Name: Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Impara un saggio di transcitosi endoteliale per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna usando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane. Questo metodo fornisce un modello cellulare senza animali per studiare la biologia vascolare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH (R01 EY028100, EY024963 e EY031765) a JC. ZW è stato supportato da un Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il Boston Children's Hospital per la generazione di microscopia ottica e immagini EM (Figura 3). I protocolli per gli studi in vivo possono essere ottenuti da Wang et al.24. Tutti gli esperimenti che coinvolgono cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) sono stati approvati dall'Institutional Biosafety Committee (IBC) del Boston Children's Hospital.
1. Preparazione dei reagenti
<ol><li>Soluzione per il rivestimento di un piatto di coltura tissutale: preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% sciogliendo 1 mL di soluzione madre di gelatina (40% -50%) in 500 ml di coltura tissutale sterile grado 1x PBS (pH = 7,4). Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare la soluzione di gelatina allo 0,1% a 2-8°C. Può essere conservato alla suddetta temperatura per un tempo indefinito in condizioni sterili.</li>
	<li>Terreno di coltura: preparare 500 ml di terreno completo di crescita delle cellule endoteliali (EGM) sciogliendo gli integratori di EGM nel mezzo basale di crescita delle cellule endoteliali (EBM) secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Aliquote terreno di crescita in provette da 50 mL e conservare le provette a 4 °C. La durata di conservazione del terreno di coltura è di 12 mesi a 4 °C.</li>
	<li>Soluzione di tripsina: per la soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25%, aliquote dal flaconcino in provette da 50 mL e conservare a 4 °C (fino a 2 settimane) o -20 °C (fino a 24 mesi).</li>
</ol>2. Coltura degli HRMEC
<ol><li>Coltura cellulare iniziale<ol><li>Rivestire le piastre di Petri per colture cellulari (diametro 100 mm x altezza 20 mm) con 5 ml di soluzione di gelatina allo 0,1% sotto una cappa a flusso laminare e tenerle indisturbate nella cappa per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per un rivestimento uniforme. NOTA: Il rivestimento gelatinoso dei piatti migliora l'attaccamento cellulare. In alternativa, è possibile utilizzare anche palloni di coltura T75 rivestiti di gelatina.</li>
		<li>Prima di seminare le cellule, aspirare la soluzione di gelatina usando una pompa per vuoto. La pressione del vuoto dell'aspiratore utilizzato era fino a 724 mmHg. NOTA: L'aspirazione deve essere eseguita immediatamente prima della semina delle celle per evitare l'essiccazione della soluzione di rivestimento.</li>
		<li>Scongelare un flaconcino congelato di HRMEC (da conservare in azoto liquido) usando un bagnomaria a 37 °C o aggiungendo un mezzo di crescita caldo nel flaconcino. Una volta scongelata, trasferire la sospensione cellulare a 9 ml di terreno di coltura (supponendo che il flaconcino scongelato degli HRMEC sia di 1 ml). NOTA: Gli HRMEC sono stati ottenuti commercialmente (Tabella dei materiali). Il terreno di coltura aggiunto alle cellule deve essere sempre preriscaldato a 37 °C prima dell'uso.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT e aspirare attentamente il surnatante per evitare di rimuovere il pellet cellulare.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura e trasferire la sospensione risultante su una capsula di Petri rivestita di gelatina. Mantenere le celle nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2. In genere, gli HRMEC sono confluenti al 70% -80% dopo 72 ore. NOTA: il mezzo di crescita viene cambiato a giorni alterni.</li>
	</ol></li>
	<li>Sottocoltura di HRMEC su inserti a membrana permeabile<ol><li>Preparare inserti filtranti per colture cellulari (inserti da 6,5 mm con membrana in policarbonato da 0,4 μm di dimensione dei pori, posti in una piastra a 24 pozzetti) per la semina degli HRMEC rivestendo ciascun inserto (camera apicale) con 200 μL di soluzione di gelatina allo 0,1% per 30 minuti sotto una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie inferiore dell'inserto filtrante. NOTA: Ogni pozzetto ha una camera apicale e basolaterale separata da una membrana porosa.</li>
		<li>Estrarre la capsula di Petri con HRMEC coltivati (passo 2.1.5.) dall'incubatore e aspirare il terreno di coltura. Risciacquare delicatamente le cellule 2x con 10 ml di 1x PBS sotto una cappa a flusso laminare per eliminare potenziali cellule galleggianti / morte.</li>
