Name: Trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo utilizzando bracciali vascolari (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Impara il trapianto cardiaco cervicale eterotopico nel topo utilizzando bracciali vascolari per migliorare il flusso ematico laminare. Questa tecnica riduce la formazione di trombi e facilita il monitoraggio post-trapianto.

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DK è supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, dalla sovvenzione Veterans Administration Merit Review 1I01BX002730 e dalla Fondazione per il Barnes-Jewish Hospital.

Tutte le procedure di gestione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida NIH Care and Use of Laboratory Animals e approvate dal Comitato per gli studi sugli animali presso la Washington University School of Medicine. I cuori di topi C57BL/6 (B6) e BALB/c (del peso di 20-25 g) sono stati trapiantati in riceventi B6 di sesso (6-8 settimane di età). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). Sono stati eseguiti trapianti singeneici per valutare le risposte cellulari correlate al danno da ischemia-riperfusione e sono stati eseguiti trapianti allogenici per studiare i meccanismi immunitari coinvolti nella tolleranza e nel rigetto del trapianto. B6 lisozima M-green fluorescent protein (LysM-GFP) topi reporter17, originariamente ottenuti da Klaus Ley del La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, e successivamente allevati nella nostra struttura, sono stati utilizzati come destinatari per esperimenti selezionati per visualizzare l'infiltrazione di neutrofili negli innesti cardiaci. La chirurgia di sopravvivenza è stata eseguita utilizzando procedure asettiche.
1. Procedura del donatore
<ol><li>Anestetizzare i topi iniettando ketamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) per via intraperitoneale nel topo donatore. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con pizzico di punta e coda.</li>
	<li>Preparare l'area chirurgica radendo i capelli dal torace e dall'addome usando un rasoio elettrico.</li>
	<li>Somministrare 100 unità di eparina (vedere Tabella dei materiali) per via endovenosa nella vena del pene (maschi) o nella vena giugulare esterna (maschi o femmine).</li>
	<li>Metti i topi in posizione supina con gli arti anteriori sopra la testa. Fissare gli arti anteriori e posteriori con nastro chirurgico e disinfettare la pelle con tre scrub alternati di iodio allo 0,75% e etanolo al 70%.</li>
	<li>Eseguire un'incisione, laparosternotomia mediana, dall'ombelico all'angolo sternale (3-4 cm), seguita da una toracotomia bilaterale lungo ciascun margine costale (2 cm bilateralmente). Piegare la parete toracica anteriore sopra il collo per una completa esposizione del mediastino.</li>
	<li>Asportare il timo ed esporre la vena cava inferiore intratoracica.</li>
	<li>Transetto attraverso la larghezza dell'aorta addominale per il dissanguamento.</li>
	<li>Per la perfusione retrograda, iniettare 1,5 mL di soluzione salina a 4 °C nella vena cava inferiore intratoracica con l'ago orientato superiormente verso l'innesto, come descritto in precedenza13.</li>
	<li>Ligare la vena cava superiore usando un 8-0 sutura di seta e dividere distalmente.</li>
	<li>Ripetere la perfusione retrograda iniettando altri 1,5 mL di soluzione salina a 4 °C attraverso la vena cava inferiore.</li>
	<li>Ligare la vena cava inferiore usando un 8-0 sutura di seta e dividere distalmente.</li>
	<li>Sezionare l'arco aortico e il tronco dell'arteria polmonare per la raccolta dell'innesto e il transetto entrambi distale. Ligare le vene polmonari sulla superficie posteriore del cuore usando una sutura di seta 6-0 e dividere distalmente.</li>
	<li>Eseguire la preparazione dell'innesto rimuovendo il cuore del donatore dalla cavità toracica. Mettere il cuore asportato in un contenitore di plastica riempito con soluzione salina eparinizzata a 4 °C per 1-2 minuti. Trasferire l'innesto su un pallone di plastica sterile pieno di ghiaccio per il posizionamento del bracciale (Figura 1A). NOTA: L'innesto di cuore deve rimanere sul pallone per circa 5 minuti per posizionare la cuffia dell'arteria polmonare del donatore.</li>
	<li>Posizionare un angiocatetere da 20 G lungo 1 mm (vedere la tabella dei materiali) sopra l'arteria polmonare per il bracciale del donatore. Usando una pinza sottile, piegare delicatamente i bordi dell'arteria sopra il bracciale. Fissare il recipiente piegato al bracciale usando una fascetta di nylon 10-0, come descritto in precedenza18 (Figura 1B,C).</li>
	<li>Conservare il cuore del donatore in soluzione salina eparinizzata o in un'altra soluzione di conservazione a 4 °C. NOTA: Mentre alcuni potrebbero preferire soluzioni di conservazione specifiche (ad esempio, la soluzione dell'Università del Wisconsin) per la conservazione ischemica prolungata, può essere costoso19. La soluzione salina può essere un'alternativa adatta per brevi periodi di ischemia (<1 h)20. In definitiva, la scelta della soluzione di conservazione dipende dal disegno sperimentale21.</li>
