Name: CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Impara a modificare geneticamente le cellule staminali ematopoietiche con CRISPR/Cas9 preservandone la stemness in coltura. Questo protocollo ottimizzato migliora l'impianto delle cellule modificate per terapie geniche contro malattie monogeniche e HIV.

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Gli autori vogliono riconoscere il personale della struttura di citometria a flusso e della struttura per animali di CSCR. A. C. è finanziato da una borsa di studio ICMR-SRF, K. V. K. è finanziato da una borsa di studio DST-INSPIRE e P. B. è finanziato da una borsa di studio CSIR-JRF. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India (sovvenzione n. BT / PR26901 / MED / 31/377 / 2017 e BT / PR31616 / MED / 31/408 / 2019)

<ol><li>Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+stem-cell-based+gene+therapy+for+inherited+disorders%3A+State+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+hematopoiesis%3A+Current+stage+of+clinical+translation+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).</li>
<li>Srivastava, A., Shaji, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cure+for+thalassemia+major+-+From+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy.</a> Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).</li>
<li>Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+developmental+gamma-globin+gene+expression%3A+An+approach+for+healing+hemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies.</a> Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).</li>
<li>Mazurier, F., Gan, O. I., McKenzie, J. L., Doedens, M., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+clonal+tracking+reveals+intrinsic+heterogeneity+in+the+human+hematopoietic+stem+cell+compartment+and+culture-induced+stem+cell+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated clonal tracking reveals intrinsic heterogeneity in the human hematopoietic stem cell compartment and culture-induced stem cell impairment.</a> Blood. 103 (2), 545-552 (2004).</li>
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<li>Karuppusamy, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCR5+gene+edited+CD34%2B+CD90%2B+hematopoietic+stem+cell+population+serves+as+an+optimal+graft+source+for+HIV+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The CCR5 gene edited CD34+ CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy.</a> Frontiers in Immunology. 13, 792684(2022).</li>
<li>Hopman, R. K., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+stem+cell+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in stem cell mobilization.</a> Blood reviews. 28 (1), 31-40 (2014).</li>
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<li>Antoniani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+fetal+hemoglobin+synthesis+by+CRISPR%2FCas9-mediated+editing+of+the+human+b-globin+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human b-globin locus.</a> Blood. 131 (17), 1960-1973 (2018).</li>
<li>Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+gene-editing+approaches+for+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).</li>
<li>Bagchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+immortalized+erythroid+progenitor+cell+lines+from+peripheral+blood+mononuclear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Direct generation of immortalized erythroid progenitor cell lines from peripheral blood mononuclear cells.</a> Cells. 10 (3), 1-18 (2021).</li>
<li>Ravi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+HPFH-like+mutations+by+CRISPR+base+editing+that+elevates+the+expression+of+fetal+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin.</a> eLife. 11, 65421(2020).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
<li>Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+asphyxia+on+the+development+of+synaptic+junctions+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica+Japonica%3B+Overseas+Edition%22%5BJournal%5D)">Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice.</a> Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).</li>
<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-receptors+as+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Fc-receptors as regulators of immunity.</a> Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non esistono interessi finanziari concorrenti.

L'esito positivo della terapia genica HSPC si basa prevalentemente sulla qualità e quantità di HSC innestabili nell'innesto. Tuttavia, le proprietà funzionali delle HSC sono fortemente influenzate durante la fase preparatoria dei prodotti di terapia genica, compresa la coltura in vitro e la tossicità associata alla procedura di manipolazione genica. Per superare questi limiti, abbiamo identificato condizioni di coltura ideali per HSPC che mantengono la staminalità delle HSC CD34+CD133+CD90+...

