Visualizzazione delle dinamiche di accoppiamento di actina e microtubuli in vitro mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Nonostante molti esempi di coordinazione, la maggior parte degli studi esamina le proteine dell'actina o dei microtubuli individualmente. Questo metodo consente la visualizzazione di entrambi i polimeri dinamici in un'unica reazione. Questa tecnica consente all'utente di valutare diverse proteine regolatrici per proprietà emergenti che potrebbero essere viste solo con versioni dinamiche di actina e microtubuli.

Questa tecnica può essere espansa per includere lipidi o estratti per avvicinarsi alla costruzione di una cellula sintetica. Inizia scongelando le aliquote delle polveri PEG-Silane e Biotina-PEG-Silano e sciogliendo le polveri PEG in etanolo all'80% per generare le soluzioni stock di rivestimento di 10 milligrammi per millilitro mPEG-Silano e da due a quattro milligrammi per millilitro Biotina-PEG-Silano. Rimuovere il coperchio pulito dallo stoccaggio dell'etanolo usando una pinza.

Asciugare con azoto gassoso e conservare in una capsula di Petri pulita. Rivestire le scivolate di copertura con 100 microlitri di soluzione di rivestimento e incubarle a 70 gradi Celsius per almeno 18 ore o fino all'uso. Tagliare 12 strisce di nastro biadesivo a doppio supporto per una lunghezza di 24 millimetri.

Rimuovere un lato del supporto del nastro e fissare i pezzi di nastro adiacenti alle sei scanalature presenti su una camera di imaging pulita. Rimuovere il secondo pezzo di supporto del nastro per esporre il lato appiccicoso del nastro lungo ciascuna scanalatura della camera e posizionare il lato del nastro della camera su una superficie pulita. Mescolare la resina epossidica e le soluzioni di indurimento uno a uno in una piccola barca di pesatura e utilizzare una punta P1000 per posizionare una goccia di resina epossidica mista tra le strisce di nastro all'estremità di ciascuna scanalatura della camera di imaging.

Quindi, posizionare la camera, il nastro o il lato epossidico verso l'alto, su una superficie pulita. Rimuovere uno slip di copertura rivestito dall'incubatore a 70 gradi Celsius e risciacquare le superfici rivestite e non rivestite degli scivoli di copertura con acqua doppia distillata sei volte. Asciugare con azoto gassoso filtrato e quindi apporre sulla camera di imaging con il coperchio che scivola lateralmente verso il nastro.

Utilizzare una punta della pipetta P200 o P1000 per applicare pressione sull'interfaccia in vetro nastrato per garantire una buona tenuta tra il nastro e lo slittamento del coperchio. Incubare le camere assemblate a temperatura ambiente per almeno cinque-10 minuti per consentire alla resina epossidica di sigillare completamente i pozzetti della camera prima dell'uso. Le camere di perfusione scadono entro 12-18 ore dal montaggio.

Utilizzare una pompa di perfusione e scambiare in sequenza soluzioni di condizionamento nella camera di perfusione facendo scorrere 50 microlitri dell'1% BSA per innescare la camera di imaging. Rimuovere il buffer in eccesso dal serbatoio del raccordo di blocco dell'esca. Quindi, scorrere 50 microlitri di 0,005 milligrammi per millilitro di streptavidina e incubare per uno o due minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il buffer in eccesso dal serbatoio. Flusso 50 microlitri dell'1%BSA per bloccare il legame non specifico e incubare per 10-30 secondi. Rimuovere il buffer in eccesso dal serbatoio.

Successivamente, flusso 50 microlitri di tampone TIRF caldo 1x e poi 50 microlitri di semi di microtubulo stabilizzati e biotinilati al 50% diluiti in 1x tampone TIRF. Impostare il dispositivo di riscaldamento del palco o dell'obiettivo in modo che mantenga una temperatura compresa tra 35 e 37 gradi Celsius per 30 minuti prima di visualizzare la prima reazione biochimica. Quindi, impostare l'intervallo di acquisizione ogni cinque secondi per 15-20 minuti.