</ol>2. Procedura del destinatario
<ol><li>Iniettare ketamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg) per via intraperitoneale nel topo ricevente per l'anestesia. Iniettare buprenorfina a rilascio prolungato (0,5-1,0 mg/kg) per via sottocutanea per l'analgesia. Confermare il piano chirurgico dell'anestesia con pizzico di punta e coda.</li>
	<li>Preparare l'area chirurgica radendo i capelli dalla zona cervicale usando un rasoio elettrico. Applicare un unguento oftalmico sterile e non medicato sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.</li>
	<li>Metti l'animale in posizione supina con gli arti anteriori adiacenti al corpo e la testa girata leggermente a sinistra. Fissare gli arti anteriori e posteriori con nastro chirurgico. Disinfettare la pelle con tre scrub alternati di 0,75% di iodio e 70% di etanolo.</li>
	<li>Fai un'incisione cervicale della linea mediana dalla mandibola inferiore allo sterno.</li>
	<li>Transetto il muscolo sternocleidomastoideo destro. Asportare il lobo destro della ghiandola sottomandibolare per creare spazio per l'impianto dell'innesto.</li>
	<li>Legare un nodo sulla vena giugulare esterna prossimale usando una sutura di seta 6-0. Ligare la vena giugulare esterna distale e i rami adiacenti usando un 8-0 sutura di seta. Fai un'incisione trasversale attraverso la parete anteriore della vena giugulare esterna.</li>
	<li>Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso il bordo della vena giugulare esterna prossimale e il tessuto sottostante per fissare la vena durante l'inserimento del bracciale (Figura 1D).</li>
	<li>Ligare l'arteria carotide comune destra distale usando un 8-0 sutura di seta appena inferiore alla biforcazione carotidea. Legare un nodo sull'arteria carotide comune prossimale usando una sutura di seta 6-0. Transetto l'arteria distalmente tra le suture.</li>
	<li>Simile alla cuffia del donatore, posizionare un bracciale angiocateter lungo 0,6 mm e 24 G sull'arteria carotide comune destra del ricevente. Usando una pinza sottile, piegare delicatamente i bordi dell'arteria sopra il bracciale. Fissare la nave piegata al bracciale usando una cravatta di nylon 10-0.</li>
	<li>Posizionare il cuore del donatore superiore alla zona cervicale destra.</li>
	<li>Gocciolare soluzione salina fredda sull'innesto di cuore ogni pochi minuti durante l'impianto.</li>
	<li>Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso il bordo dell'aorta donatrice e attraverso un morso superficiale del tessuto sottostante per fissare l'innesto in posizione (Figura 1E).</li>
	<li>Lavare l'aorta del donatore con 0,5 ml di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.</li>
	<li>Inserire la cuffia dell'arteria carotide comune del ricevente nell'aorta del donatore. Assicurati l'anastomosi con un 8-0 cravatta di seta (Figura 1F). Rimuovere la sutura dell'ancora aortica.</li>
	<li>De-aria la vena giugulare esterna lavando la vena giugulare esterna del ricevente con 0,5 ml di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.</li>
	<li>Eseguire l'anastomosi dell'arteria polmonare inserendo la cuffia dell'arteria polmonare del donatore nella vena giugulare esterna del ricevente e fissare con un 8-0 cravatta di seta (Figura 1G). Rimuovere la sutura di ancoraggio della vena giugulare esterna e transettare la parete posteriore rimanente della vena giugulare esterna per liberare l'innesto dal tessuto sottostante. Assicurarsi che l'innesto sia orientato correttamente senza attorcigliamento o torsione delle anastomosi.</li>
	<li>Rilasciare i nodi sulla vena giugulare esterna del ricevente seguita dall'arteria carotide comune per avviare la riperfusione dell'innesto cardiaco (Figura 1H).</li>
	<li>Chiudere l'incisione della pelle cervicale utilizzando una sutura di nylon 6-0 interrotta.</li>
</ol>3. Cure postoperatorie
<ol><li>Posizionare il ricevente in una camera di recupero calda immediatamente dopo l'intervento chirurgico e monitorare attentamente fino a completo recupero dall'anestesia (circa 1 ora).</li>
	<li>Continuare a monitorare attentamente l'animale (ogni 6-8 ore) per almeno 72 ore dopo l'intervento chirurgico per segni di comportamento anormale, come letargia, tremori, respirazione rapida o anoressia.</li>
	<li>Per il controllo del dolore, iniettare carprofen (5 mg/kg) per via sottocutanea ogni 8-12 h per l'analgesia, oltre alla buprenorfina sottocutanea (0,05 mg/kg) ogni 8-12 ore per 24-48 h a partire dalla fine dell'intervento.</li>
</ol>4. Imaging intravitale a due fotoni del traffico leucocitario nell'innesto cardiaco
<ol><li>Iniettare ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg) per via intraperitoneale in un topo ricevente B6 LysM-GFP17 2 ore dopo la riperfusione dell'innesto per anestesia.</li>
	<li>Eseguire l'intubazione orotracheale utilizzando un angiocatetere da 20 G, come descritto in precedenza18.</li>
