Name: Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Scopri metodi a basso costo per misurare la durata della vita e della salute in Caenorhabditis elegans. Questo protocollo utilizza tecniche di sincronizzazione e valutazione della locomozione per studiare l'invecchiamento.

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G.G. è supportato da T32AG052374 e R.H.S. è supportato da R00AG065200 del National Institute on Aging. Ringraziamo il CGC (finanziato dal NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) per i ceppi.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

La durata della vita, più semplicemente definita come la durata della vita, è un chiaro fenomeno binario nella maggior parte degli organismi: o un organismo è vivente o non è. Tuttavia, la longevità non è sempre correlata alla salute di un organismo. Ad esempio, i modelli di ormesi mitocondriale in cui l'esposizione allo stress mitocondriale aumenta drasticamente la durata della vita sono generalmente alcuni degli animali più longevi, ma mostrano una crescita stentata e una ridotta funzione metabolica37,54. Allo stesso modo, gli animali con risposte allo stress del reticolo endoplasmatico iperattivo mostrano anche determinati comportamenti e fenotipi che possono essere correlati con una diminuzione della salute, nonostante abbiano migliorato notevolmente l'omeostasi proteica e la durata della vita36,49. Infine, molti paradigmi di longevità negli organismi modello, tra cui l'aumento della funzione HSF-155, l'aumento della funzione XBP-156 e la segnalazione FoxOalterata 57, sono tutti correlati con un aumento del rischio di cancro, ed è indiscutibile che una durata della vita prolungata non è benefica se un organismo è in costante lotta con il cancro e altre malattie di salute. Pertanto, la longevità non può essere una misura autonoma nella biologia dell'invecchiamento.
Pertanto, il concetto di healthspan è stato un campo in crescita nella biologia dell'invecchiamento. Healthspan, vagamente definito come il periodo della vita in cui si è sani, è più difficile da accertare della longevità. Tuttavia, a differenza della longevità, il concetto di "salute" è complicato, in quanto ci sono molte letture diverse per la salute dell'organismo: a livello di organismo, ci sono funzione / forza muscolare, funzione neuronale / cognitiva, salute riproduttiva, ecc.; a livello cellulare ci sono omeostasi proteica, omeostasi lipidica, omeostasi del glucosio, metabolismo, ecc. Nel 2014, i biologi dell'invecchiamento hanno definitivamente caratterizzato le caratteristiche biologiche dell'invecchiamento con la definizione strutturata che deve essere qualcosa che si rompe naturalmente durante l'invecchiamento e può essere alterato sperimentalmente in modo tale che l'esacerbazione sperimentale dovrebbe accelerare l'invecchiamento e l'intervento sperimentale dovrebbe rallentare l'invecchiamento. Questi nove segni distintivi dell'invecchiamento includono instabilità genomica, attrito dei telomeri, alterazioni epigenetiche, perdita di omeostasi proteica (proteostasi), esaurimento delle cellule staminali, segnalazione intercellulare alterata, disfunzione mitocondriale, rilevamento dei nutrienti deregolati e senescenza cellulare58. Da allora, numerosi studi sostengono che dovrebbero essere inclusi altri fattori, tra cui le proteine extracellulari e la fisiologia sistemica come l'immunità e l'infiammazione59. In definitiva, la complessa definizione di healthspan impone che la salute dell'organismo sia misurata utilizzando più metodi diversi.
Pertanto, in questo manoscritto, vengono presentati più metodi per misurare vari aspetti della durata della salute utilizzando il modello di nematode, C. elegans. Analizziamo il comportamento locomotore utilizzando saggi di thrashing, la salute riproduttiva usando il conteggio delle uova e le dimensioni della covata e la sensibilità allo stress. In effetti, il comportamento locomotore è un metodo gold standard per misurare la durata della salute, poiché gli organismi mostrano una significativa perdita di motilità e movimento durante l'invecchiamentodi 51 anni. La perdita del comportamento locomotore può essere attribuita a molteplici segni distintivi dell'invecchiamento, poiché la funzione muscolare in C. elegans dipende dalla corretta proteostasi60, dalla disfunzione mitocondriale61 e dalla segnalazione neurono-muscolare62. Mentre questo manoscritto si concentra su una misurazione del comportamento locomotore, è importante notare che esistono molti altri metodi, tra cui la motilità degli animali su una piastra di agar solida, la risposta altocco 51 e i saggi di chemiotassi63. Tuttavia, questi metodi richiedono generalmente dispositivi di registrazione più sofisticati, l'uso di software di tracciamento dei worm o l'uso di sostanze chimiche costose, pericolose o volatili, che possono essere proibitive in alcune impostazioni di ricerca.