		<li>Dissociare le cellule con 0,5-1 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% e posizionare la capsula di Petri nell'incubatore (37 °C e 5% CO2) per 5 minuti.</li>
		<li>Spegnere l'attività della tripsina aggiungendo 4,5-9 ml di terreno di coltura e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta da 10 ml.</li>
		<li>Ruotare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT, rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 3 ml di terreno di crescita.</li>
		<li>Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro manuale o un contatore automatico di cellule e seme a una densità di 4 x 104 cellule per inserto del filtro (cioè 1,25 x 105 celle / cm2). Il volume della sospensione cellulare per ciascun inserto è di 250 μL.</li>
		<li>Aspirare la soluzione di rivestimento dai pozzetti contenenti inserti permeabili e trasferire 250 μL della sospensione cellulare per inserto (camera apicale). Aggiungere solo il mezzo (cioè senza celle) a uno degli inserti, che verrà utilizzato come "controllo vuoto" per la misurazione TEER. Contemporaneamente, aggiungere anche 750 μL di mezzo per pozzetto, nelle camere basolaterali.</li>
		<li>Conservare la piastra a 24 pozzetti con inserti permeabili nell'incubatore (37 °C e 5% di CO 2) per 7-12 giorni fino a quando le cellule in coltura diventano completamente confluenti e si raggiunge il valore TEER desiderato di ~20 Ω·cm2.</li>
		<li>Cambia il mezzo di crescita a giorni alterni. Durante il cambio del fluido, aspirare con attenzione il mezzo per ridurre al minimo la rottura del monostrato cellulare e aggiungere 250 μL e 750 μL di terreno fresco per pozzetto rispettivamente alle camere apicale e basolaterale. NOTA: Il mezzo di crescita viene modificato sia per le camere apicali che basolaterali dei pozzetti.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Misurazioni TEER (Figura 4)
<ol><li>Il giorno 14 post semina delle celle (fase 2.2.9.), misurare il TEER per HRMEC utilizzando un sistema epiteliale volt-ohm meter (EVOM) di resistenza elettrica (ER) (Table of Materials) come segue.</li>
	<li>Precaricare il sistema ER e controllare la funzionalità del misuratore utilizzando l'elettrodo di prova STX04. Calibrare, se necessario.</li>
	<li>Collegare l'elettrodo al misuratore ed equilibrare l'elettrodo immergendolo prima in etanolo al 70% per 15-20 minuti e poi immergendolo brevemente nel terreno di coltura cellulare EGM.</li>
	<li>Nel frattempo, tenere la piastra a 24 pozzetti contenente celle nella cappa a flusso laminare a RT per 15-20 minuti per l'equilibrio della temperatura. NOTA: le misurazioni TEER sono influenzate dalla temperatura, quindi la fase di equilibrio è essenziale.</li>
	<li>Per la misurazione TEER, aggiungere terreno di coltura fresco sia alle camere apicali (250 μL) che basolaterali (750 μL) dei pozzetti.</li>
	<li>Eseguire la misurazione TEER immergendo attentamente l'elettrodo in modo che la punta più corta si trovi nell'inserto e la punta più lunga tocchi il fondo del pozzetto. Misurare prima la resistenza attraverso il controllo vuoto. Per ogni inserto, misurare TEER in triplice copia. NOTA: Per il risciacquo dell'elettrodo tra le misurazioni, vengono utilizzati terreni di coltura. Assicurarsi che l'elettrodo sia tenuto con un angolo di 90° rispetto alla parte inferiore dell'inserto per letture stabili.</li>
	<li>Calcolare la resistenza elettrica (in Ω·cm 2) attraverso il monostrato utilizzando la formula, TEER = resistenza netta (Ω) x superficie dell'inserto filtrante (cm2); Qui, la resistenza netta è la differenza tra la resistenza di ciascun pozzetto (mezzo di crescita con celle) e il pozzo bianco (solo mezzo di crescita).</li>
	<li>Effettuare un ulteriore trattamento delle cellule solo dopo che il valore TEER raggiunge ~20 Ω·cm2. Se il livello TEER desiderato non viene raggiunto, tenere la piastra nell'incubatore e misurare il TEER il giorno successivo. NOTA: La confluenza HRMEC può anche essere validata mediante esame morfologico della forma cellulare (al microscopio) con morfologia tipica del ciottolo e/o dalla presenza di proteine di giunzione cellulare con colorazione immunoistochimica separata.</li>
</ol>4. Saggio di transcitosi
<ol><li>Saggio di transcitosi in vitro mediata da clatrina mediante transferrina marcata con Cy3 (Figura 5)<ol><li>Al raggiungimento della confluenza con valori di TEER intorno a 20 Ω·cm 2, il siero priva le cellule per 24 ore a 37 °C e il 5% di CO2 utilizzando lo 0,5% di FBS in EBM (mezzo ridotto dal siero) in entrambe le camere (camera apicale: 250 μL e camera basolaterale: 750 μL) prima del trattamento con il ligando. Durante il test è stata utilizzata EBM a siero ridotto.</li>
