chirurgica. Pertanto, questo modello è molto rilevante per le malattie da demielinizzazione, in particolare la SM, e può contribuire al relativo avanzamento della ricerca clinicamente rilevante. Inoltre, l'immunofluorescenza e i metodi di colorazione blu veloce Luxol sono stati utilizzati per rappresentare il decorso temporale della demielinizzazione nel corpo calloso dei topi iniettati con LPC. Inoltre, il metodo comportamentale è stato utilizzato per valutare la funzione cognitiva dei topi dopo la modellazione. Nel complesso, l'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico è un metodo stabile e riproducibile per generare un modello di demielinizzazione nei topi per ulteriori studi.

L'iniezione a due punti dell'LPC ha determinato una demielinizzazione più duratura LPC porta principalmente a danni rapidi con tossicità alla mielina e scissione dell'integrità dell'assone15. Il giorno dell'iniezione è stato considerato come giorno 0. I topi sono stati conservati per un periodo di 10-28 giorni (10 dpi e 28 dpi). La colorazione Luxol fast blue (LFB)10 è stata utilizzata per valutare l'area di demielinizzazione nei topi in questi punti tem...

Il presente protocollo descrive un'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico per generare un modello di demielinizzazione stabile e riproducibile nei topi.

Un'iniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Il nostro modello è molto rilevante per le malattie demielinizzanti, in particolare la sclerosi multipla. E può contribuire al relativo avanzamento della ricerca clinicamente rilevante. È un protocollo dettagliato che potrebbe causare direttamente una grave demielinizzazione in modo rapido e stabile nei topi mediante procedura chirurgica.Quando provi questa tecnica per la prima volta, sii paziente e assicurati che le coordinate siano accurate. Iniziare collegando un ago da 32 gauge a una siringa da 5 microlitri. Prelevare 5 microlitri di soluzione LPC per la preparazione dell'iniezione.Quindi, confermare la profondità dell'anestesia del mouse dalla mancanza di riflesso del pizzico della punta mentre la respirazione è regolare. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica con il lato dorsale verso l'alto e fissare la testa con un cono del naso e un morsetto per denti. Fissare il mouse all'apparato stereotassico con barre auricolari bilaterali.Assicurarsi che le barre auricolari siano livellate e che la testa sia orizzontale e stabile. Disinfettare la pelle della testa strofinando con iodoporo. Quindi utilizzare il bisturi per tagliare una piccola incisione a circa 1,5 centimetri lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.Pulire l'abilità con un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno all'1% fino a quando il bregma, la lambda e la fontanella posteriore sono esposti. Posizionare la siringa sull'apparecchio stereotassico. Assicurarsi il posizionamento orizzontale della testa dell'animale e individuare il corpo calloso.Una volta determinato il sito di iniezione, registrare le coordinate e fare un segno con un marcatore sul cranio. Forare delicatamente il sito contrassegnato con un trapano a teschio. Fare attenzione ad evitare qualsiasi sanguinamento.Spostare lentamente l'ago sulle coordinate indicate. Per indurre la demielinizzazione del corpo calloso, iniettare 2 microlitri di soluzione LPC in ciascun sito di iniezione ad una velocità di 0,4 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, tenere l'ago in ogni sito per altri 10 minuti.Infine, sutura la pelle con una sutura 4-0 e attendi che l'animale si svegli entro 10 minuti. L'immagine rappresentativa mostra il rilevamento delle legioni di materia bianca tramite la colorazione blu veloce Luxol. Dai risultati, la demielinizzazione stabile del corpo calloso può essere osservata a 10 e 28 giorni dopo l'iniezione.La quantificazione dell'area di demielinizzazione in diversi punti temporali è mostrata qui. Attraverso la colorazione immunofluorescenziale della proteina basica della mielina degradata, è stato osservato un notevole aumento di dMBP nel gruppo iniettato con LPC a 10 giorni dopo l'iniezione, che rappresenta la perdita di mielina nel corpo calloso. L'analisi Western blot dell'espressione della proteina basica della mielina, o MBP, ha mostrato una significativa perdita di MBP dopo l'iniezione di LPC.La beta-actina è stata utilizzata come controllo di carico per misurare l'espressione basale. Le immagini al microscopio elettronico confermano l'ultrastruttura mielinica nel corpo calloso del gruppo sham e del gruppo iniettato da LPC. GST-pi è il marker della maturazione della differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti, o OPC.Dopo 10 giorni di iniezione di LPC, il GST-pi è diminuito rispetto al gruppo sham. Allo stesso tempo, la capacità di proliferazione degli oligodendrociti può essere riflessa dal rapporto tra oligodendrociti proliferano e cellule totali della linea oligodendrocitaria. Il rapporto più elevato rappresenta una maggiore proliferazione degli oligodendrociti dopo 10 giorni dall'iniezione.Le immagini rappresentative mostrano il percorso di nuoto dei topi in ogni gruppo, in presenza della piattaforma e dopo aver rimosso la piattaforma. I risultati suggeriscono che la memoria spaziale dei topi demielinizzati è significativamente compromessa nel modello di iniezione LPC a due punti. Durante il tentativo di questa procedura, assicurarsi che la velocità di iniezione sia accurata e tenere l'ago in ciascun sito per altri 10 minuti.