Inoltre, i saggi per la conta delle uova e la dimensione della covata sono presentati come un metodo per misurare la salute riproduttiva e come il metodo più semplice per misurare la divisione cellulare nei vermi adulti, poiché i vermi adulti sono post-mitotici e solo le cellule germinali e gli embrioni subiscono la divisione cellulare all'interno di un verme adulto64. Come misura della divisione cellulare, la salute riproduttiva può essere rilevante per i segni distintivi dell'invecchiamento della senescenza cellulare e dell'esaurimento delle cellule staminali. La salute riproduttiva può essere influenzata da molti fattori, tra cui l'infezione patogena65 o l'esposizione allo stress49, sebbene non vi sia alcuna correlazione diretta tra salute riproduttiva e longevità. In effetti, alcuni animali longevi mostrano una significativa diminuzione della taglia49 della covata, ed è persino possibile che esista una correlazione inversa tra longevità e taglia50 della covata. Questo non è un fenomeno specifico di C. elegans, poiché gli effetti dannosi della riproduzione sulla longevità sono stati a lungo osservati negli esseri umani66, nei cani da compagnia67 e nei topi68. Tuttavia, forniamo il conteggio delle uova e le dimensioni della covata come metodo affidabile e a basso costo per misurare la salute riproduttiva con l'avvertenza che la salute riproduttiva potrebbe non essere correlata alla longevità o alla durata della salute.
Infine, i saggi di sopravvivenza sono offerti come misura indiretta della salute dell'organismo. È importante sottolineare che le risposte allo stress cellulare, compresa la risposta allo stress termico69 e allo stress ER35, diminuiscono rapidamente durante il processo di invecchiamento e hanno rilevanza diretta per il segno distintivo dell'invecchiamento della proteostasi70,71. Al contrario, le risposte iperattivanti allo stress possono aumentare significativamente la durata della vita promuovendo la resilienza allo stress 35,37,38. Mentre questo studio si concentra sui metodi più semplici e più economici, esiste un gran numero di metodi alternativi per i saggi di resilienza allo stress per la termotolleranza41 e lo stress ossidativo66, ognuno dei quali richiede un diverso set di apparecchiature e materiali di consumo. Oltre ai semplici studi di esposizione ai fattori di stress, possono essere eseguiti altri metodi fisiologici a seconda dell'accesso alle apparecchiature. Ad esempio, un analizzatore di flusso extracellulare può monitorare la funzione mitocondriale e la respirazione cellulare73; microscopi a dissezione fluorescente consentiranno misurazioni di reporter trascrizionali per l'attivazione della risposta allo stress20; e microscopi composti o confocali ad alta risoluzione possono essere utilizzati per misurare la morfologia degli organelli con sonde fluorescenti per i mitocondri74, il reticolo endoplasmatico75,76 e il citoscheletro di actina77.
Come ultimo avvertimento per le misurazioni della longevità, mentre i metodi chimici e genetici per sterilizzare i vermi sono offerti per ridurre significativamente i costi, è importante notare che entrambi possono avere un impatto diretto sulla durata della vita. Ad esempio, l'esposizione al FUDR è stata precedentemente segnalata per avere un impatto sia sulla durata della vita che sulla termotolleranza45. E mentre il mutante glp-4 (bn2) in sé non ha effetti diretti sulla durata della vita, la crescita a 25 ° C è un lieve stress termico33,34 e quindi può influire sulla durata della vita2. Esistono altri metodi per sterilizzare C. elegans, tra cui la sterilità78 mediata dall'auxina o mutanti alternativi sensibili alla temperatura carenti di spermatozoi79. Tuttavia, tutti i metodi hanno alcuni avvertimenti e si dovrebbe fare attenzione a utilizzare il test meno dannoso per le esigenze scientifiche di ciascun laboratorio. Un'ultima limitazione degli studi sulla longevità è la potenziale variabilità che può verificarsi a causa di basse dimensioni del campione o semplicemente da un errore oggettivo da parte dello sperimentatore. Questo può essere aggirato in quanto le nuove tecnologie nascono nelle tecnologie di durata della vita automatizzata80, ma ancora una volta questi sistemi sono costosi e richiedono alcune attrezzature e competenze ingegneristiche e computazionali. In definitiva, la raccolta di metodi forniti qui è un insieme affidabile di strumenti che possono essere rapidamente adattati e appresi in quasi tutte le istituzioni e fornire una solida base per la biologia dell'invecchiamento.