		<li>Incubare le cellule (utilizzando il mezzo ridotto dal siero nella fase 4.1.1.) nella camera apicale con ligando della transferrina (Cy3-Tf) marcato con fluorescenza (cianina 3) (concentrazione finale di 40 μg/ml) per 60 minuti a 37 °C. NOTA: Le piastre contenenti Cy3-Tf devono essere protette dalla luce per evitare lo sbiancamento fotografico del Cy3-Tf avvolgendovi un foglio di alluminio ed eseguendo l'esperimento in una cappa di coltura cellulare con le luci spente.</li>
		<li>Dopo 1 ora, posizionare la piastra sul ghiaccio e lavare il monostrato apicalmente e basolateralmente 4 volte (3-5 minuti per lavaggio) con il mezzo ridotto dal siero a RT per rimuovere il Cy3-Tf libero non legato. NOTA: Il lavaggio è essenziale per rimuovere le molecole traccianti libere e consentire una lettura accurata della transcitosi senza potenziali perdite dalla via paracellulare.</li>
		<li>Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero (come al punto 4.1.1.) agli inserti filtranti accuratamente lavati contenenti cellule e trasferire gli inserti in pozzetti freschi della piastra a 24 pozzetti contenente il mezzo preriscaldato ridotto dal siero.</li>
		<li>Incubare le cellule per altri 90 minuti nell'incubatore (37 °C e 5% di CO2), quindi raccogliere il terreno dalla camera basolaterale.</li>
		<li>Registrare l'intensità di fluorescenza della soluzione dalla camera basolaterale utilizzando un rilevatore di fluorescenza. I livelli di intensità di fluorescenza, misurati come unità fluorescenti relative (RFU), indicano la quantità di complesso Cy3-Tf transcitoso attraverso il monostrato HRMEC tramite transcitosi clatrin-dipendente.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggio di transcitosi in vitro mediato da caveole mediante HRP (Figura 6)<ol><li>Al raggiungimento della piena confluenza con valori di TEER intorno a 20 Ω·cm 2, il siero priva le cellule per 24 ore a 37 °C e al 5% di CO2 utilizzando terreno EBM contenente FBS allo 0,5% (terreno ridotto dal siero) prima del trattamento (come nella fase 4.1.1.). Il mezzo EBM ridotto dal siero è stato utilizzato durante l'intero test.</li>
		<li>Trattare le cellule nella camera apicale con i trattamenti desiderati e i controlli del veicolo. NOTA: Qui, abbiamo usato i modulatori Wnt come esempio per dimostrare la regolazione della transcitosi mediata da caveole mediante la via di segnalazione Wnt negli HRMEC: Norrin ricombinante umano e inibitore Wnt XAV939. In un esperimento tipico, le cellule sono state trattate per 24 ore in un incubatore (37 °C e 5% CO2) con le seguenti concentrazioni: Norrin (125 ng/mL), Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM) e soluzione di controllo del veicolo. Inoltre, è stato utilizzato anche un mezzo condizionato da Wnt3a (prodotto da cellule L Wnt-3A).</li>
		<li>Incubare le cellule nella camera apicale con HRP (5 mg/ml) per 15 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Successivamente, posizionare la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio e lavare intensamente le camere apicali e basolaterali 6 volte con tampone P (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM piruvato di sodio, 10 mM glucosio, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) per rimuovere l'HRP extracellulare libero. NOTA: Il lavaggio è essenziale per rimuovere le molecole traccianti libere e consentire una lettura accurata della transcitosi senza potenziali perdite dalla via paracellulare.</li>
		<li>Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero (come al punto 4.1.1.) nella camera apicale e trasferire gli inserti in un pozzetto fresco contenente mezzi preriscaldati.</li>
		<li>Incubare il monostrato per altri 90 minuti nell'incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 prima di prelevare il mezzo dalla camera basolaterale.</li>
		<li>Al mezzo raccolto, aggiungere 100 μL di substrato fluorogenico della perossidasi HRP (tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore e incubare a RT per 10 minuti prima di interrompere la reazione con 100 μL di soluzione Stop.</li>
		<li>Rilevare i livelli di prodotto di reazione del substrato HRP nel fluido utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. Misurare l'intensità di fluorescenza alla lunghezza d'onda di emissione di 420 nm (con eccitazione di 325 nm) e come unità fluorescenti relative (RFU). I valori indicano il livello di HRP transcitoso attraverso lo strato HRMEC attraverso la transcitosi mediata da caveole. NOTA: Il prodotto fluorescente qui utilizzato (Tabella dei materiali) non fotocandeggia. Non è necessaria una protezione leggera contro il fotosbiancamento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse o interessi finanziari da divulgare.