L'inaccessibilità ai donatori compatibili con l'antigene leucocitario umano (HLA) in contesti di trapianto allogenico e il rapido sviluppo di strumenti di ingegneria genetica altamente versatili e sicuri rendono il trapianto di cellule staminali ematopoietiche autologhe (HSCT) una strategia di trattamento curativo per le malattie ereditarie del sangue 1,2. La terapia genica con cellule staminali e progenitrici ematopoietiche autologhe (HSPC) comporta la raccolta di HSPC dei pazienti, la manipolazione genetica, la correzione delle mutazioni che causano malattie e il trapianto di HSPC geneticamente corretti nel paziente 3,4. Tuttavia, l'esito positivo della terapia genica si basa sulla qualità dell'innesto geneticamente modificato trapiantabile. Le fasi di manipolazione genica e la coltura ex vivo delle HSPC influenzano la qualità del trapianto diminuendo la frequenza delle cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs), rendendo necessaria l'infusione di grandi dosi di HSPC manipolate genicamente 2,5,6.
Diverse piccole molecole, tra cui SR1 e UM171, sono attualmente impiegate per espandere le HSPC del sangue del cordone ombelicale in modo robusto 7,8. Per le HSPC adulte, a causa della maggiore resa cellulare ottenuta alla mobilizzazione, non è richiesta una robusta espansione. Tuttavia, mantenere la staminalità delle HSPC isolate in coltura ex vivo è fondamentale per le sue applicazioni di terapia genica. Pertanto, un approccio incentrato sull'arricchimento in coltura delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) viene sviluppato utilizzando una combinazione di piccole molecole: resveratrolo, UM729 e SR1 (RUS)7. Le condizioni di coltura ottimizzate di HSPC promuovono l'arricchimento delle HSC, con conseguente aumento della frequenza di HSC geneticamente modificate in vivo, e riducono la necessità di manipolare genicamente grandi dosi di HSPC, facilitando approcci di terapia genica economicamente vantaggiosi8.
Qui viene descritto un protocollo completo per la coltura di HSPC, insieme all'infusione e all'analisi di cellule geneticamente modificate in vivo.

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&reg; X Unità</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&commercio; X Kit ( Nucleocuvette a 16 pozzetti&trade; Strisce)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD13 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555394 <tr><td>Anti-umano CD19 PerCP</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>Anti-umano CD3 PE-Cy7</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561971 <tr><td>Anti-umano CD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>Anti-topo CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Irradator-2000</td><td>&nbsp; BRIT (Dipartimento di Biotecnologie, India)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari (piastre a 6 pozzetti con trattamento superficiale delta)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife solutions</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg/10mL)</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it Ricombinante Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Provetta da centrifuga-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Provetta da centrifuga-50ml</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAasi</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato - 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Kit di selezione positiva CD34 umano II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>Magnete EasySep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Unità di elettroforesi</td><td>ORANGE INDIA</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>Citometro a flusso ... ARIA III</td><td>BD BIOSCIENZE</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FlussoJo&nbsp;</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Flt3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>Reagente DTR HighPrep</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Blocco FD FC3 umano</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM media</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a infrarossi</td><td>MURPHY-Siringa</td><td></td><td></td></tr> da <tr><td>insulina 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>Ketamina</td><td></td><td></td> <td>KETMIN Colorante a 50</td></tr> <tr><td>caricamenti 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Restrainer</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro a goccia nano</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio cellulare Neubauer</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>Il laboratorio Jackson</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma; &meno;/&meno; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Piastra delta Nunc a 6 pozzetti</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polistirene a fondo tondo</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Cellula primaria P3 Soluzione di nucleofeczione</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Kit di pulizia PCR</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia per torta di topi</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>tubo a fondo tondo in polistirene (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Whitehead Institute for Biomedical Research</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>Estrazione rapida&commercio; Soluzione di estrazione del DNA</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di analisi ICE</td><td>SYNTHEGO</td><td><a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione tampone Tris-EDTA (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>Fornito con gRNA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEM CELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEM CELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gene editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR / Cas9 è uno strumento di editing genetico altamente versatile ed efficiente adottato ampiamente per correggere varie mutazioni genetiche. La fattibilità della manipolazione genica delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) in vitro rende le HSPC una cellula bersaglio ideale per la terapia genica. Tuttavia, le HSPC perdono moderatamente il loro potenziale di attecchimento e ripopolamento multilineare in coltura ex vivo . Nel presente studio sono descritte condizioni di coltura ideali che migliorano l'attecchimento di HSPC e generano un aumento del numero di cellule geneticamente modificate in vivo. Il rapporto attuale mostra le condizioni di coltura in vitro ottimizzate, tra cui il tipo di terreno di coltura, l'integrazione unica di cocktail di piccole molecole, la concentrazione di citochine, le piastre di coltura cellulare e la densità di coltura. Inoltre, viene fornita una procedura ottimizzata di modifica genetica HSPC, insieme alla convalida degli eventi di modifica genetica. Per la convalida in vivo , vengono visualizzati l'infusione di HSPCs geneticamente modificata e l'analisi post-attecchimento nei destinatari di topo. I risultati hanno dimostrato che il sistema di coltura ha aumentato la frequenza delle HSC funzionali in vitro, con conseguente robusto attecchimento di cellule geneticamente modificate in vivo.