	<li>Collegare l'angiocatetere al tubo da un ventilatore meccanico per mouse e ventilare con aria ambiente ad una velocità di 120 respiri / min e un volume corrente di 0,5 mL18.</li>
	<li>Iniettare 12 μL di punti quantici non mirati a 655 nm (vedere Tabella dei materiali), sospesi in 50 μL di PBS per via endovenosa, come descritto in precedenza13.</li>
	<li>Riaprire l'incisione del collo per esporre l'innesto di cuore. Posizionare il mouse in una camera di stabilizzazione.</li>
	<li>Fissare una porzione della parete libera del ventricolo sinistro utilizzando un sottile anello di adesivo tissutale (vedi Tabella dei materiali), applicato su un vetrino di vetro attaccato alla piastra della camera superiore.</li>
	<li>Posizionare la camera sotto l'obiettivo del microscopio a due fotoni per acquisire immagini e video, come descritto in precedenza13.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+heart+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for heart transplantation in the rat.</a> The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).</li>
<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice.</a> Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).</li>
<li>Heron, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+accessory+cervical+heart+transplantation+in+rabbits+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pathologica+Microbiologica+Scandinavica+Section+A+Pathology%22%5BJournal%5D)">A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats.</a> Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).</li>
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<li>Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+mouse+cervical+heart+transplantation+using+a+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique.</a> Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cuff+anastomosis+of+both+renal+artery+and+vein+to+minimize+thrombosis%3A+a+novel+method+of+kidney+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice.</a> Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).</li>
<li>Tomita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heterotopic+cervical+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice.</a> Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).</li>
<li>Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+technique+for+heterotopic+vascularized+cervical+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice.</a> Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cervical+heart+transplantation+model+using+a+modified+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e50753(2014).</li>
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<li>Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+cuff+technique+for+mouse+cervical+heterotopic+heart+transplantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model.</a> Journal of Visualized Experiments. (180), e63504(2022).</li>
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<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+monocytic+cells+in+regressing+atherosclerotic+plaques+by+intravital+2-photon+and+positron+emission+tomography-based+imaging-brief+report%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+transplant+acceptance+is+facilitated+by+early+events+in+the+graft+and+is+associated+with+lymphoid+neogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis.</a> Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+green+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 719-726 (2000).</li>
<li>Krupnick, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+lung+transplantation+as+experimental+methodology+to+study+transplant+and+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology.</a> Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).</li>
<li>Westhofen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterotopic+heart+transplantation+in+mice+as+a+small+animal+model+to+study+mechanical+unloading+-+Establishment+of+the+procedure%2C+perioperative+management+and+postoperative+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring.</a> PLoS One. 14 (4), 0214513(2019).</li>
<li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+cuff+technique+for+murine+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e61103(2020).</li>
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<li>Martins, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+graft+function+in+rodent+models+of+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation.</a> Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Utilizzando questa tecnica, il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo può essere eseguito in meno di 40 minuti da un microchirurgo esperto e in circa 60 minuti da un microchirurgo entry-level. Mentre il trapianto di cuore cervicale è stato studiato in numerosi modelli animali, un modello murino rimane il gold standard a causa di molteplici ceppi genetici ben definiti, capacità di alterazione genetica e disponibilità di numerosi reagenti, inclusi gli anticorpi monoclonali24. La tecnica qu...

