Approvvigionamento e decellularizzazione degli arti posteriori di ratto utilizzando un bioreattore ex vivo basato sulla perfusione per allotrapianto composito vascolarizzato

Abbiamo stabilito un piccolo modello animale per la decellularizzazione di un arto. Ciò è utile per facilitare la ricerca proof of concept sulla de e la ricellularizzazione di tessuti compositi vascolarizzati. I regimi di immunosoppressione sono una delle principali limitazioni nell'allotrapianto composito vascolarizzato.

L'immunogenicità tissutale può essere ridotta utilizzando la decellularizzazione. Per iniziare, fai un'incisione cutanea usando una lama chirurgica numero 10 lungo il legamento inguinale, spostandoti da una direzione laterale a una mediale, mentre tieni la pelle circostante con una pinza Adson. Quando il grasso sottostante è esposto, utilizzare la dissezione smussata per sezionare attentamente il grasso e individuare i vasi epigastrici superiori.

Usando micro forbici, sezionare prossimalmente ed esporre il nervo femorale sottostante, l'arteria e la vena a livello del legamento inguinale. Sotto un microscopio a dissezione, identificare i vasi femorali e sezionare l'arteria e la vena prossimalmente usando una pinza fine per ottenere una lunghezza sufficiente dai punti di biforcazione della rete arteriosa. Quindi, ligate la vena femorale e l'arteria separatamente usando punti di sutura 6-0.

Successivamente, condurre la dissezione circonferenziale attorno al resto dell'arto posteriore senza interrompere i vasi femorali legati e transettare l'osso femorale a metà lunghezza usando un tagliaossa. Per isolare completamente l'arto posteriore, transettare i vasi femorali legati distalmente alle legature usando micro forbici e cannulare l'arteria femorale usando un angiocatetere calibro 24 al microscopio a dissezione. Quindi, sciacquare con soluzione salina eparinizzata fino a quando non si osserva un chiaro deflusso dalla vena femorale.

Fissare la cannula legando una sutura attorno al recipiente incannulato in un'altra sutura distalmente attorno alla cannula stessa, assicurandosi che la cannula sia posizionata in prossimità per evitare di bloccare i punti di biforcazione. Successivamente, immergere gli arti posteriori procurati e PBS fino alla decellularizzazione. Per costruire il bioreattore, posizionare la camera sterilizzata e avvitare tre rubinetti di arresto monouso a tre vie sulle linee di ingresso, uscita e rifornimento, assicurando che il rubinetto di arresto per la porta di rifornimento sia chiuso alle due porte rimanenti per evitare perdite.

Collegare i tubi in silicone precedentemente realizzati ai rubinetti di arresto sulle linee di ingresso e uscita. Quindi, collegare i tubi peristaltici ai tubi in silicone. Dopo aver fissato la cassetta sul tubo peristaltico, posizionarla sulla pompa peristaltica.

Quindi, collegare uno dei tubi di silicone all'estremità del tubo peristaltico della linea di uscita dal passaggio precedente. All'altra estremità, collegare una pipetta sierologica da un millilitro e risospendere l'estremità collegata con una pipetta sierologica nel pallone del serbatoio dei rifiuti. Quindi, sospendere l'estremità del tubo collegato alla pipetta sierologica nel serbatoio del detergente e sigillare immediatamente l'apertura del pallone del serbatoio del detergente con parafilm.

Aggiungere lo 0,25% di SDS dal barattolo di vetro da un litro nella camera del bioreattore a metà strada. Quindi, prendere l'arto posteriore procurato usando la pinza Adson e sospenderlo nella camera del bioreattore con attenzione. Utilizzando due paia di pinze Adson, guidare la porzione cannulata dell'arto posteriore verso la linea di ingresso mentre si tiene la cannula con un paio di pinze.

Utilizzare l'altro paio di pinze per torcere e fissare la linea di ingresso alla cannula. Una volta fissato, aggiungere più SDS allo 0,25% dal barattolo di vetro da un litro per immergere completamente l'arto secondo necessità, assicurando che anche la porta di uscita sia immersa nel serbatoio del bioreattore e che venga mantenuto un deflusso costante. Quindi, collegare un filtro a siringa monouso alla porta di ventilazione sul coperchio della camera del bioreattore e fissare il coperchio sul bioreattore, assicurandosi che la camera sia sigillata da tutti i lati.