Il presente studio identifica le condizioni ideali di coltura HSPC che facilitano la ritenzione di CD34+CD133+CD90+ HSCs in coltura ex vivo. Per dimostrare l'arricchimento della coltura delle HSC insieme alla generazione potenziata di HSC geneticamente modificate, vengono fornite le procedure ottimizzate per l'isolamento PBMNC, la purificazione delle cellule CD34+, la coltura, l'editing genetico, il trapianto, la caratterizzazione dell'attecchimento e le cellule geneti...

Il presente protocollo descrive una procedura di coltura ottimizzata di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) per l'attecchimento robusto di cellule geneticamente modificate in vivo.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

La coltura ex vivo può ostacolare il potenziale di ripopolamento delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche. Il nostro protocollo preserva la staminalità durante la coltura e quindi migliora la frequenza delle cellule geneticamente modificate in vivo. La terapia genica con cellule staminali ematopoietiche è attualmente impiegata per malattie monogeniche e malattie infettive come l'HIV.Il protocollo di terapia genica HSPC si basa fortemente sulla coltura ex vivo. Il nostro protocollo dovrebbe essere compatibile con qualsiasi procedura che impieghi la coltura ex vivo. A dimostrare questo protocollo sarà Vigneshwaran Venkatesan, dottorando del mio laboratorio.Dopo aver isolato gli HSPC, coltivarli in terreni di coltura di cellule staminali che contengono citochine e piccole molecole Resveratrolo, UM729 e StemRegenin1. Prima dell'editing genetico, impostare il ThermoMixer a 37 gradi Celsius per ricostituire l'RNA guida, quindi preriscaldare il tampone TE a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare il flaconcino di sgRNA sintetico modificato chimicamente a 11.000 volte g per 1 minuto a 4 gradi Celsius e aggiungere 15 microlitri di tampone TE al flaconcino contenente 1,5 nanomolari di sgRNA liofilizzato e mescolare ruotando delicatamente per ottenere una concentrazione finale di 100 picomolar per microlitro.Incubare il flaconcino nel ThermoMixer con agitazione minima a 37 gradi Celsius per 30-40 secondi. Picchiettare delicatamente il flaconcino sui lati e ruotare il flaconcino per raccogliere 15 microlitri di sgRNA. Crea aliquote da 1 microlitro e conservale a meno 80 gradi Celsius per un massimo di 1 anno.Per la nucleofezione, pellet 2 volte 10 alle 5 cellule centrifugando a 200 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Una volta scartato il surnatante risospendere il pellet in 20 microlitri di tampone. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare con il complesso RNP preparato evitando bolle d'aria.Ora, trasferire la sospensione alla striscia di nucleofezione commerciale ed elettroporare le cellule usando il 4D-Nucleofector selezionando il codice di impulso DZ-100. Alle cellule elettroporate nella striscia di nucleofezione, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura pre-incubato e lasciare le cellule indisturbate per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, trasferire il contenuto nella piastra di coltura secondo i requisiti sperimentali.Posizionare i topi NSG nelle gabbie della torta in 6-8 ore prima del trapianto di HSPC. Irradiare i topi a 3,5 gray utilizzando un irradiatore disponibile in commercio. Per NBSGW, pre-condizionare topi maschi e femmine di età compresa tra 6 e 8 settimane iniettando busulfan per via intraperitoneale alla dose di 12,5 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo 48 ore prima del trapianto di HSPC.Per infondere 1 mouse, pellet 6 volte 10 alle celle 5th in un tubo da 1,5 millilitri centrifugando a 200 volte g per 5 minuti. a temperatura ambiente. Pipettare delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di PBS.Posizionare i topi NSG o NBSGW precondizionati nel sistema di ritenuta del mouse e infondere gli HSPC mediante iniezione di vene caudali. Tenere la coda del mouse e spingere delicatamente la spina per trattenere il mouse. Pulire delicatamente