Visualizzazione della localizzazione subcellulare di una proteina nel cuore utilizzando l'immuno-marcatura mediata da punti quantici seguita da microscopia elettronica a trasmissione
16 settembre 2022
Il presente protocollo descrive un metodo di immuno-marcatura di una proteina nelle sezioni del tessuto cardiaco utilizzando punti quantici. Questa tecnica fornisce uno strumento utile per visualizzare la localizzazione e l'espressione subcellulare di qualsiasi proteina a livello ultrastrutturale.
Determinare la localizzazione subcellulare di una proteina è fondamentale per delineare la sua corretta funzione e i meccanismi coinvolti in essa. Questo metodo può aiutarci a visualizzare la localizzazione subcellulare di una proteina a livello di ultra struttura. L'immunomarcatura mediata da punti quantici è più stabile, resistente al fotosbiancamento, ha i suoi spettri di emissione, produce un'alta densità elettronica e mostra una maggiore efficienza e ritenzione sui tessuti con una migliore penetrazione nei tessuti.
Più fasi del processo, ovvero fissazione, incisione, blocco e concentrazione ottimale di punti quantici, sono passaggi impegnativi da ottimizzare. Si consiglia di provare più punti temporali e concentrazioni dei reagenti utilizzati. Un'altra sfida è la gestione delle griglie per le quali funzionano solo la pazienza e, naturalmente, la pratica.
A dimostrare la procedura saranno Chowdhury Abdullah, un borsista postale, Naznin Remex, uno studente laureato del mio laboratorio, e Brandon Hartman, supervisore della microscopia elettronica dei nostri servizi di microscopia elettronica. Dopo aver anestetizzato i topi e aperto la cavità toracica, abbondante il cuore usando glutaraldeide ghiacciata al 3% in 0,1 molari di tampone cacodilato di sodio per due minuti. Utilizzare un ago da 25 gauge di cinque per otto pollici per introdurre i fissativi nel cuore usando la pressione di gravità.
Immediatamente dopo che il cuore inizia a riempirsi con il fissativo, sollevare l'apice del cuore per alleviare la pressione. Tagliare i vasi sottostanti a uno o due millimetri dal cuore e lasciare che i liquidi drenino. Seziona il cuore.
Rimuovere gli atri e far cadere i ventricoli in una capsula di Petri contenente glutaraldeide ghiacciata al 3% e cacodilato di sodio 0,1 molare. Fai un taglio a farfalla dopo 30-60 minuti di fissazione e rimetti il ventricolo nella capsula di Petri. Tritare il cuore usando una lama chirurgica in piccoli cubetti di un millimetro cubo.
Fissare e immergere il tessuto cardiaco sezionato in soluzione di glutaraldeide e cacodilato per 24 ore a quattro gradi Celsius. Dopo 24 ore di fissazione, lavare il tessuto in tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare due volte per 20 minuti. Rimuovere il tessuto dal tampone di cacodilato di sodio e immergere in una soluzione di tetrossido di osmio al 2% per quattro ore a temperatura ambiente.
Dopo l'osmication, immergere il tessuto in una soluzione di acetato di sodio al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, immergere il tessuto in una soluzione di acetato di uranile al 2% per un'ora a temperatura ambiente. Dopo la colorazione dell'acetato di uranile, disidratare il tessuto in sequenza attraverso gli alcoli graduati e l'acetone.
Incorporare il tessuto disidratato in resina epossidica a bassa viscosità come descritto nel manoscritto. Mettere il tessuto in resina fresca in micro stampi da otto millimetri e polimerizzare il tessuto incorporato a 70 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver trovato l'area di interesse, utilizzando un coltello ultra 45 gradi, produrre sezioni ultrasottili oro pallido.
Posiziona queste sezioni ultrasottili sul lato opaco di una griglia di rame a 200 maglie. Inizia la colorazione smascherando l'antigene mettendo 20 microlitri di metaperiodato della soluzione di incisione su un film di paraffina pulito. Posizionare la griglia essiccata con sezioni di tessuto sulla goccia della soluzione di incisione.
Lasciare la griglia di sezione sulla soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni di tessuto inciso ponendole su una goccia di acqua distillata per 60 secondi. Bloccare le aldeidi residue posizionando la griglia di sezione su una goccia di soluzione di glicina molare 0,05 per 10 minuti a temperatura ambiente.
Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro per rimuovere la soluzione di glicina residua. Posizionare la griglia di sezione in 10-20 microlitri di soluzione bloccante per 25 minuti a temperatura ambiente. Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro e posizionare le sezioni della griglia sul diluente anticorpale per il condizionamento a temperatura ambiente per 10 minuti.
Incubare le sezioni della griglia con anticorpo primario per un'ora e 30 minuti in una camera umidificata. Asciugare la griglia e lavare le sezioni della griglia con diluente anticorpale due volte per cinque minuti ciascuna. Incubare le sezioni della griglia con anticorpi secondari biotinilati per un'ora in una camera umidificata.
Una volta asciugata la griglia, lavare le sezioni della griglia con diluente anticorpale due volte per cinque minuti ciascuna. Incubare le sezioni della griglia in streptavidina coniugata QD per un'ora in una camera a temperatura ambiente. Prevenire l'esposizione alla luce coprendo la camera con un foglio di alluminio.
