Un'iniezione a due punti stabilmente stabilita del modello di demielinizzazione focale indotta da lisofosfatidilcolina nei topi
11 maggio 2022
Il presente protocollo descrive un'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico per generare un modello di demielinizzazione stabile e riproducibile nei topi.
Il nostro modello è molto rilevante per le malattie demielinizzanti, in particolare la sclerosi multipla. E può contribuire al relativo avanzamento della ricerca clinicamente rilevante. È un protocollo dettagliato che potrebbe causare direttamente una grave demielinizzazione in modo rapido e stabile nei topi mediante procedura chirurgica.
Quando provi questa tecnica per la prima volta, sii paziente e assicurati che le coordinate siano accurate. Iniziare collegando un ago da 32 gauge a una siringa da 5 microlitri. Prelevare 5 microlitri di soluzione LPC per la preparazione dell'iniezione.
Quindi, confermare la profondità dell'anestesia del mouse dalla mancanza di riflesso del pizzico della punta mentre la respirazione è regolare. Posizionare il mouse nella cornice stereotassica con il lato dorsale verso l'alto e fissare la testa con un cono del naso e un morsetto per denti. Fissare il mouse all'apparato stereotassico con barre auricolari bilaterali.
Assicurarsi che le barre auricolari siano livellate e che la testa sia orizzontale e stabile. Disinfettare la pelle della testa strofinando con iodoporo. Quindi utilizzare il bisturi per tagliare una piccola incisione a circa 1,5 centimetri lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.
Pulire l'abilità con un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno all'1% fino a quando il bregma, la lambda e la fontanella posteriore sono esposti. Posizionare la siringa sull'apparecchio stereotassico. Assicurarsi il posizionamento orizzontale della testa dell'animale e individuare il corpo calloso.
Una volta determinato il sito di iniezione, registrare le coordinate e fare un segno con un marcatore sul cranio. Forare delicatamente il sito contrassegnato con un trapano a teschio. Fare attenzione ad evitare qualsiasi sanguinamento.
Spostare lentamente l'ago sulle coordinate indicate. Per indurre la demielinizzazione del corpo calloso, iniettare 2 microlitri di soluzione LPC in ciascun sito di iniezione ad una velocità di 0,4 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, tenere l'ago in ogni sito per altri 10 minuti.
Infine, sutura la pelle con una sutura 4-0 e attendi che l'animale si svegli entro 10 minuti. L'immagine rappresentativa mostra il rilevamento delle legioni di materia bianca tramite la colorazione blu veloce Luxol. Dai risultati, la demielinizzazione stabile del corpo calloso può essere osservata a 10 e 28 giorni dopo l'iniezione.
La quantificazione dell'area di demielinizzazione in diversi punti temporali è mostrata qui. Attraverso la colorazione immunofluorescenziale della proteina basica della mielina degradata, è stato osservato un notevole aumento di dMBP nel gruppo iniettato con LPC a 10 giorni dopo l'iniezione, che rappresenta la perdita di mielina nel corpo calloso. L'analisi Western blot dell'espressione della proteina basica della mielina, o MBP, ha mostrato una significativa perdita di MBP dopo l'iniezione di LPC.
La beta-actina è stata utilizzata come controllo di carico per misurare l'espressione basale. Le immagini al microscopio elettronico confermano l'ultrastruttura mielinica nel corpo calloso del gruppo sham e del gruppo iniettato da LPC. GST-pi è il marker della maturazione della differenziazione delle cellule precursori degli oligodendrociti, o OPC.
Dopo 10 giorni di iniezione di LPC, il GST-pi è diminuito rispetto al gruppo sham. Allo stesso tempo, la capacità di proliferazione degli oligodendrociti può essere riflessa dal rapporto tra oligodendrociti proliferano e cellule totali della linea oligodendrocitaria. Il rapporto più elevato rappresenta una maggiore proliferazione degli oligodendrociti dopo 10 giorni dall'iniezione.
Le immagini rappresentative mostrano il percorso di nuoto dei topi in ogni gruppo, in presenza della piattaforma e dopo aver rimosso la piattaforma. I risultati suggeriscono che la memoria spaziale dei topi demielinizzati è significativamente compromessa nel modello di iniezione LPC a due punti. Durante il tentativo di questa procedura, assicurarsi che la velocità di iniezione sia accurata e tenere l'ago in ciascun sito per altri 10 minuti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un'iniezione in due punti di lisofosfatidilcolina (LPC) mediante l'uso di una struttura stereotassica per creare un modello stabile di demielinizzazione nei topi. Fornisce un metodo utile per lo studio delle malattie demielinizzanti, in particolare della sclerosi multipla, permettendo ricerche sui meccanismi e sulle conseguenze della demielinizzazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sulla demielinizzazione
- Modelli murini di malattia
Sfondo
- Comprendere la demielinizzazione è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti per malattie come la sclerosi multipla.