Abbott et al. hanno pubblicato1 la prima descrizione del trapianto di cuore addominale eterotopico nei ratti nel 1964. Queste tecniche chirurgiche sono state perfezionate e semplificate da Ono et al. nel 19692. Corry et al. hanno descritto per la prima volta un metodo per il trapianto di cuore addominale eterotopico nei topi nel 1973; Analogamente ai modelli di ratto precedentemente riportati, ciò ha comportato l'attecchimento nell'addome dell'ospite con rivascolarizzazione mediante anastomosi end-to-side dell'arteria polmonare del donatore e dell'aorta ascendente alla vena cava inferiore e all'aorta addominale del ricevente, rispettivamente3. Il trapianto eterotopico di cuore cervicale nei ratti è stato descritto da Heron nel 1971 utilizzando polsini in teflon costituiti da cateteri endovenosi da 16 G (diametro esterno 1,6 mm)4. Chen5 e Matsuura et al.6 hanno successivamente riportato il trapianto di cuore cervicale eterotopico nei topi nel 1991, le cui tecniche differivano principalmente nel loro metodo di ri-anastomosi. L'approccio di Chen prevedeva anastomosi suturate dell'aorta ascendente del donatore all'arteria carotide del ricevente e dell'arteria polmonare del donatore alla vena giugulare esterna del ricevente5. A causa delle avanzate competenze tecniche richieste per queste anastomosi suturate microchirurgiche, è stata necessaria una notevole quantità di tempo ed esperienza per ottenere un alto tasso di successo. Matsuura et al. hanno descritto un metodo che utilizza una tecnica di bracciale senza sutura, simile a quella usata da Heron, che prevedeva anastomosi end-to-end usando il posizionamento extra-luminale dei polsini. Ha modellato polsini in teflon da 22 G (diametro esterno 0,8 mm) e 24 G (diametro esterno 0,67 mm) cateteri endovenosi e li ha posizionati sulla vena giugulare esterna del ricevente e sull'arteria carotide comune, rispettivamente6. Questi polsini sono stati quindi posizionati all'interno dell'arteria polmonare e dell'aorta del donatore e fissati legando una legatura di sutura attorno alla connessione. Questo approccio si è tradotto in un migliore tasso di successo. Ancora più importante, ha comportato una riduzione del tempo necessario per completare entrambe le anastomosi cervicali, riducendo così il tempo ischemico caldo dell'innesto a meno di un terzo di quello che utilizza il metodo di sutura addominale. Inoltre, poiché i polsini sono posizionati attorno alla superficie esterna della nave, non vi è alcun corpo estraneo esposto al lume del vaso, il che riduce in gran parte la possibilità di trombosi dopo l'intervento chirurgico7. Nel frattempo, l'utilizzo della tecnica del bracciale fornisce supporto intorno ai vasi nel sito dell'anastomosi senza richiedere alcuna sutura, il che riduce il rischio di sanguinamento dopo la rivascolarizzazione6.