Fin dai tempi della pubblicazione di "The genetics of Caenorhabditis elegans", uno degli articoli più influenti di Sydney Brenner nel 1974, questo verme microscopico è stato considerato un eccezionale sistema modello per studiare i misteri biologici1. Nel 1977, Michael R. Klass pubblicò il metodo per misurare la durata della vita di C. elegans e stabilì questo sistema modello per studiare l'invecchiamento2. L'indagine per comprendere la relazione tra stress e longevità è iniziata con l'identificazione di una singola mutazione nel gene age-1, che ha portato a un'estensione della durata della vita in C. elegans3. Inoltre, studi contemporanei hanno identificato altre mutazioni che aumentano la durata della vita, che hanno rivelato vermi mutanti longevi che mostrano una maggiore resistenza allo stress 4,5,6. Con i suoi numerosi vantaggi tra cui una breve durata della vita, una facile manutenzione, un genoma completamente sequenziato contenente omologia a circa due terzi di tutti i geni umani che causano malattie, disponibilità e facilità di utilizzo delle librerie di interferenza dell'RNA (RNAi) e somiglianza fisiologica con gli esseri umani 7,8,9, C. elegans è stato rapidamente adottato come modello eccezionale per la biologia dello stress e dell'invecchiamento.
Forse le maggiori utilità di C. elegans sono il suo costo estremamente basso di manutenzione, la facilità di sperimentazione e la varietà di strumenti genetici disponibili per gli studi. C. elegans sono tipicamente coltivati su un terreno di agar solido con una fonte di cibo E. coli. Due ceppi di E. coli comunemente usati sono OP50 standard, un ceppo B che è forse il10 più comunemente usato, e HT115, un ceppo K-12 che viene utilizzato principalmente per gli esperimenti RNAi11,12. Il ceppo HT115 K-12 porta una delezione nella RNAIII RNasi, una mutazione essenziale per i metodi RNAi, in cui vengono utilizzati plasmidi che esprimono dsRNA corrispondenti ai singoli geni C. elegans. I vettori di alimentazione dsRNA consentono un robusto abbattimento dei geni di C. elegans senza la necessità di incroci complessi o di editing del genoma, poiché i batteri che trasportano questi plasmidi possono essere alimentati direttamente ai nematodi. Migliaia di questi vettori RNAi batterici esistono nello sfondo HT115, tra cui la più popolare libreria Vidal RNAi con > 19.000 singoli costrutti RNAi13 e la libreria Ahringer RNAi con 16.757 costrutti RNAi14. Tuttavia, le diete batteriche OP50 e HT115 hanno grandi differenze nel profilo metabolico, comprese le differenze nella vitamina B1215,16. Pertanto, si raccomanda di eseguire tutti gli esperimenti su una singola fonte batterica, se possibile, per evitare interazioni gene-dieta che possono introdurre più fattori confondenti come descritto in precedenza 17,18,19. A causa della sua facilità, gli animali sono mantenuti su OP50 per tutte le condizioni sperimentali qui descritte, ma tutti gli esperimenti vengono eseguiti su HT115 come precedentemente descritto20. In breve, gli animali vengono mantenuti a OP50 e trasferiti alla post-sincronizzazione HT115 (dopo lo sbiancamento) per coerenza tra esperimenti RNAi e non RNAi. In alternativa, un ceppo OP50 competente per l'RNAi che porta una delezione simile di RNAIII RNasi trovato nel ceppo E. coli K12 HT115 può anche essere usato21.
Forse una delle principali limitazioni agli esperimenti RNAi in C. elegans è la preoccupazione dell'efficienza di abbattimento. Mentre l'efficienza di abbattimento può essere convalidata tramite qPCR o western blotting, questi richiedono attrezzature e reagenti costosi e sono limitati all'analisi di massa. Questo è ancora più preoccupante guardando a cellule specifiche, come i neuroni, che sono refrattarie (meno sensibili) all'RNAi. Mentre l'efficienza dell'RNAi in cellule specifiche può essere migliorata attraverso la sovraespressione di SID-1, la proteina transmembrana essenziale per l'assorbimento del dsRNA22, questo è ancora limitato ai modelli di espressione specifici del tipo cellulare dei promotori utilizzati per questi costrutti, e quindi i knockout e le mutazioni geniche sono i mezzi più infallibili per esaurire le funzioni geniche. Oltre al knockdown mediato da RNAi, C. elegans è anche altamente suscettibile all'editing del genoma con strategie basate su CRISPR 23,24,25 e sovraespressione di costrutti transgenici attraverso microiniezioni, con la possibilità di integrare costrutti transgenici attraverso l'irradiazione o l'integrazione basata su trasposoni 26,27,28,29 . Tuttavia, questi metodi richiedono costose apparecchiature di microiniezione e l'alto costo degli RNA guida o dell'enzima Cas9 può vietare questi metodi in istituti con finanziamenti limitati. Invece, migliaia di linee transgeniche e mutanti sono prontamente disponibili per pochi dollari sia presso il Caenorhabditis Genetics Center (CGC) che presso il National Bioresource Project (NBRP). L'NBRP offre mutanti isolati per un gran numero di geni di C. elegans, inclusi ceppi mutanti pubblicati e quindi verificati, mutanti derivati da progetti pilota e mutanti che devono ancora essere caratterizzati. Al contrario, CGC è un depositario di linee C. elegans per lo più pubblicate e stabilite dalla comunità di ricerca. Entrambi spediscono ceppi in tutto il mondo a prezzi molto ragionevoli e offrono un'ampia varietà di opzioni per coloro che hanno una capacità limitata di sintetizzare ceppi internamente.