Dopo aver asciugato i bordi della griglia con carta da filtro, lavare le sezioni della griglia posizionandole su gocce d'acqua per due minuti e asciugare i bordi della griglia. Inserire il supporto del campione nella colonna del microscopio e attivare l'interruttore della pompa per valutare il goniometro, seguito dall'inserimento completo del supporto del campione nella colonna del microscopio. Concentrati bene sull'area desiderata.
Cattura l'immagine utilizzando una fotocamera digitale ad alta velocità e salva il file in formato tif. Le membrane mitocondriali, i lisosomi e l'interfaccia mitocondriale della membrana del reticolo endoplasmatico o del reticolo sarcoplasmatico hanno mostrato la presenza di punti quantici marcati con Sigmar1. Le sezioni cardiache sono state visualizzate utilizzando l'immunoglobulina G del coniglio e punti quantici come controllo isotipo per l'anticorpo primario del coniglio anti-Sigmar1.
Una cosa importante da considerare mentre si lavora su questo protocollo è smascherare il tempo per l'antigene. Se le sezioni di tessuto vengono incise troppo a lungo, la soluzione metaperiodata creerà perforazioni in sezioni di tessuto sottile. L'etichettatura mediata da punti quantici sta guadagnando attenzione nel rilevamento del tumore, nella profilazione dello stato molecolare e immunitario del tumore e nell'imaging dei tessuti, aprendo una nuova strada per la diagnostica medica.
I punti quantici sono anche utili nel trattamento dei tumori attraverso terapie fotodinamiche e anomalie oftalmiche fornendo farmaci agli occhi.
Panoramica
Questo studio delinea un protocollo per l'immuno-etichettatura delle proteine in sezioni di tessuto cardiaco utilizzando i quantum dots, che consente la visualizzazione della localizzazione e dell'espressione delle proteine a livello ultrastrutturale. Il metodo è cruciale per comprendere la funzione delle proteine e i meccanismi associati.
Componenti principali dello studio
Area di ricerca
- Localizzazione delle proteine
- Imaging del tessuto cardiaco
- Quantum dots nella microscopia
Sfondo
- Determinare la localizzazione delle proteine è essenziale per comprendere le funzioni biologiche.
- I quantum dots offrono vantaggi come stabilità e resistenza alla fotobleaching.
- Ottimizzare i metodi di fissazione e di inglobamento è impegnativo ma critico per un imaging efficace.
Metodi utilizzati
- Immunoetichettatura mediata da quantum dots
- Tessuto cardiaco di topi
- Microscopia elettronica e varie tecniche di colorazione
Risultati principali
- È stata dimostrata l'immunoetichettatura di successo di Sigmar1 nelle sezioni di tessuto cardiaco.
- L'imaging ad alta risoluzione ha rivelato la presenza di quantum dots nelle membrane mitocondriali e in altre strutture cellulari.
- Sono state stabilite condizioni ottimali per la rivelazione dell'antigene per evitare danni ai tessuti.
Conclusioni
- Questo protocollo migliora la visualizzazione della localizzazione delle proteine nei tessuti cardiaci utilizzando i quantum dots.
- I risultati contribuiscono ai progressi nella diagnostica medica e nella ricerca terapeutica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Precise subcellular localization of proteins in cardiac tissue is essential for mechanistic de-risking and target validation in early discovery pipelines. Quantum dots-mediated immunolabeling combined with transmission electron microscopy (TEM) enables high-resolution visualization, supporting predictive confidence in protein function assignments. This capability strengthens translational continuity and informs risk-adjusted portfolio decisions for cardiovascular and broader organ system research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein distribution at the ultrastructural level for functional hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying protein localization within organelles and membrane interfaces.
- Improves predictive confidence in target selection by providing spatial context for protein activity.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue sections for downstream quantitative imaging workflows.
- Enhances assay reproducibility through stable, photobleaching-resistant quantum dot labeling.
- Provides high-resolution, quantitative outputs for comparative analysis of protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular localization data with disease-relevant cardiac models for translational biomarker development.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation by mapping protein presence in situ.
- Supports risk-adjusted advancement by confirming target engagement at the organelle level.
Pipeline & Workflow Integration
This quantum dot-TEM workflow integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, providing a reusable platform for protein localization studies across organ systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein distribution in cardiac tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables high-resolution measurement of protein localization for condition comparison.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by confirming subcellular protein presence.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse protein localization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Provides stable, reproducible, and scalable imaging for cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy and immunolabeling techniques.
- Demands access to TEM instrumentation and quantum dot reagents.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, staining, and imaging protocols.
- Adaptable to various tissue types and organ systems with protocol optimization.
- Optimization of antigen unmasking and reagent concentrations is critical to avoid tissue damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Animal Preparation
2:39
Heart Tissue Processing and Embedding
3:47
Tissue Sectioning Using an Ultramicrotome and Ultrathin Heart Section Staining
6:19
Transmission Electron Microscopy Imaging
6:48
Results: Visualization of Sigmar1 Using Quantum Dots
7:22
Conclusion