Successivamente, impostare le esposizioni laser 488 e 647 su 50-100 millisecondi con una potenza compresa tra il 5% e il 10% regolando prima la reazione di polimerizzazione per avviare l'assemblaggio del filamento di actina. Acquisire le immagini a 647 nanometri e apportare le opportune regolazioni. Quindi, regolare la reazione di polimerizzazione in un secondo pozzo di perfusione condizionato per avviare l'assemblaggio dei microtubuli.

Visualizza a 488 nanometri e apporta le regolazioni appropriate. Combinare tre microlitri di 10 micromolari 488 tubulina con l'aliquota di 7,2 microlitri di 100 micromolari di tubulina fluorescente non etichettata più di 15 minuti prima dell'uso. Quindi, combinare tre microlitri di actina correlata alla biotina diluita in volumi appropriati di actina fluorescente non etichettata ed etichettata in modo tale che la miscela finale sarà di 12,5 actina totale micromolare con etichetta fluorescente dal 10% al 30%.

Preparare la miscela di citoscheletri combinando due microlitri della miscela di actina 12,5 micromolari con la miscela di stock di tubulina non più di 15 minuti prima dell'imaging. Conservare sul ghiaccio fino all'uso. Preparare la miscela di reazioni proteiche combinando tutti gli altri componenti sperimentali e proteine, tra cui 2x tampone TIRF, anti candeggina, nucleotidi, tamponi e proteine accessorie.

Incubare la miscela di citoscheletro e la miscela di reazione proteica separatamente a 37 gradi Celsius per 30-60 secondi. Per avviare la reazione aggiungere il contenuto della miscela di reazione proteica alla miscela di citoscheletro e mescolarla. Flusso 50 microlitri della miscela di reazione contenente 1x tampone TIRF integrato con 15 tubulina priva di micromolari, un GTP millimolare, 0,5 monomeri di actina micromolare e volumi appropriati di controlli tampone alla camera di perfusione.

Registra un filmato time lapse utilizzando il software del microscopio per acquisire ogni cinque secondi per 15-20 minuti. Condizionare un nuovo pozzo di perfusione e sostituire il volume del tampone con la proteina regolatrice di interesse e i controlli tampone. Acquisire per valutare le proteine regolatrici per le funzioni emergenti dei microtubuli di actina.

Esempi di misure di microtubuli e dinamica del filamento di actina sono mostrati in queste immagini. La proiezione temporale media del canale della tubulina visualizza in modo efficiente le lunghezze totali dei microtubuli per le scansioni di linea utilizzate per generare i grafici Kymograph. Le linee tratteggiate nere corrispondono ai due esempi di Kymographs dei microtubuli dinamici.

Le fasi di crescita e disassemblaggio dei microtubuli sono mostrate su ciascun Kymograph. Due esempi di montaggi di immagini time lapse raffiguranti singoli filamenti di actina che polimerizzano attivamente sono mostrati qui. I tassi di allungamento sono calcolati come la pendenza dei trame della lunghezza dei filamenti di actina nel tempo per actina micromolare.

Pertanto, un fattore di correzione di due deve essere applicato a 0,5 reazioni di actina micromolare per confrontare i tassi tipicamente determinati alla concentrazione di actina micromolare. Esempi di cinque filamenti sono mostrati qui. Qui sono mostrate la fluorescenza totale a riflessione interna o le immagini TIRF dei microtubuli dinamici nei filamenti di actina che polimerizzano in assenza o presenza di 250 Tau nanomolari.

Le linee tratteggiate blu e le frecce segnano l'usura una linea è stata disegnata per i grafici di scansione delle linee corrispondenti a ciascuna condizione. La sovrapposizione tra i microtubuli nelle regioni dell'actina può essere segnata in un determinato punto temporale per area. Le proteine citoscheletriche, in particolare l'actina, i microtubuli e i loro regolatori sono molto sensibili ai cicli di congelamento / disgelo.

Per coerenza e successo, utilizzare proteine altamente pure e correttamente conservate.