Modello sperimentale di immunoterapia del melanoma utilizzando la vaccinazione tumorale con una citochina ematopoietica

Questo protocollo fornisce un modello clinico di immunoterapia dei tumori solidi e una piattaforma di ricerca per studiare la relazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie infiltranti. Questo vaccino tumorale a base cellulare è conveniente, semplice da usare e può essere combinato con altre modalità terapeutiche come il blocco del checkpoint, per ottenere un effetto additivo o sinergico che può comportare un'immunità tumorale più potente e elevata. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Ann Balancio, un tecnico di ricerca del mio laboratorio.

Per iniziare, colture di cellule di melanoma B16-F10 in IMDM, contenenti il 10% di FBS inattivo dal calore, 2 glutammina millimolare, 1 piruvato di sodio millimolare, 1 amminoacidi non essenziali MEM millimolari e 100 unità per millilitro ciascuna di penicillina e streptomicina. Mantenere la linea cellulare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Seminare e raccogliere le cellule B16-F10 come descritto nel manoscritto testuale.

Rimuovere il terreno di coltura e lavare i palloni una volta con PBS. Aspirare PBS e aggiungere 5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25%, quindi picchiettare bruscamente sul bordo del pallone di coltura. Aggiungere 15 millilitri di terreno di coltura per neutralizzare la tripsina-EDTA e versare il contenuto del matraccio in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Lavare la superficie del piatto con 10 millilitri di PBS e versare nello stesso tubo da centrifuga da 50 millilitri. Centrifugare le celle per 5 minuti a 200 RCF. Scartare il surnatante e rompere il pellet cellulare toccando con le dita il fondo del tubo.

Aggiungere 10 millilitri freddi di PBS e pipettare delicatamente la sospensione cellulare. Quindi, contare manualmente le cellule utilizzando un emocitometro. Tenere le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione.

Impiantare per via intradermica 500.000 cellule tumorali B16-F10 in 50 microlitri di PBS freddo nel fianco sinistro, utilizzando un ago di calibro 30. Potrebbe essere necessario regolare la dose di cellule tumorali B16-F10 impiantate in un intervallo da 50.000 a 500.000 cellule per uno sviluppo tumorale di successo. Dopo l'implementazione, misurare la lunghezza e la larghezza del tumore tre volte alla settimana utilizzando un calibro digitale elettronico.

Calcolare il volume del tumore e trattare i topi con il vaccino tumorale quando i tumori hanno raggiunto una dimensione di due millimetri come descritto nel manoscritto del testo. Utilizzando un irradiatore a raggi X impostato a 160 kilovolt e 25 milliampere, irradiare le cellule a 150 dosi grigie di raggi gamma. Contare e controllare la vitalità cellulare mediante colorazione blu tripano prima dell'iniezione.

Iniettare per via intradermica i topi con 1 milione di cellule B16-Flt3L irradiate in 50 microlitri di PBS freddo sullo stesso fianco dell'impianto tumorale originale. Circa un centimetro dal sito del tumore primario nei giorni 3, 6 e 9 dopo l'impianto iniziale della cellula. Contrassegnare i siti di iniezione del vaccino con una penna colorata per distinguerli dal tumore primario.

Se inizialmente sono state impiantate 50.000 cellule B16-F10, si raccomanda di eseguire il trattamento vaccinale nei giorni 8, 11 e 14. Rimosso chirurgicamente il tumore con la pelle da ciascun topo eutanasia e metterlo in una piastra a 24 pozzetti con 1 millilitro di 10% FBS RPMI 1640 mezzo. Tagliare i tumori in piccoli pezzi in due millilitri di tampone di digestione e incubare per 25 minuti a 37 gradi Celsius.

Aggiungere 10 millilitri di 10% FBS RPMI 1640 mezzo per interrompere la digestione. Trasferire le cellule su un filtro cellulare da 40 micrometri utilizzando una pipetta sierologica da 25 millilitri. Quindi utilizzare lo stantuffo di una siringa da un millilitro per macinare i tessuti.

Centrifugare le celle a 500 RCF per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Risospendere il pellet in 5 millilitri di mezzo specifico con gradiente di densità del 40% in PBS diluito a concentrazione 1x. Aggiungere lentamente la sospensione cellulare sopra 5 millilitri di mezzo specifico con gradiente di densità dell'80% contenente PBS.

Centrifugare alle celle a 325 RCF con una regolazione del freno bassa per 23 minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura lo strato di leucociti all'interfaccia tra il 40% e l'80% del mezzo specifico del gradiente di densità e farlo passare attraverso un filtro cellulare di 40 micrometri. Centrifugare le celle a 500 RCF per 5 minuti a 4 gradi Celsius.

Incubare il pellet in due millilitri di tampone di lisi dei globuli rossi per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 millilitri di 10% FBS RPMI 1640 mezzo per estinguere il tampone di lisi RBC. Centrifugare le celle a 400 RCF per 5 minuti a 4 gradi Celsius.

Risospendere le celle in 0,5 millilitri di 10% FBS RPMI 1640 terreno e contare il numero totale di celle prima dell'uso per ulteriori analisi. Raccogliere la milza o i linfonodi drenanti come controlli per la strategia di gating dei sottogruppi di cellule immunitarie mediante analisi citometrica a flusso. Seguire il metodo di isolamento cellulare descritto nel manoscritto testuale.

Un punto nero visibile delle cellule B16-F10 impiantate è stato solitamente osservato sulla superficie della pelle circa tre giorni dopo l'impianto del tumore. I topi sono stati trattati con un vaccino tumorale tre, sei e nove giorni dopo che il nodulo tumorale aveva raggiunto o superato le dimensioni di due millimetri. Una significativa riduzione della crescita tumorale è stata osservata nel gruppo di topi vaccinati circa due settimane dopo l'impianto del tumore.

Le cellule raccolte dallo strato di leucociti contenevano molte cellule tumorali, rendendo difficile definire facilmente la popolazione di linfociti. Pertanto, gli splenociti sono stati utilizzati in parallelo, per il corretto gating dei sottogruppi di cellule immunitarie intratumorali nell'analisi della citometria a flusso. Le strategie di gating di CD103 positivo, CD11C positivo DC, CD8 positivo, CD4 positivo e Treg sono state tracciate insieme alla matrice di compensazione.

Sono stati inoltre forniti dati rappresentativi dei conti acquisiti e della frequenza di ciascuna popolazione. La DC CD103 positiva intratumorale e CD11C positiva da topi vaccinati ha mostrato un'espressione significativamente elevata del ligando co-stimolante CD86. I topi vaccinati hanno anche mostrato un aumento delle cellule CD8 positive e CD4 positive infiltranti il tumore, Foxp3 negative, nonché nei CTL CD8 positivi al granzima B positivo e all'interferone gamma.

Mantenere una distanza sufficiente tra il tumore primario e il vaccino tumorale. Questa separazione fisica è fondamentale per evitare la potenziale fusione tra i due impianti tumorali.