Visualizzazione della localizzazione subcellulare di una proteina nel cuore utilizzando l'immuno-marcatura mediata da punti quantici seguita da microscopia elettronica a trasmissione

Determinare la localizzazione subcellulare di una proteina è fondamentale per delineare la sua corretta funzione e i meccanismi coinvolti in essa. Questo metodo può aiutarci a visualizzare la localizzazione subcellulare di una proteina a livello di ultra struttura. L'immunomarcatura mediata da punti quantici è più stabile, resistente al fotosbiancamento, ha i suoi spettri di emissione, produce un'alta densità elettronica e mostra una maggiore efficienza e ritenzione sui tessuti con una migliore penetrazione nei tessuti.

Più fasi del processo, ovvero fissazione, incisione, blocco e concentrazione ottimale di punti quantici, sono passaggi impegnativi da ottimizzare. Si consiglia di provare più punti temporali e concentrazioni dei reagenti utilizzati. Un'altra sfida è la gestione delle griglie per le quali funzionano solo la pazienza e, naturalmente, la pratica.

A dimostrare la procedura saranno Chowdhury Abdullah, un borsista postale, Naznin Remex, uno studente laureato del mio laboratorio, e Brandon Hartman, supervisore della microscopia elettronica dei nostri servizi di microscopia elettronica. Dopo aver anestetizzato i topi e aperto la cavità toracica, abbondante il cuore usando glutaraldeide ghiacciata al 3% in 0,1 molari di tampone cacodilato di sodio per due minuti. Utilizzare un ago da 25 gauge di cinque per otto pollici per introdurre i fissativi nel cuore usando la pressione di gravità.

Immediatamente dopo che il cuore inizia a riempirsi con il fissativo, sollevare l'apice del cuore per alleviare la pressione. Tagliare i vasi sottostanti a uno o due millimetri dal cuore e lasciare che i liquidi drenino. Seziona il cuore.

Rimuovere gli atri e far cadere i ventricoli in una capsula di Petri contenente glutaraldeide ghiacciata al 3% e cacodilato di sodio 0,1 molare. Fai un taglio a farfalla dopo 30-60 minuti di fissazione e rimetti il ventricolo nella capsula di Petri. Tritare il cuore usando una lama chirurgica in piccoli cubetti di un millimetro cubo.

Fissare e immergere il tessuto cardiaco sezionato in soluzione di glutaraldeide e cacodilato per 24 ore a quattro gradi Celsius. Dopo 24 ore di fissazione, lavare il tessuto in tampone di cacodilato di sodio 0,1 molare due volte per 20 minuti. Rimuovere il tessuto dal tampone di cacodilato di sodio e immergere in una soluzione di tetrossido di osmio al 2% per quattro ore a temperatura ambiente.

Dopo l'osmication, immergere il tessuto in una soluzione di acetato di sodio al 2% per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, immergere il tessuto in una soluzione di acetato di uranile al 2% per un'ora a temperatura ambiente. Dopo la colorazione dell'acetato di uranile, disidratare il tessuto in sequenza attraverso gli alcoli graduati e l'acetone.

Incorporare il tessuto disidratato in resina epossidica a bassa viscosità come descritto nel manoscritto. Mettere il tessuto in resina fresca in micro stampi da otto millimetri e polimerizzare il tessuto incorporato a 70 gradi Celsius durante la notte. Dopo aver trovato l'area di interesse, utilizzando un coltello ultra 45 gradi, produrre sezioni ultrasottili oro pallido.

Posiziona queste sezioni ultrasottili sul lato opaco di una griglia di rame a 200 maglie. Inizia la colorazione smascherando l'antigene mettendo 20 microlitri di metaperiodato della soluzione di incisione su un film di paraffina pulito. Posizionare la griglia essiccata con sezioni di tessuto sulla goccia della soluzione di incisione.

Lasciare la griglia di sezione sulla soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le sezioni di tessuto inciso ponendole su una goccia di acqua distillata per 60 secondi. Bloccare le aldeidi residue posizionando la griglia di sezione su una goccia di soluzione di glicina molare 0,05 per 10 minuti a temperatura ambiente.

Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro per rimuovere la soluzione di glicina residua. Posizionare la griglia di sezione in 10-20 microlitri di soluzione bloccante per 25 minuti a temperatura ambiente. Tamponare i bordi della griglia su carta da filtro e posizionare le sezioni della griglia sul diluente anticorpale per il condizionamento a temperatura ambiente per 10 minuti.

Incubare le sezioni della griglia con anticorpo primario per un'ora e 30 minuti in una camera umidificata. Asciugare la griglia e lavare le sezioni della griglia con diluente anticorpale due volte per cinque minuti ciascuna. Incubare le sezioni della griglia con anticorpi secondari biotinilati per un'ora in una camera umidificata.

Una volta asciugata la griglia, lavare le sezioni della griglia con diluente anticorpale due volte per cinque minuti ciascuna. Incubare le sezioni della griglia in streptavidina coniugata QD per un'ora in una camera a temperatura ambiente. Prevenire l'esposizione alla luce coprendo la camera con un foglio di alluminio.

Dopo aver asciugato i bordi della griglia con carta da filtro, lavare le sezioni della griglia posizionandole su gocce d'acqua per due minuti e asciugare i bordi della griglia. Inserire il supporto del campione nella colonna del microscopio e attivare l'interruttore della pompa per valutare il goniometro, seguito dall'inserimento completo del supporto del campione nella colonna del microscopio. Concentrati bene sull'area desiderata.

Cattura l'immagine utilizzando una fotocamera digitale ad alta velocità e salva il file in formato tif. Le membrane mitocondriali, i lisosomi e l'interfaccia mitocondriale della membrana del reticolo endoplasmatico o del reticolo sarcoplasmatico hanno mostrato la presenza di punti quantici marcati con Sigmar1. Le sezioni cardiache sono state visualizzate utilizzando l'immunoglobulina G del coniglio e punti quantici come controllo isotipo per l'anticorpo primario del coniglio anti-Sigmar1.

Una cosa importante da considerare mentre si lavora su questo protocollo è smascherare il tempo per l'antigene. Se le sezioni di tessuto vengono incise troppo a lungo, la soluzione metaperiodata creerà perforazioni in sezioni di tessuto sottile. L'etichettatura mediata da punti quantici sta guadagnando attenzione nel rilevamento del tumore, nella profilazione dello stato molecolare e immunitario del tumore e nell'imaging dei tessuti, aprendo una nuova strada per la diagnostica medica.

I punti quantici sono anche utili nel trattamento dei tumori attraverso terapie fotodinamiche e anomalie oftalmiche fornendo farmaci agli occhi.