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Neuroscienze

Il video dimostra l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino iniettando una combinazione di glicoproteine oligodendrocitarie mieliniche e Mycobacterium tuberculosis inattivato. Il modello consente ai ricercatori di studiare i meccanismi della malattia e testare gli interventi terapeutici.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Questo video dimostra la procedura di accesso chirurgico al nervo ottico in un animale anestetizzato e la somministrazione precisa di lisolecitina per indurre la demielinizzazione focale, creando condizioni neuropatologiche per ulteriori studi.

Induzione della demielinizzazione locale nel nervo ottico mediante lisolecitina

In questo video, un modello murino di sclerosi multipla viene stabilito utilizzando l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Al topo viene iniettata un'emulsione contenente un peptide neuronale e un adiuvante, innescando una risposta immunitaria che attiva le cellule T autoreattive. Questo è seguito da un'iniezione di tossina della pertosse (PTX) per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo alle cellule T autoreattive di infiltrarsi nel cervello. Questa...

Questo video mostra la generazione di un modello murino di demielinizzazione focale utilizzando un'iniezione di lisofosfatidilcolina (LPC) a due punti. Il cranio di un topo anestetizzato è esposto. Vengono determinate le coordinate di iniezione e viene praticato un foro per consentire le iniezioni di LPC in siti mirati. L'LPC induce la demielinizzazione focale dei neuroni attraverso l'infiammazione, mentre un'iniezione a due punti ne garantisce la sostenibilità.

Definizione di un modello murino di demielinizzazione focale tramite un'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina

Questo video mostra il metodo per indurre la demielinizzazione nei neuroni del midollo spinale di topo utilizzando iniezioni di lisolecitina, seguita dalla rimielinizzazione attraverso la migrazione e la differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti. Il processo compromette e quindi ripristina gradualmente la trasmissione del segnale neuronale.

Demielinizzazione e rimielinizzazione dei neuroni del midollo spinale di topo

Fonte: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelinning Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra il metodo per la somministrazione di farmaci neuroterapeutici utilizzando una pompa osmotica in un modello murino demielinizzato. Il rilascio controllato del farmaco promuove la rimielinizzazione attivando le cellule produttrici di mielina nel corpo calloso.

 Somministrazione di farmaci neuroterapeutici basata su pompa osmotica in un modello murino demielinizzato

Un nuovo ex vivo preparazione per l'imaging del midollo spinale di topo. Questo protocollo consente a due fotoni imaging interazioni cellulari vivi tutto il midollo spinale.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Le malattie demielinizzanti possono essere modellate negli animali mediante l'applicazione focale di lisolecitina nel SNC. Una singola iniezione di lisolecitina nel midollo spinale del topo produce una lesione che si ripara spontaneamente nel tempo. L'obiettivo è studiare i fattori coinvolti nella de- e rimielinizzazione e testare agenti per migliorare la riparazione.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Il protocollo qui presentato consente la riproduzione di una diffusa demielinizzazione della materia grigia di entrambi gli emisferi corticali nei ratti Dark Agouti maschi adulti. Il metodo comprende l'impianto intracerebrale di un catetere, l'immunizzazione subclinica contro la glicoproteina degli oligodendrociti mielinici e l'iniezione intracerebrale di una miscela di citochine pro-infiammatorie attraverso il catetere impiantato.

Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

La demielinizzazione avviene in più malattie del sistema nervoso centrale. Una tecnica affidabile di somministrazione di farmaci in vivo è necessaria per i test antidroga rimielinizzanti. Questo protocollo descrive un metodo basato su pompa osmotica che consente la somministrazione di farmaci a lungo termine direttamente nel parenchima cerebrale e migliora la biodisponibilità del farmaco, con ampia applicazione nella ricerca sulla rimielinizzazione.

Somministrazione di farmaci a base di pompa osmotica per la ricerca sulla rimielinizzazione in vivo sul sistema nervoso centrale

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Scopri un modello di demielinizzazione focale stabile nei topi mediante iniezione stereotassica di lisofosfatidilcolina nel corpo calloso. Questo metodo consente di studiare i meccanismi della sclerosi multipla e valutare potenziali terapie.

Un'iniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi

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