BRB svolge un ruolo essenziale nella salute e nella malattia della retina. Le tecniche in vitro che valutano la permeabilità vascolare si sono dimostrate strumenti cruciali negli studi riguardanti lo sviluppo e la funzione della barriera (BRB/BBB). La procedura qui descritta potrebbe essere utilizzata per studiare i meccanismi molecolari alla base della transcitosi EC o valutare i relativi modulatori molecolari che influenzano la permeabilità BRB. In vitro I saggi di transcitosi EC presentano molteplici...

La retina umana è uno dei tessuti più esigenti in termini di energia nel corpo. Il corretto funzionamento della retina neurale richiede un efficiente apporto di ossigeno e sostanze nutritive insieme a un flusso limitato di altre molecole potenzialmente dannose per proteggere l'ambiente retinico, che è mediato attraverso la barriera emato-retinica (BRB)1. Simile alla barriera emato-encefalica (BBB) nel sistema nervoso centrale, il BRB agisce come una barriera selettiva nell'occhio, regolando il movimento di ioni, acqua, aminoacidi e zucchero dentro e fuori dalla retina. BRB mantiene anche l'omeostasi retinica e il suo privilegio immunitario prevenendo l'esposizione a fattori circolatori come cellule immunitarie, anticorpi e agenti patogeni nocivi2. La disfunzione BRB contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell'occhio, come la retinopatia diabetica, la degenerazione maculare legata all'età (AMD), la retinopatia della prematurità (ROP), l'occlusione venosa retinica e l'uveite, con conseguente edema vasogenico e conseguente perdita della vista 3,4,5.
Il BRB è costituito da due barriere separate per due distinte reti vascolari oculari, rispettivamente: la vascolarizzazione retinica e il coriocapillare fenestrato sotto la retina. Il BRB interno (iBRB) è composto principalmente da cellule endoteliali microvascolari retiniche (RMEC) che rivestono la microvascolarizzazione retinica, che nutre gli strati neuronali retinici interni. D'altra parte, l'epitelio pigmentato retinico costituisce il componente principale del BRB esterno, che si trova tra la retina neurosensoriale e il coriocapillare2. Per l'iBRB, il trasporto molecolare attraverso le RMEC avviene attraverso entrambe le vie paracellulari e transcellulari (Figura 1). L'alto grado di selettività della sostanza attraverso l'iBRB si basa su (i) la presenza di complessi proteici giunzionali che limitano il trasporto paracellulare tra cellule endoteliali adiacenti (ECs) e (ii) bassi livelli di espressione di mediatori, trasportatori e recettori delle caveole all'interno delle cellule endoteliali che mantengono bassi tassi di trasporto transcellulare 1,6,7,8 . I complessi giunzionali che regolano il flusso paracellulare sono composti da giunzioni strette (claudine, occludine), giunzioni aderenti (caderine VE) e giunzioni gap (connessine), consentendo il passaggio di acqua e piccoli composti idrosolubili. Mentre le piccole molecole lipofile si diffondono passivamente attraverso l'interno delle RMEC, il movimento delle molecole lipofile e idrofile più grandi è regolato da vie transendoteliali guidate dall'ATP, tra cui il trasporto vescicolare e i trasportatori di membrana 5,9.