Sono state proposte numerose revisioni di questa tecnica. Per adattarsi alla breve lunghezza dell'arteria carotide comune del topo (circa 5 mm), Tomita et al.8 hanno sviluppato una modifica di questa tecnica con un bracciale arterioso più piccolo (diametro esterno di 0,6 mm) omettendo invece di tenere le suture e tirare l'arteria direttamente attraverso il bracciale con una pinza fine. Wang et al. hanno ulteriormente semplificato questo approccio posizionando bracciali da 22 G e 24 G sull'arteria polmonare destra del donatore e sull'arteria carotide comune destra del ricevente, rispettivamente9. Vari rapporti hanno descritto modifiche a questi approcci, tra cui l'uso di bracciali specializzati, morsetti microchirurgici, dilatatori dei vasi e cardioplegia10,11,12. In particolare, tutti questi metodi comportano la circolazione retrograda del sangue attraverso il cuore, con il sangue che scorre dall'arteria carotide comune ricevente all'aorta del donatore, alle arterie coronarie, al seno coronarico, quindi si svuota nell'atrio destro ed esce dall'arteria polmonare nella vena giugulare esterna ricevente.
Rispetto all'attecchimento nell'addome, il trapianto cardiaco cervicale offre molteplici vantaggi. Come accennato in precedenza, l'esposizione cervicale consente una rivascolarizzazione più rapida e tempi ischemici caldi più brevi6. Il metodo cervicale è anche meno invasivo ed è associato a tempi di recupero postoperatorio più brevi in quanto evita una laparotomia6. È importante sottolineare che le anastomosi end-to-end con bracciali possono essere eseguite invece di anastomosi end-to-side, il che riduce il rischio di complicanze come il sanguinamento anastomotico. L'approccio addominale comporta anche un aumentato rischio di sviluppare complicanze trombotiche nell'aorta addominale o nella vena cava inferiore, portando a ischemia del midollo spinale e paralisi degli arti posteriori. La posizione cervicale superficiale del trapianto consente un facile accesso alla valutazione della vitalità dell'innesto mediante palpazione, elettrocardiografia e imaging invasivo o non invasivo. Sebbene gli innesti cervicali riprendano l'attività cardiaca spontanea dopo la riperfusione, non impattano significativamente sui parametri sistolici e diastolici del ricevente. Questo modello fornisce informazioni preziose per studiare le risposte cellulari dopo il trapianto, come il danno da ischemia-riperfusione e il rigetto del trapianto. Inoltre, questo modello offre un approccio ideale per consentire l'imaging post-trapianto, come la microscopia intravitale a due fotoni o la tomografia a emissione di positroni (PET). A tal fine, il nostro laboratorio ha precedentemente riportato metodi per visualizzare tessuti e organi in movimento nel topo, tra cui il battito di cuori murini e innesti di arco aortico dopo trapianto cervicale eterotopico per visualizzare il traffico leucocitario durante la lesione da ischemia-riperfusione e all'interno delle placche aterosclerotiche, rispettivamente13,14,15 . Inoltre, grazie alla sua posizione superficiale e alla facilità di esposizione, questo modello è adatto per il retrapianto cardiaco16.
Questo rapporto descrive una tecnica che consente il flusso sanguigno laminare con il posizionamento esterno dei polsini vascolari sui vasi da cui proviene il flusso sanguigno. Ciò consente una transizione graduale del flusso sanguigno da un vaso all'altro, evitando l'esposizione del bordo distale del vaso nel lume vascolare. Inoltre, la tecnica utilizza un bracciale più grande da 20 G, invece dei polsini da 22 G precedentemente utilizzati, per l'arteria polmonare del donatore per garantire un ampio ritorno del flusso sanguigno al ricevente.