la coda del mouse con etanolo al 70%.Utilizzando una siringa da insulina da 31 gauge, aspirare 100 microlitri della sospensione cellulare. Ora, dirigi la luce dalla lampada a infrarossi sulla coda per 30-40 secondi, coprendo l'area del corpo del mouse con pieghe di carta velina. Per mantenere la coda nell'asse della pialla con la siringa, sollevarla con l'indice sinistro.Inserire delicatamente la parte smussata dell'ago nella vena caudale sinistra o destra con un angolo di 20 gradi. Spingere lo stantuffo per infondere la sospensione cellulare nella vena e applicare una leggera pressione vicino alla regione forata con carta velina ed estrarre l'ago. Dopo l'anestetizzazione, posizionare l'animale in posizione ventrale sdraiata e collottolare delicatamente i topi per aprire l'occhio, permettendo al globo dell'occhio di sporgere leggermente.Inserire delicatamente la pipetta da pascolo con un angolo di 30-45 gradi nel canto mediale dell'occhio sotto la membrana nittante. Dopo aver posizionato la pipetta Pasteur nella posizione corretta, applicare una leggera pressione sul tubo e iniziare a ruotare delicatamente il tubo. Dopo aver raccolto da 50 a 80 microlitri di sangue periferico, ritirare delicatamente la pipetta dal canto mediale dell'occhio.Dopo l'eutanasia, praticare un'incisione verticale di 1 centimetro sopra l'uretra e allungare fino a 1 centimetro sotto il diaframma. Tagliare orizzontalmente agli angoli della zona incisa per aprire la regione addominale. Dopo aver sezionato il femore e la tibia, utilizzare le forbici per rimuovere i tessuti molli attaccati al femore e alla tibia e strofinare delicatamente le ossa con una carta velina.Utilizzare un bisturi per fare un piccolo foro con un diametro non superiore a 0,2 centimetri sul fondo di un tubo di microcentrifuga da 0,5 millilitri. Rimuovere le estremità prossimali delle ossa usando un bisturi e posizionare le ossa con il lato tagliato rivolto verso il foro del tubo di microcentrifugazione da 0,5 millilitri. Ora, posizionare il tubo da 0,5 millilitri con le ossa nel tubo da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di PBS sterile.Chiudere il coperchio, girare i tubi a 200 volte g per 3 minuti in condizioni sterili a temperatura ambiente e scartare i tubi da 0,5 millilitri contenenti ossa con una cavità midollare vuota. Al tubo di reazione da 1,5 millilitri contenente midollo osseo, aggiungere 1 millilitro di PBS, quindi utilizzando una pipetta da 1 millilitro, risospendere delicatamente le cellule 10 volte. Trasferire 1 millilitro della sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri contenente 9 millilitri di tampone per lisi dei globuli rossi.Incubare le cellule nel ghiaccio per 7 minuti invertendo delicatamente il tubo ogni due minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il tubo a 200 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetere il lavaggio fino a quando non si osserva un pellet bianco chiaro chiaro. La frequenza delle cellule vive e delle cellule CD34-positive, CD90-positive è aumentata nel gruppo RUS dopo 48 ore di nucleofezione.Dopo 72 ore, la percentuale e la frequenza di indel sono aumentate nel gruppo trattato con RUS rispetto al gruppo trattato con DMSO, suggerendo un aumento dell'editing genetico. Il numero assoluto di cellule CD34-positive, CD90-positive e cellule nucleate totali è significativamente più alto 48 ore dopo l'editing. L'analisi citometrica a flusso di cellule CD45-positive umane nei topi NSG ha mostrato un aumento dell'attecchimento nelle condizioni di coltura.L'analisi della frequenza di modifica genetica nelle cellule BM del topo ha mostrato un aumento dell'attecchimento di HSPC geneticamente modificati in condizioni di coltura integrate con RUS. La coltura delle HSPC ad una confluenza di 200.000 cellule per ml è fondamentale per migliorare le cellule staminali funzionali. L'amplificazione delle cellule staminali del sangue del cordone ombelicale e delle cellule staminali derivate da iSPC sono le nuove aree in cui questo protocollo viene testato.

