Ricostituzione dell'assemblaggio di septina alle membrane per lo studio delle proprietà e delle funzioni biofisiche

La ricostituzione senza cellule è stata uno strumento chiave per comprendere l'assemblaggio del citoscheletro e il lavoro nell'ultimo decennio ha stabilito approcci per studiare la dinamica della settina in sistemi minimi. Qui sono presentati tre metodi complementari per osservare l'assemblaggio della settina in diversi contesti di membrana: doppi strati planari, supporti sferici e supporti per aste.

Questo protocollo guiderà coloro che lavorano sulle proteine leganti la membrana per determinare come la forma della membrana gioca un ruolo nell'organizzazione degli assemblaggi proteici. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua versatilità per il tipo di proteina, la composizione della membrana e la geometria della membrana. Permette anche di interrogare come un doppio strato lipidico può alterare le proprietà delle proteine associate.

Per identificare una buona membrana per l'esperimento, suggeriamo di stabilire una lista di controllo che potrebbe includere i tassi di diffusione lipidica, la mobilità della proteina di interesse e se ci sono liposomi non scoppiati o liposomi fusi attaccati alla superficie. Per iniziare la pulizia al plasma dei vetrini, spurgare il detergente al plasma per cinque minuti con ossigeno per rimuovere l'aria dalle linee e dalla camera. Disporre vetrini di copertura asciutti in una base di ceramica.

Durante lo spurgo, far scorrere un gas inerte sui vetrini di micro copertura per rimuovere polvere e particolato. Posizionare la culla sul retro della camera al plasma in modo che i vetrini di copertura siano paralleli al bordo lungo della camera. Far funzionare il pulitore al plasma per 15 minuti con ossigeno alla massima potenza.

Per la preparazione della camera, tagliare il cappuccio appena sotto la parte smerigliata di un tubo PCR da 0,2 millilitri. Dipingere il bordo del tubo PCR con adesivo attivato dai raggi UV evitando l'interno del tubo. Posizionare delicatamente la colla per tubi PCR al centro di un coprivetrino pulito al plasma, quindi posizionare la camera sotto la luce UV a lunghezza d'onda lunga per cinque-sette minuti per polimerizzare l'adesivo.

Per formare un doppio strato, aggiungere i reagenti al pozzetto. Scuotere delicatamente le camere da un lato all'altro per interrompere i SUV e quindi incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, sciacquare il bistrato sei volte con 150 microlitri di SLBB mediante pipettaggio per lavare via i lipidi in eccesso, quindi lavare il doppio strato sei volte con 150 microlitri di tampone di reazione prima di incubare con le settine.

Nell'ultima fase di lavaggio, rimuovere il tampone di reazione, lasciando 75 microlitri nel pozzetto. Aggiungere 25 microlitri di settine diluite in SSB e immagine mediante microscopia TIRF. In primo luogo, vortice la bottiglia contenente microsfere di silice per 15 secondi, quindi bagno sonicare per un minuto e vortice di nuovo per 15 secondi per rompere eventuali cluster.

Mescolare le perline con SLBB e 10 microlitri di SUV da cinque millimolari in un tubo di microcentrifuga a bassa adesione. Incubare la miscela lipidica del perlo per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker per prevenire la sedimentazione. Nel frattempo, scongelare un coprislip pegilato e incollare un tubo PCR da 0,2 millilitri tagliato su di esso.

Dopo l'incubazione, centrifugare le perle per 30 secondi presso l'RCF designato. Dopo il primo giro, rimuovere 50 microlitri di surnatante, quindi aggiungere 200 microlitri di PRB e mescolare mediante pipettaggio vigoroso. Per i turni successivi, rimuovere 200 microlitri di PRB e aggiungere altri 200 microlitri dopo il secondo e il terzo giro e aggiungere 220 microlitri di PRB dopo il quarto giro.

Se si esegue un test di competizione con più dimensioni delle sfere, preparare la reazione mescolando volumi uguali di ciascuna dimensione del tallone e diluendo 29 microlitri di questa miscela di sfere con 721 microlitri di tampone di reazione, quindi aggiungere 75 microlitri di perle diluite e 25 microlitri della proteina diluita in SSB ai pozzetti e mescolare. Se si misurano le settine allo stato stazionario, incubare la miscela a temperatura ambiente per un'ora e quindi visualizzare mediante TIRF o microscopia confocale. Le micrografie TIRF di SLB planari incubate con settine mostrate in verde hanno mostrato una distribuzione proteica omogenea.

Gli SLB realizzati con vetrini di vetro scarsamente puliti hanno mostrato buchi o lacune nel doppio strato nelle regioni di bassa settina. I liposomi non scoppiati e tubulati possono accumularsi sulla superficie se vengono utilizzati vecchi liposomi o se i lavaggi non sono rigorosi. Nelle micrografie di microsfere rivestite di lipidi visualizzate utilizzando la rodamina PE ha mostrato una deposizione liscia a doppio strato.

I supporti sferici erano uniformemente rivestiti dalla membrana e c'erano pochi grappoli di perline. Il lavaggio insufficiente dei lipidi in eccesso ha causato un rivestimento irregolare della membrana, come osservato dai grumi lipidici, e una manipolazione impropria ha causato lacune nel doppio strato. Una miscelazione insufficiente delle perle ha causato aggregazioni che non sono ideali per misurare l'assorbimento totale delle proteine.

Utilizzando i doppi strati lipidici supportati qui presentati, è possibile eseguire altri metodi come la microscopia di imaging a fluorescenza, la citometria di massa delle membrane e la microscopia a forza atomica ad alta velocità per esaminare diverse dinamiche proteina-proteina o proteina-membrana.