<table><tbody><tr><td>6-0 cravatte di seta intrecciate</td><td>Henry Schein Inc</td><td>7718729</td><td></td></tr><tr><td>0,75% Providone iosina scrub</td><td>Priority Care Inc</td><td>NDC 57319-327-0</td><td></td></tr><tr><td>10-0 sutura in nylon</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>AK-0106</td><td></td></tr><tr><td>655-nm non mirato Q-dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Pharmco Products Inc</td><td>111000140</td><td></td></tr><tr><td>Cravatte di seta intrecciate 8-0</td><td>Henry Schein Inc</td><td>1005597</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Adson</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91127-12</td><td></td></tr><tr><td>Topi BALB/c e C57BL/6 (6-8 settimane)</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coagulatore bipolare</td><td>Valleylab Inc</td><td>SurgII-20, E6008/E6008B</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene (Rimadyl) iniezione</td><td>Transpharm</td><td>35844</td><td></td></tr><tr><td>Carprofene (Rimadyl) compresse masticabili orali</td><td>Transpharm</td><td>38995/37919</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio 2P su misura con software di acquisizione ImageWarp</td><td>A& B Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont n. 5 pinze</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici a molla in stile vannas fine</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>Sun Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Halsey</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto Halsted-Mosquito punta curva</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91309-12</td><td></td></tr><tr><td>Ventilatore per topi Harvard Apparatus modello 687</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di eparina (100 U/mL)</td><td>Abraxis Pharmaceutical Products</td><td>504031</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (50 mg/kg)</td><td>Wyeth</td><td>206205-01</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio&mdash; Leica Wild M651 & tempi; 6&ndash; 40 ingrandimento</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moria forbici a molla extra fini</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Ohio vaporizzatore isoflurano</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000i</td><td></td></tr><tr><td>Qdots</td><td>ThermoFisher</td><td>1604036</td><td></td></tr><tr><td>S & T SuperGrip Pinze punta angolata</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>S & T SuperGrip Forcipe punta dritta</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale sterile (0,9% (wt/vol) cloruro di sodio</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Cotton fioc sterili (applicatori conici da 3 pollici con punta in mini cotone)</td><td>Puritan Medical Company LLC</td><td>823-WC</td><td></td></tr><tr><td>Surflow 20 gauge 1/4 di pollice Angiocatheter</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>SR-OX2032CA</td><td></td></tr><tr><td>Angiocatheter in teflon da 24 gauge 3/4 pollici</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>R-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>ThermoCare Sistema di terapia intensiva per piccoli animali (impostazioni di recupero 3 L/min O2, 80 &deg; C, 40% di umidità)</td><td>Thermocare Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VetBond</td><td>Santa Cruz Biotechnology SC361931</td><td>NC0846393</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina (10 mg/kg)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo utilizzando bracciali vascolari

Mouse Heterotopic Cervical Cardiac Transplantation Utilizing Vascular Cuffs

I modelli murini di trapianto cardiaco sono frequentemente utilizzati per studiare il danno da ischemia-riperfusione, le risposte immunitarie innate e adattative dopo il trapianto e l'impatto delle terapie immunomodulatorie sul rigetto del trapianto. Il trapianto di cuore cervicale eterotopico nei topi è stato descritto per la prima volta nel 1991 utilizzando anastomosi suturate e successivamente modificato per includere tecniche di bracciale. Questa modifica ha permesso di migliorare le percentuali di successo e, da allora, ci sono stati più rapporti che hanno proposto ulteriori miglioramenti tecnici. Tuttavia, la traduzione in un utilizzo più diffuso rimane limitata a causa della difficoltà tecnica associata alle anastomosi dell'innesto, che richiede precisione per ottenere una lunghezza e un calibro adeguati dei polsini per evitare torsioni anastomotiche vascolari o tensione eccessiva, che possono causare danni all'innesto. Il presente protocollo descrive una tecnica modificata per l'esecuzione di trapianto cardiaco cervicale eterotopico nei topi che prevede il posizionamento del bracciale sull'arteria carotide comune del ricevente e sull'arteria polmonare del donatore in allineamento con la direzione del flusso sanguigno.

Questo modello di trapianto cardiaco eterotopico cervicale di topo è stato utilizzato per eseguire oltre 1.000 trapianti nel nostro laboratorio, con un tasso di sopravvivenza di circa il 97%. Il tasso di successo è leggermente superiore rispetto ai precedenti rapporti che utilizzano altre tecniche di trapianto di cuore eterotopico cervicale nei topi10,11,20. Ciò potrebbe potenzialmente essere attribuito al bracciale più grande d...

