Rilevamento di Candidatus liberibacter asiaticus distribuibile sul campo utilizzando l'amplificazione della polimerasi ricombinasi combinata con CRISPR-Cas12a

Huang long bing, abbreviato in HLB. È una malattia degli agrumi devastante in tutto il mondo. Nei paesi più produttori di agrumi, come la Cina e gli Stati Uniti, l'HLB è causata dal batterio limitato al floema Candidatus Liberibacter asiaticus, abbreviato in CLas.

La diagnosi precoce delle CLa è stata importante per i coltivatori che facilitano l'intervento precoce e prevengono la diffusione della malattia. Quindi qui abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la diagnosi rapida e portatile di HLB, combinato con l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e il sistema CRISPR-Cas12a. L'abbiamo chiamato CLas-DETECTR.

La sensibilità della nostra piattaforma è molto più alta della PCR. Inoltre, mostra risultati simili con qPCR quando sono stati utilizzati i campioni di foglie. Confronta con i rilevamenti CLas convenzionali, il nostro metodo può essere completato in 90 minuti e funziona in una condizione isotermica.

Il risultato può anche essere visualizzato attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile sul campo. Il CLas-DETECTR contiene quattro fasi: preparazione della soluzione, isolamento totale del DNA degli agrumi, amplificazione isotermica del DNA e risultati della visualizzazione. Lo schema del test CLas-DETECTR è illustrato qui.

Il buffer A, la soluzione B e la soluzione C vengono preparati come descritto nel protocollo. Per risparmiare tempo e rendere questo metodo adatto per il rilevamento di CLas sul campo, è stato utilizzato l'approccio basato sul glicole polietilenico E.coli per ottenere estratti vegetali grezzi per l'amplificazione del DNA. Le foglie di agrumi sono utilizzate nello strumento.

Perforare i pochi pezzi di dischi fogliari dalla foglia. Mettere i dischi fogliari in un tubo Eppendorf da 1,5 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di Buffer A nel tubo.

Macinare manualmente i dischi fogliari fino a lisci con un'asta di plastica. Lasciare il tubo indisturbato per 10 minuti. Il surnatante viene successivamente applicato all'amplificazione del DNA.

Per l'amplificazione isotermica del DNA, aggiungere un microlitro di surnatante dal punto 2.3 e un microlitro di acetato di magnesio nella soluzione B e mescolare bene. In laboratorio, incubarli in una semplice incubatrice a 37 gradi per 15 minuti. Per visualizzare i risultati, aggiungere 10 microlitri della miscela dal punto 3.2 nella soluzione C e mescolare bene.

Incubali nell'incubatore a 37 gradi per 60 minuti. Indossare una maschera e osservare il segnale di fluorescenza verde attraverso un dispositivo di rilevamento fluorescente portatile. Per testare la specificità di CLas-DETECTR, prime colonie pure di Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp.

Citri, che è il patogeno del cancro degli agrumi, e Burkholderia stabilis ceppo 1440 isolato nel nostro laboratorio sono stati utilizzati per estrarre il loro DNA genomico. Quindi questo DNA genomico di tre batteri e il DNA genomico delle foglie di Newhall CLas-positive sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR. Per testare la sensibilità di CLas-DETECTR, sono state rilevate una serie di diluizioni di frammenti di DNA CLas utilizzando PCR, CLas-DETECTR e qPCR come descritto nel protocollo Dopo la specificità e il test di sensibilità, è stato utilizzato il metodo CLas-DETECTR per rilevare la presenza di CLas in campo.

Campioni di foglie raccolti dall'albero di arancio dolce di Newhall coltivato nel vivaio di risorse di germoplasma nel campus della Gannan Normal University, Jiangxi, Cina. È stato applicato anche qPCR, un convincente metodo di rilevamento CLas solitamente utilizzato in laboratorio. I campioni di foglie dell'albero Newhall infetto da HLB e non infetto da HLB, in cui è stata confermata la presenza di CLas nel nostro laboratorio, sono stati sottoposti al test CLas-DETECTR.

Il segnale di fluorescenza verde è stato catturato nel campione infetto da HLB, ma non nel controllo HLB-non infetto e negativo. Abbiamo determinato la specificità di CLas-DETECTR utilizzando acidi nucleici estratti da altri batteri. Nel test CLas-DETECTR, solo il gDNA estratto dalle foglie di Newhall CLas-positive ha dimostrato segnali fluorescenti verdi.

Il gDNA estratto da Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri e Burkholderia stabilis ceppo 1440 non lo ha fatto, il che significa che CLas-DETECTR può rilevare CLas in modo specifico. Abbiamo anche testato la sensibilità di CLas-DETECTR utilizzando una serie di diluizioni del DNA CLas, elencate nel protocollo.

La PCR può rilevare 201 copie per megalitro. D'altra parte, CLas-DETECTR può rilevare 2,01 copie per megalitro, suggerendo la sua disponibilità come diagnostica di campo sensibile. qPCR può rilevare 0,201 copie per megalitro e il valore Ct è superiore a 36.

Quindi CLas-DETECTR è due ordini di grandezza più sensibile della PCR tradizionale e un ordine di grandezza meno sensibile della qPCR quando sono stati utilizzati ampliconi specifici CLas diluiti. Infine, ha riesaminato la fattibilità del CLas-DETECTR per i campioni sul campo e ha confrontato la sua sensibilità con la qPCR. In cifre, vediamo.

Possiamo vedere che il valore Ct è superiore a 36 quando la concentrazione di CLas è inferiore a 0,2 copie per megalitro, che è una concentrazione molto bassa. Tra i 15 campioni, il valore Ct dei campioni 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 e 14 rilevati da qPCR era inferiore a 36. È stato osservato un apparente segnale di fluorescenza verde.

D'altra parte, quando il valore Ct dei campioni 6, 7, 9, 12 e 15 rilevati da qPCR era indeterminato, non è stato osservato alcun segnale fluorescente verde. Inoltre, sono stati osservati deboli segnali fluorescenti verdi quando il valore CT dei campioni 5 e 11 rilevati dalla qPCR era superiore a 36. I risultati suggeriscono che la nostra piattaforma è uno strumento rapido, robusto e sensibile per la diagnosi HLB sul campo.