La transcitosi vescicolare può essere classificata come transcitosi caveolare mediata da caveolina, transcitosi clatrin-dipendente (e mediata dal recettore) e macropinocitosi indipendente dalla clatrina (Figura 2). Questi processi di trasporto vescicolare coinvolgono vescicole di dimensioni diverse, con i macropinosomi che sono i più grandi (che vanno da 200-500 nm) e le caveole che sono le più piccole (in media 50-100 nm), mentre le vescicole rivestite di clatrina vanno da 70-150 nm10. Le caveole sono invaginazioni della membrana plasmatica ricche di lipidi a forma di fiaschetta con un rivestimento proteico, composto principalmente da caveolina-1 che lega il colesterolo della membrana lipidica e altre proteine strutturali e di segnalazione attraverso il loro dominio di impalcatura caveolina11. Le caveoline lavorano insieme alla cavina attaccata perifericamente per promuovere la stabilizzazione delle caveole sulla membrana plasmatica12. Le membrane caveolari possono anche trasportare recettori per altre molecole come insulina, albumina e lipoproteine circolanti tra cui lipoproteine ad alta densità (HDL) e lipoproteine a bassa densità (LDL) per aiutare il loro movimento attraverso le cellule endoteliali13. Durante lo sviluppo, la formazione di BRB funzionale dipende dalla soppressione della transcitosi EC8. L'endotelio retinico maturo, quindi, ha livelli relativamente bassi di caveole, caveolina-1 e recettori dell'albumina rispetto ad altre cellule endoteliali in condizioni fisiologiche, contribuendo alle sue proprietà barriera 4,9.
Poiché la degradazione dell'iBRB è un importante segno distintivo di molte condizioni patologiche dell'occhio, è essenziale sviluppare metodi per valutare la permeabilità vascolare retinica in vivo e in vitro. Questi metodi aiutano a fornire probabili approfondimenti sui meccanismi di integrità della BRB compromessa e a valutare l'efficacia di potenziali bersagli terapeutici. Gli attuali saggi di imaging in vivo o di perdita vascolare quantitativa impiegano tipicamente fluorescenti (fluoresceina di sodio e destrano), colorimetrici (substrato di colorante blu di Evans e perossidasi di rafano [HRP]) o traccianti radioattivi14 per rilevare lo stravaso dalla vascolarizzazione nei tessuti retinici circostanti con imaging al microscopio o in lisato tissutale isolato. Un tracciante ideale per quantificare l'integrità vascolare dovrebbe essere inerte e abbastanza grande da permeare liberamente i vasi compromessi mentre è confinato all'interno di capillari sani e intatti. I metodi che impiegano fluoresceina di sodio o destrano coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC-destrano) nell'angiografia con fluoresceina del fondo vivo (FFA) o in supporti piatti retinici isolati sono ampiamente utilizzati per quantificare lo stravaso retinico in vivo o ex vivo. Il fitc-destrano ha il vantaggio di essere disponibile in diversi pesi molecolari che vanno da 4-70 kDa per studi selettivi di dimensioni15,16,17. L'albumina FITC (~68 kDa) è un tracciante proteico alternativo di grandi dimensioni di rilevanza biologica per gli studi di perdita vascolare18. Il colorante Evans Blue, iniettato per via intracardica19, retroorbitalmente o attraverso la vena caudale 20, si basa anche sul suo legame con l'albumina endogena per formare una grande molecola che può essere quantificata principalmente mediante rilevazione spettrofotometrica o, meno comunemente, microscopia a fluorescenza in supporti piatti20,21. Queste metodologie quantitative o di imaging della luce, tuttavia, spesso non distinguono il trasporto paracellulare dal trasporto trans-endoteliale. Per l'analisi specifica della transcitosi con visualizzazione ultrastrutturale delle vescicole transcitose, molecole traccianti come HRP sono tipicamente utilizzate per localizzare vescicole transcitose all'interno di cellule endoteliali che possono essere osservate al microscopio elettronico22,23,24 (Figura 3A-C).
Lo sviluppo e l'uso di modelli iBRB in vitro per valutare la permeabilità delle cellule endoteliali potrebbe fornire una valutazione robusta e ad alto rendimento per integrare gli esperimenti in vivo e aiutare lo studio dei regolatori molecolari della perdita vascolare. I saggi comunemente usati per valutare il trasporto paracellulare e l'integrità delle giunzioni strette includono la resistenza elettrica transendoteliale (TEER), una misura della conduttanza ionica (Figura 4)2,25 e il saggio di perdita vascolare in vitro utilizzando traccianti fluorescenti a piccolo peso molecolare 26. Inoltre, i saggi di transcitosi basati sulla transferrina che modellano la BBB sono stati utilizzati per esplorare la transcitosi27 clatrina-dipendente. Nonostante ciò, i saggi per valutare la BRB e, più specificamente, la transcitosi caveolare EC retinica in vitro sono limitati.