I modelli di trapianto cardiaco murino rappresentano preziosi strumenti di ricerca per lo studio dell'immunologia dei trapianti. Il presente protocollo descrive il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo che prevede il posizionamento di polsini sull'arteria carotide comune del ricevente e sul tronco dell'arteria polmonare del donatore per consentire il flusso sanguigno laminare.

Trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo utilizzando bracciali vascolari

Murine models of cardiac transplantation are frequently utilized to study ischemia-reperfusion injury, innate and adaptive immune responses after ...

Il nostro posizionamento della cuffia vascolare consente il flusso sanguigno laminare e utilizziamo un bracciale più grande per l'arteria polmonare del donatore per garantire un ampio ritorno del sangue ai riceventi. Queste modifiche utilizzate in questo protocollo riducono la probabilità di flusso sanguigno turbolento e formazione di trombi e si traducono in un miglioramento dei tassi di sopravvivenza. Questo metodo fornisce informazioni preziose per studiare le risposte immunitarie dopo il trapianto come il danno da ischemia da riperfusione e il rigetto del trapianto.Inoltre, la nostra tecnica consente un più facile monitoraggio post-trapianto o il re-trapianto. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.Wen Jun Li, un microchirurgo esperto nel nostro laboratorio che ha sviluppato questa tecnica. Preparare l'area chirurgica radendo i capelli dal torace e dall'addome usando un rasoio elettrico.Somministrare 100 unità di eparina per via endovenosa nella vena del pene per i maschi o la vena giugulare esterna per maschi e femmine. Metti i topi in posizione supina con gli arti anteriori sopra la testa. Fissare gli arti anteriori e posteriori con nastro chirurgico e disinfettare la pelle con 0,75% di iodio e 70% di etanolo.Eseguire un'incisione per la laparosternotomia mediana dall'ombelico all'angolo sternale, seguita da una toracotomia bilaterale lungo ciascun margine costale. Piegare la parete toracica anteriore sopra il collo per una completa esposizione del mediastino. Asportare il timo ed esporre la vena cava inferiore intratoracica.Per la perfusione retrograda, iniettare 1,5 millilitri di soluzione salina di quattro gradi Celsius nella vena cava inferiore intratoracica con l'ago orientato superiormente verso l'innesto. Ligare la vena cava superiore usando un 8-0 sutura di seta e dividere distalmente. Ripetere la perfusione retrograda iniettando altri 1,5 millilitri di soluzione salina di quattro gradi Celsius attraverso la vena cava inferiore.Ligare la vena cava inferiore usando un 8-0 sutura di seta e dividere distalmente. Sezionare l'arco aortico e il tronco dell'arteria polmonare per la raccolta dell'innesto e il transetto entrambi distale. Ligare le vene polmonari sulla superficie posteriore del cuore usando una sutura di seta 6-0 e dividere distalmente.Eseguire la preparazione dell'innesto rimuovendo il cuore del donatore dalla cavità toracica. Metti il cuore asportato in un contenitore di plastica riempito con soluzione salina eparinizzata a quattro gradi Celsius per uno o due minuti. Trasferire l'innesto su un pallone di plastica sterile pieno di ghiaccio per il posizionamento del bracciale.Posizionare un bracciale angiocatetere lungo un millimetro calibro 20 sopra l'arteria polmonare per il bracciale del donatore. Usando una pinza sottile, piegare delicatamente i bordi dell'arteria sopra il bracciale. Fissare la nave piegata al bracciale usando una cravatta di nylon 10-0.Conservare il cuore del donatore in soluzione salina eparinizzata o in un'altra soluzione di conservazione a quattro gradi Celsius. Preparare l'area chirurgica radendo i capelli dalla zona cervicale usando un rasoio elettrico. Applicare un unguento oftalmico sterile non medicato sugli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.Metti l'animale in posizione supina con gli arti anteriori adiacenti al corpo e la testa girata leggermente a sinistra. Fissare gli arti anteriori e