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Questo video mostra un test per l'esecuzione dell'editing genetico in cellule T umane utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9. Una miscela di cellule T primarie CD4+ e CD8+ è combinata con un complesso ribonucleoproteico CRISPR-Cas9, mirato a geni specifici per il knockout. Dopo l'elettroporazione, l'sgRNA guida Cas9 verso la sequenza di DNA bersaglio, creando tagli precisi. Questi tagli vengono poi riparati dal meccanismo di giunzione non omologa della cellula, portando al knockout genico.

Una tecnica CRISPR-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule T

Genica mirata di editing con CRISPR/Cas9 ha notevolmente facilitato la comprensione delle funzioni biologiche dei geni. Qui, utilizziamo la metodologia CRISPR/Cas9 a modello calreticulina mutazioni in cellule ematopoietiche citochina-dipendente al fine di studiare la loro attività oncogena.

Utilizzando CRISPR/Cas9 Gene Editing per studiare l'attività oncogena di calreticulina mutante in cellule ematopoietiche Cytokine dipendente

Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Presentato qui è un protocollo per l'efficiente editing genico mediato da ribonucleoproteina CRISPR/Cas9 nelle cellule dei mammiferi utilizzando l'elettroporazione dei tubi.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteina-mediato Precision Gene Editing da Elettroporazione Tube

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule CAR-T tramite un sistema CRISPR/Cas9.

Utilizzo di CRISPR/Cas9 per eliminare GM-CSF nelle celle CAR-T

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Qui, descriviamo un metodo dettagliato per l'editing genetico senza soluzione di continuità nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un plasmide donatore basato su piggyBac e il mutante nickase Cas9. Due mutazioni puntiformi sono state introdotte nell'esone 8 del locus del fattore nucleare 4 alfa (HNF4α) degli epatociti nelle cellule staminali embrionali umane (hESC).

Introduzione di mutazioni puntiformi nelle cellule staminali pluripotenti umane utilizzando l'editing del genoma senza soluzione di continuità

Qui, presentiamo un protocollo per l'editing genetico nelle cellule T umane primarie utilizzando la tecnologia CRISPR Cas per modificare le cellule CAR-T.

Produzione di cellule CAR-T umane ingegnerizzate CRISPR

Nuove strategie per modellare fedelmente le mutazioni somatiche nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) sono necessarie per studiare meglio la biologia delle cellule staminali ematopoietiche e le neoplasie ematologiche. Qui, viene descritto un protocollo per modellare mutazioni eterozigoti con guadagno di funzione nelle HSPC combinando l'uso di CRISPR / Cas9 e la doppia trasduzione del donatore rAAV.

Ingegnerizzazione di mutazioni oncogeniche eterozigoti con guadagno di funzione in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane

La linea cellulare THP-1 è ampiamente utilizzata come modello per studiare le funzioni dei monociti/macrofagi umani in varie aree di ricerca legate alla biologia. Questo articolo descrive un protocollo per l'ingegneria efficiente basata su CRISPR-Cas9 e l'isolamento di cloni di singole cellule, che consente la produzione di dati fenotipici robusti e riproducibili.

Knockout genico mediato da CRISPR-Cas9 basato sull'elettroporazione in cellule THP-1 e isolamento di cloni a singola cellula

Qui, presentiamo un protocollo che integra la tecnologia CRISPR/Cas9 con il saggio Cell Counting Kit-8 (CCK-8) per identificare i geni candidati che sono cruciali per l'anomala capacità proliferativa delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici.

Valutazione dei geni correlati alla crescita anormale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche combinando la tecnologia CRISPR/Cas9 con il conteggio delle cellule

Impara a modificare geneticamente le cellule staminali ematopoietiche con CRISPR/Cas9 preservandone la stemness in coltura. Questo protocollo ottimizzato migliora l'impianto delle cellule modificate per terapie geniche contro malattie monogeniche e HIV.

CRISPR/Cas9 Gene Editing di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche per applicazioni di terapia genica

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