Per rimuovere l'aria dal tubo e innescare il circuito di perfusione, utilizzare una nuova siringa monouso da 10 millilitri per prelevare il detergente dal serbatoio del detergente utilizzando un rubinetto di arresto a tre vie sulla linea di ingresso. Una volta aspirato, utilizzare lo stesso fluido da inserire nel rubinetto di arresto a tre vie sulla linea di uscita. Quindi, premere verso il basso e fissare le cassette con il tubo nella pompa peristaltica.

Quindi, accendere la pompa peristaltica utilizzando il pulsante di accensione. Nella schermata della pompa peristaltica, passare alla seconda scheda utilizzando il tasto freccia per impostare la velocità di perfusione per il primo canale con la portata in ingresso come modalità di erogazione e impostare la velocità di perfusione a un millilitro al minuto, assicurando che la direzione del flusso sia corretta in base alla configurazione dell'apparecchiatura. Calibrare la pompa peristaltica per garantire che la quantità di fluido erogato attraverso la linea di ingresso e/o prelevato dalla linea di uscita scorra in modo coerente tra i due, assicurandosi che l'ID del tubo sia impostato su 1,85 millimetri.

Iniziare la decellularizzazione tramite perfusione della macchina a un millilitro al minuto per entrambe le linee di ingresso e uscita premendo il pulsante di accensione sulla tastiera. Monitorare e assicurarsi che il flusso sia continuo sia in entrata che in uscita. Utilizzando 1 litro di 0,25% STS, ricostituire il serbatoio del bioreattore attraverso la porta di rifornimento secondo necessità.

Quindi, cerca un aspetto bianco traslucido del tessuto, che apparirà entro il quinto giorno, indicando la decellularizzazione degli arti posteriori del ratto. Dopo la conferma della decellularizzazione, sostituire il serbatoio del detergente con il serbatoio PBS e 1% Antibiotico-Antimicotico e sigillare l'apertura del pallone con parafilm. Iniziare PBS e 1% perfusione antibiotico-antimicotica a un millilitro al minuto e continuare per due giorni.

Sostituire il PBS e l'1% serbatoio antibiotico-antimicotico con 200 millilitri di acido parassitario 0,1%, serbatoio di etanolo al 4% e iniziare la perfusione a un millilitro al minuto per due ore. Sotto un armadio di biosicurezza, scollegare l'arto posteriore dalla linea di ingresso utilizzando due paia di pinze Adson sterili con un paio di pinze per torcere la linea di ingresso e l'altra che tiene la cannula, assicurandosi che la cannula non venga tirata per prevenire la decannulazione. Conservare l'arto in un barattolo di vetro da 500 millilitri contenente PBS e 1% antibiotico-antimicotico a 4 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.

Sia l'arteria femorale decellularizzata che la vena hanno mostrato perdita di contenuto nucleare in tutti gli strati e nel tessuto connettivo circostante, data la mancanza di nuclei macchiati di blu altrimenti presenti nei vasi nativi. La tunica intima media e l'avventizia sia della vena femorale che delle arterie sono state mantenute nei vasi decellularizzati. Il nervo femorale ha mostrato la conservazione della struttura del tessuto, compreso l'endoneurium.

L'osso ha mostrato una ritenzione strutturale complessiva con perdita di nuclei colorati di osteociti e dagli strati circostanti di endosteum e periostio post-decellularizzazione. La pelle ha mostrato una perdita di cellule dall'epidermide e dal derma. Il derma ha mostrato fibre di collagene trattenute simili al tessuto cutaneo nativo.

Infine, la visione trasversale del muscolo scheletrico ha mostrato la perdita di nuclei altrimenti situati nelle periferie dell'endomisio. Il contenuto di miofibrille è rimasto mantenuto all'interno dei rispettivi fascicoli dopo la decellularizzazione. È stata eseguita anche la quantificazione del DNA utilizzando PicoGreen, in cui il contenuto di DNA è stato significativamente ridotto attraverso i vasi femorali, nervosi, pelle, muscoli e ossa.

Seguendo questo protocollo, l'arto decellularizzato può essere ulteriormente caratterizzato. Ciò comporta l'esame della matrice extracellulare utilizzando metodi istologici e biochimici e valutando il vascolare nell'uso dell'imaging. Lo stelo decellularizzato può anche essere ricellularizzato utilizzando cellule tessuto-specifiche.