posteriori con nastro chirurgico. Disinfettare la pelle con 0,75% di iodio e 70% di etanolo.Dopo aver effettuato un'incisione cervicale della linea mediana dalla mandibola inferiore allo sterno, transettare il muscolo sternocleidomastoideo destro. Asportare il lobo destro della ghiandola inframandibolare per creare spazio per l'impianto dell'innesto. Legare un nodo sulla vena giugulare esterna prossimale usando una sutura di seta 6-0.Ligare la vena giugulare esterna distale e i rami adiacenti usando un 8-0 sutura di seta. Sutura sotto la vena e copertura con garza. Fai un'incisione trasversale attraverso la parete anteriore della vena giugulare esterna.Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso il bordo della vena giugulare esterna prossimale e il tessuto sottostante per fissare la vena durante l'inserimento del bracciale. Ligare l'arteria carotide comune destra distale usando un 8-0 sutura di seta appena inferiore alla biforcazione carotidea. Legare un nodo sull'arteria carotide comune prossimale usando una sutura di seta 6-0.Transetto l'arteria distalmente tra le suture. Quindi posizionare un bracciale angiocatetere lungo 0,6 millilitri e 24 calibro sopra l'arteria carotide comune destra del ricevente. Usando una pinza sottile, piegare delicatamente i bordi dell'arteria sopra il bracciale.Fissare la nave piegata al bracciale usando una cravatta di nylon 10-0. Posizionare il cuore del donatore superiore alla zona cervicale destra. Gocciolare soluzione salina fredda sull'innesto di cuore ogni pochi minuti durante l'impianto.Posizionare una sutura di nylon 10-0 attraverso il bordo dell'aorta donatrice e attraverso un morso superficiale del tessuto sottostante per fissare l'innesto in posizione. Lavare l'aorta del donatore con 0,5 millilitri di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%. Inserire la cuffia dell'arteria carotide comune del ricevente nell'aorta del donatore.Assicurati l'anastomosi con un 8-0 cravatta di seta. Rimuovere la sutura dell'ancora aortica. De-aria la vena giugulare esterna lavando la vena giugulare esterna del ricevente con 0,5 millilitri di soluzione salina eparinizzata allo 0,9%.Eseguire l'anastomosi dell'arteria polmonare inserendo la cuffia dell'arteria polmonare del donatore nella vena giugulare esterna del ricevente e fissare con un 8-0 cravatta di seta. Rimuovere la sutura di ancoraggio della vena giugulare esterna e transettare la parete posteriore rimanente della vena giugulare esterna per liberare l'innesto dal tessuto sottostante. Assicurarsi che l'innesto sia orientato correttamente senza attorcigliamento o torsione dell'anastomosi.Rilasciare i nodi sulla vena giugulare esterna del ricevente, seguita dall'arteria carotide comune per avviare la riperfusione dell'innesto cardiaco. La tecnica dimostrata in questo protocollo ha mostrato un tasso di sopravvivenza di circa il 97% Questo potrebbe potenzialmente essere attribuito al bracciale più grande di 20 gauge posizionato sull'arteria polmonare del donatore per garantire un ampio ritorno del flusso sanguigno al ricevente. Inoltre, l'allineamento del flusso sanguigno con il posizionamento della cuffia nella presente tecnica riduce al minimo il rischio di trombosi e turbolenza anastomotica.Il tempo medio di intervento del ricevente è stato di circa 37 minuti con un tempo medio di ischemia fredda di 20 minuti. Per gli studi di sopravvivenza, gli innesti cardiaci sono stati valutati quotidianamente mediante visualizzazione diretta e palpazione digitale del battito cardiaco. L'imaging intravitale a due fotoni è stato eseguito subito dopo il trapianto per valutare il traffico leucocitario.È importante controllare che l'innesto sia posizionato correttamente e orientato prima della chiusura della pelle per evitare torsioni. Questo metodo può essere utilizzato in modelli di re-trapianto per identificare le cellule immunitarie residenti negli innesti trapiantati che mediano le risposte alloimmuni.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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