In questo studio, descriviamo un test di transcitosi EC utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC) come modello in vitro per determinare la permeabilità iBRB e la transcitosi EC. Questo test si basa sulla capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina o la HRP attraverso le vie di transcitosi mediate dal recettore o caveolae-dipendenti, rispettivamente (Figura 2). Gli HRMEC coltivati fino alla piena confluenza nella camera apicale (cioè inserto filtrante) sono stati incubati con transferrina coniugata fluorescente (Cy3-Tf) o HRP per misurare l'intensità della fluorescenza corrispondente ai livelli di transferrina o HRP trasferiti alla camera inferiore esclusivamente attraverso la transcitosi EC. La confluenza del monostrato cellulare può essere confermata misurando TEER, indicando l'integrità della giunzione stretta25. Per dimostrare la tecnica di saggio TEER e transcitosi, sono stati utilizzati modulatori molecolari noti della permeabilità vascolare e della transcitosi EC, incluso il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF)28 e quelli nella segnalazione Wnt (ligandi Wnt: Wnt3a e Norrin)29.

<table><tbody><tr><td>Armadio di sicurezza biologica&nbsp;</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Petridish per colture cellulari&nbsp;</td><td>Nest Biotechnology</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>centrifuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga (15 mL)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Provette da centrifuga (50 mL)</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3-transferrina umana&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro (2 chip)</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>Perossidasi di rafano (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC)</td><td>Sistemi cellulari</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific Celle</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L (per terreno condizionato con controllo)</td><td>Celle ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A (per terreno condizionato con Wnt3A)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Lettore</td> di piastre multimodale Leica <td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tampone (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu Kit substrato perossidasi fluorogenica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>Norrin (rhNorrin) umano ricombinanteR</td><td>& D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dell'endotelio vascolare umano ricombinante (rhVEGF)</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa (0,22 & micro; m)</td><td>Inserti Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Transwell (6,5 mm transwell, 0,4 &; micro; m pore inserto membrana in poliestere)</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%) (1x)</td><td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr>Bagno<td>d'acqua</td><td>Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (Wnt/&beta;-catenina inibitore)</td><td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

La disfunzione della barriera emato-retinica (BRB) contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie vascolari dell'occhio, spesso con conseguente edema retinico e conseguente perdita della vista. La barriera emato-retinica interna (iBRB) è composta principalmente da endotelio vascolare retinico con bassa permeabilità in condizioni fisiologiche. Questa caratteristica di bassa permeabilità è strettamente regolata e mantenuta da bassi tassi di trasporto paracellulare tra cellule endoteliali microvascolari retiniche adiacenti, nonché trasporto transcellulare (transcitosi) attraverso di esse. La valutazione della permeabilità della barriera transcellulare retinica può fornire informazioni fondamentali sull'integrità dell'iBRB in salute e malattia. In questo studio, descriviamo un test di transcitosi delle cellule endoteliali (EC), come modello in vitro per valutare la permeabilità all'iBRB, utilizzando cellule endoteliali microvascolari retiniche umane (HRMEC). Questo test valuta la capacità degli HRMEC di trasportare la transferrina e la perossidasi di rafano (HRP) nei processi di trasporto transcellulare mediati dal recettore e dalle caveole, rispettivamente. Gli HRMEC completamente confluenti coltivati su membrana porosa sono stati incubati con transferrina marcata con fluorescenza (transcitosi clatrin-dipendente) o HRP (transcitosi mediata da caveole) per misurare i livelli di transferrina o HRP trasferiti nella camera inferiore, indicativi dei livelli di transcitosi attraverso il monostrato EC. La segnalazione Wnt, una via nota che regola l'iBRB, è stata modulata per dimostrare il metodo di analisi della transcitosi basato su HRP mediato da caveolae. Il test di transcitosi EC qui descritto può fornire uno strumento utile per studiare i regolatori molecolari della permeabilità EC e dell'integrità di iBRB nelle patologie vascolari e per lo screening dei sistemi di somministrazione dei farmaci.