- La procedura descritta ha lo scopo di indurre una demielinizzazione rapida e riproducibile in condizioni di laboratorio.
- Una tecnica chirurgica accurata è importante per il successo della procedura.
- Analisi istologiche come la colorazione con azzurro di Luxol vengono utilizzate per valutare il modello.
Scopo dello studio
- Stabilire un modello affidabile per lo studio dei meccanismi della demielinizzazione.
- Facilitare la ricerca su possibili interventi terapeutici per le condizioni correlate alla demielinizzazione.
- Fornire protocolli chirurgici dettagliati che producano risultati quantificabili.
Metodi Utilizzati
- Il modello prevede un approccio chirurgico stereotassico per le iniezioni di LPC.
- I topi vengono iniettati con soluzione di LPC in precise localizzazioni anatomiche, mirando specificamente al corpo calloso.
- Ogni iniezione prevede 2 microlitri di LPC somministrati a un tasso controllato.
- Valutazioni post-operatorie a 10 e 28 giorni forniscono misurazioni fondamentali degli esiti.
- Tecniche istologiche come immunofluorescenza e Western blotting vengono utilizzate per analizzare la perdita di mielina.
Risultati principali
- È stata ottenuta una demielinizzazione stabile nel corpo calloso, osservabile mediante colorazione istologica in diversi punti temporali.
- Un aumento di marcatori indicativi della perdita di mielina è stato confermato attraverso diverse analisi.
- Le valutazioni comportamentali hanno indicato deficit significativi nella memoria spaziale a seguito della demielinizzazione.
- I risultati suggeriscono alterazioni nella proliferazione e differenziazione degli oligodendrociti in risposta al trattamento con LPC.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce con successo un modello per esplorare la dinamica della demielinizzazione e potenziali strategie terapeutiche.
- I risultati offrono spunti sui meccanismi neuronali alla base della demielinizzazione e sul ruolo degli oligodendrociti.
- Questo modello potrebbe approfondire la comprensione della sclerosi multipla e di condizioni simili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il modello stabile di iniezione intrapontina a due punti consente un'induzione rapida e riproducibile di demielinizzazione focale nei topi, sostenendo direttamente la ricerca nella fase di scoperta sulle malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla. Questo modello fornisce una piattaforma solida per la riduzione del rischio meccanicistico, la validazione di bersagli e la valutazione quantitativa della perdita e del ripristino della mielina. La sua riproducibilità e i risultati quantitativi lo posizionano come strumento fondamentale per la valutazione preclinica e la selezione di portafogli nei percorsi di malattie neuroinfiammatorie.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi dei meccanismi di demielinizzazione e del coinvolgimento delle vie biologiche in sistemi rilevanti per la malattia.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi quantificando la perdita di mielina e le risposte degli oligodendrociti.
- Facilita la previsione attendibile nei test di ipotesi terapeutiche per condizioni neuroinfiammatorie.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un sistema in vivo validato per lo screening di composti successivi mirati alla rimielinizzazione o alla neuroprotezione.
- Permette una demielinizzazione standardizzata e riproducibile, adatta per saggi istologici e comportamentali quantitativi.
- Consente una valutazione affidabile di interventi sperimentali mediante endpoint misurabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea alla patologia clinicamente rilevante osservata nella sclerosi multipla, favorendo lo sviluppo di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dalla scoperta dei meccanismi alla validazione preclinica di strategie terapeutiche.
- Riduce il rischio biologico modellando la demielinizzazione acuta e il deficit funzionale in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, collegando studi meccanicistici precoci con la ricerca traslazionale nelle malattie demielinizzanti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi attraverso l'analisi quantificabile della demielinizzazione e degli oligodendrociti.
- Screening: Fornisce output pronti per saggi, riproducibili, per la valutazione di composti e studi di risposta alla dose.
- Analisi: Permette la misurazione quantitativa della perdita di mielina, dell'espressione proteica e dei deficit comportamentali per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Modella endpoint rilevanti per la malattia al fine di allineare biomarcatori e validare preclinicamente.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma standardizzata e riutilizzabile in vivo per numerosi programmi di ricerca neuroinfiammatoria.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulla demielinizzazione.
- Valore operativo: Fornisce modellizzazione in vivo standardizzata, riproducibile e scalabile per un utilizzo trasversale ai programmi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale fornendo dati preclinici solidi.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione e la progressione di asset per malattie neuroinfiammatorie con un adeguamento al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chirurgia stereotassica e un preciso indirizzamento anatomico nei topi.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per analisi istologiche, di immunofluorescenza e comportamentali.
- Necessita di una standardizzazione tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda le coordinate di iniezione e la velocità, al fine di garantire la riproducibilità.
- L'adattamento ad altre regioni del sistema nervoso centrale o a modelli di malattia diversi potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- Il modello riflette principalmente una demielinizzazione acuta; studi sulla cronicizzazione o sulla rimielinizzazione potrebbero richiedere ulteriori validazioni.