Le immagini EM dell'endotelio vascolare retinico mostrano il trasporto vescicolare transcitotico e le vescicole caveolari nelle cellule endoteliali in vivo. La transcitosi EC può essere visualizzata in vivo all'interno di sezioni trasversali retiniche con precipitato marrone scuro che riflette i vasi sanguigni contenenti HRP al microscopio ottico (Figura 3A) e come precipitato denso di elettroni indicativo di vescicole transcitotiche contenenti HRP (...

Questo protocollo illustra un test di transcitosi delle cellule endoteliali in vitro come modello per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna misurando la capacità delle cellule endoteliali microvascolari retiniche umane di trasportare la perossidasi di rafano attraverso le cellule nei processi di trasporto transcellulare mediati da caveole.

Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Questo protocollo fornisce un utile modello cellulare per studiare la funzione e la permeabilità di barriere vascolari selettive come la barriera emato-retinica o emato-encefalica con un focus specifico sulla transcitosi endoteliale. Questo test è facile da configurare e utilizzare e non richiede animali vivi. Può essere utilizzato per studiare vari regolatori molecolari della permeabilità delle cellule endoteliali e della transcitosi che influenzano l'integrità della barriera emato-retinica interna.Questo test può fornire approfondimenti sulla biologia vascolare e sulla ricerca oculare e cerebrale, consentendo una migliore comprensione dei meccanismi molecolari alla base del controllo BRB BBB ed esplorando la potenziale somministrazione di farmaci attraverso le barriere. Per iniziare, preparare gli inserti filtranti per la coltura cellulare per la semina di cellule endoteliali microvascolari retiniche umane o HRMEC, rivestendo ogni inserto con 200 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,1% per 30 minuti sotto una cappa a flusso laminare. Assicurarsi che la soluzione copra l'intera superficie inferiore dell'inserto filtrante.Prendi una capsula di Petri con HRMEC coltivati incubati a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e aspira il terreno di crescita. Risciacquare delicatamente le cellule due volte con 10 millilitri di 1X PBS sotto la cappa a flusso laminare per eliminare le potenziali cellule galleggianti o morte. Dissociare le cellule con 0,5-1 millilitro di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% e posizionare la capsula di Petri nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 5 minuti.Estinguere l'attività della tripsina aggiungendo da 4,5 a 9 millilitri di terreno di crescita e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri utilizzando una pipetta da 10 millilitri. Girare le cellule a 200 volte g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con attenzione il surnatante e risospendere il pellet in 3 millilitri di terreno di crescita.Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro manuale o un contatore di cellule automatizzato e seminare a una densità di 40.000 cellule per inserto del filtro. Il volume della sospensione cellulare per ciascun inserto è di 250 microlitri. Aspirare la soluzione di rivestimento dai pozzetti contenenti inserti permeabili e trasferire 250 microlitri della sospensione cellulare per inserto, quindi aggiungere solo il mezzo a uno degli inserti, che verrà utilizzato come controllo in bianco per la misurazione della resistenza elettrica transendoteliale o TEER.Contemporaneamente, aggiungere anche 750 microlitri di mezzo per pozzetto nelle camere basolaterali. Mantenere la piastra a 24 pozzetti con inserti permeabili nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 7-12 giorni fino a quando le cellule coltivate diventano completamente confluenti e viene raggiunto il valore TEER desiderato di circa 20 ohm per centimetro quadrato. Prima delle misurazioni TEER, posizionare la piastra a 24 pozzetti contenente celle nella cappa a flusso laminare a temperatura ambiente per 15-20 minuti per l'equilibrio della temperatura.Per misurare il TEER per HRMEC, utilizzando un sistema di resistenza elettrica epiteliale volt / ohm, collegare l'elettrodo al misuratore e bilanciare l'elettrodo immergendolo prima in etanolo al 70% per 15-20 minuti e poi immergendolo brevemente nel terreno di crescita EGM della coltura cellulare. Eseguire la misurazione TEER immergendo accuratamente l'elettrodo, in modo che la punta più corta si trovi nell'inserto e la punta più lunga tocchi il fondo del pozzetto. Misurare prima la resistenza attraverso il controllo vuoto, quindi per ciascun inserto, misurare TEER in triplice copia.Dopo aver raggiunto la confluenza con valori TEER di circa 20 ohm centimetri quadrati, privare le cellule del siero per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica utilizzando 0,5% FBS in EBM in entrambe le camere prima del trattamento con il ligando. Durante il test è stata utilizzata EBM a siero ridotto. Incubare le cellule utilizzando il mezzo ridotto dal siero nella camera apicale con simano-3-tag fluorescente al ligando della transferrina per 60 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo aver lavato il monostrato apicale e basolateralmente 4 volte con il mezzo ridotto dal siero, aggiungere il mezzo fresco agli inserti filtranti contenenti le celle e trasferire gli inserti in pozzetti freschi della piastra a 24 pozzetti contenente il mezzo preriscaldato ridotto dal siero. Incubare le cellule per altri 90 minuti nell'incubatore e quindi raccogliere il mezzo dalla camera basolaterale. Registrare l'intensità di fluorescenza della soluzione dalla camera basolaterale utilizzando un rilevatore di fluorescenza.Dopo aver raggiunto la confluenza con valori TEER di circa 20 ohm centimetri quadrati, privare le cellule del siero per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica utilizzando 0,5% FBS in EBM in entrambe le camere prima del trattamento con il ligando. Durante il test è stata utilizzata EBM a siero ridotto. Quindi, trattare le cellule nella camera apicale con i trattamenti desiderati e i controlli del veicolo.Aggiungere 5 milligrammi per millilitro di perossidasi di rafano, o HRP, alle cellule, e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere il mezzo fresco ridotto dal siero alla camera apicale e trasferire gli inserti in un pozzetto fresco contenente mezzi preriscaldati. Incubare il monostrato per altri 90 minuti nell'incubatore.Dopo aver raccolto il terreno dalla camera basolaterale, aggiungere 100 microlitri di substrato di perossidasi fluorogenica HRP al mezzo raccolto e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Interrompere la reazione con 100 microlitri di soluzione di arresto e rilevare i livelli di prodotto di reazione del substrato HRP nel mezzo utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza. Prima di dimostrare i saggi di transcitosi in vitro, la visualizzazione della transcitosi delle cellule endoteliali nella retina viene mostrata come informazione di base.Qui, l'immagine del microscopio ottico mostra un lume di vaso sanguigno riempito di HRP da una sezione retinica di topo selvatico di 3 mesi colorata con DAB. HRP è stato iniettato retroorbitalmente. I vasi retinici riempiti di HRP possono essere visti come precipitati marrone scuro al microscopio ottico.La sezione ultrasottile del microscopio elettronico a trasmissione mostra vasi transcitotici riempiti di HRP con RMEC raffiguranti transcitosi EC attraverso la barriera emato-retinica interna. Qui, la grande vescicola riflette potenzialmente il macropinosoma e un globulo rosso sul lato del luminolo. L'immagine TeM mostra piccole vescicole transcitotiche riempite di HRP, probabilmente vescicole caveola, all'interno della RMEC.La colorazione immunoistochimica dell'anticorpo CAV-1 e dell'isolectina B4 dimostra la localizzazione di CAV-1, un marker di vescicole caveola nei vasi sanguigni della retina, nella retina di topo wild-type di 3 mesi. L'immagine TeM del CAV-1 marcato con immunogold all'interno delle cellule endoteliali retiniche è mostrata qui con un'immagine ingrandita della vescicola caveola positiva al CAV-1. Per il test di transcitosi EC mediata da clatrina in HRMEC utilizzando transferrina, qui, un'immagine al microscopio a fluorescenza mostra la transferrina Cy3 endocitosa in colore rosso all'interno di HRMEC colorata con DAPI in blu.Per la transcitosi EC mediata da caveole utilizzando HRP, la segnalazione Wnt qui viene utilizzata come esempio per dimostrare il test. Recentemente è stato scoperto che la segnalazione Wnt regola la transcitosi EC mediata da caveole. Le cellule sono state trattate con il mezzo Wnt3a-based dell'attivatore della via Wnt e Norrin ricombinante, con o senza l'inibitore della segnalazione Wnt XAV939 e i loro controlli reattivi.Gli attivatori Wnt hanno ridotto il livello della transcitosi basata su HRP, che è stata invertita da XAV939. La corretta misurazione TEER è fondamentale per determinare l'integrità del monostrato. È fortemente influenzato da vari fattori come la manipolazione impropria, le fluttuazioni di temperatura, il terreno di coltura, la durata della coltura, eccetera.Questo test potrebbe essere modificato come co-coltura o sistemi di coltura organotipica 3D che imitano le condizioni in vivo.

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Saggio di transcitosi delle cellule endoteliali come modello in vitro per valutare la permeabilità della barriera emato-retinica interna (Video) | JoVE Journal

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