Qui, viene offerta una raccolta di metodi curata, che probabilmente sono i metodi più economici per l'analisi della durata della vita e della durata della salute in C. elegans. Tutti i metodi qui presentati richiedono attrezzature e forniture a basso costo e utilizzano solo ceppi prontamente disponibili dal CGC. Forse la cosa più proibitiva per i test di longevità e sopravvivenza in C. elegans è il costo delle piastre di Nematode Growth Media (NGM). Poiché C. elegans sono ermafroditi e si autofecondano, i test di sopravvivenza standard richiedono che gli animali adulti siano continuamente allontanati dalla loro progenie per evitare la contaminazione dalla prole. Non solo questo processo richiede molto tempo, ma può diventare costoso a causa della necessità di circa 100 piastre per condizione per eseguire un singolo test di durata. Qui vengono fornite due alternative: l'utilizzo del mutante senza linea germinale sensibile alla temperatura, glp-4 (bn2) o la sterilizzazione chimica con 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR). glp-4 codifica per una valil amminoacil tRNA sintetasi e il glp-4(bn2) sensibile alla temperatura è carente di riproduzione a temperature restrittive a causa della diminuzione della traduzione proteica30,31. FuDR è un metodo robusto per sterilizzare chimicamente C. elegans impedendo la replicazione del DNA, inibendo così la riproduzione32. Sebbene il FUDR possa essere proibitivo per alcuni laboratori, è necessaria solo una piccola quantità per sterilizzare chimicamente i vermi e la sua stabilità in polvere può renderlo fattibile per la maggior parte dei gruppi. L'utilizzo del mutante glp-4(bn2) sensibile alla temperatura è certamente l'opzione più economica, in quanto l'unico requisito è un'incubatrice per spostare gli animali ai restrittivi 25 °C; tuttavia, va notato che la crescita a 25 °C può causare un lieve stress termico 33,34. Indipendentemente dal metodo, l'uso di animali sterili può ridurre significativamente i costi dei materiali di consumo necessari per i test relativi all'età.
Per studiare l'invecchiamento, i saggi standard della durata della vita sono convenzionali in quanto i paradigmi che alterano la longevità hanno un impatto diretto sull'invecchiamento. Tuttavia, le misurazioni della durata della salute e della tolleranza allo stress presentano ulteriori informazioni sulla salute dell'organismo. Qui, vengono offerti diversi metodi per misurare la durata della salute: 1) fecondità come misura della salute riproduttiva; 2) dimensione della covata come misura della salute dello sviluppo e della vitalità della prole deposta; e 3) comportamento locomotore come misura della funzione muscolare e della motilità, entrambi direttamente correlati con l'invecchiamento. Inoltre, vengono offerti saggi di tolleranza allo stress: sopravvivenza allo stress ER, stress mitocondriale / ossidativo e sopravvivenza allo stress termico. Infatti, gli animali con maggiore resistenza allo stress ER35,36, allo stress mitocondriale37 e allo stress termico38 mostrano una maggiore durata della vita. Lo stress ER viene applicato esponendo C. elegans alla tunicamicina, che blocca la glicosilazione legata all'N e causa l'accumulo di proteine mal ripiegate39. Lo stress mitocondriale/ossidativo è indotto dall'esposizione al paraquat, che induce la formazione di superossido in particolare nei mitocondri40. Lo stress termico viene applicato attraverso l'incubazione di animali a 34-37 °C33,41. Tutti i test qui descritti possono essere eseguiti con attrezzature e fondi minimi e offrono una varietà di strumenti per studiare l'invecchiamento in diversi gruppi.

<table><tbody><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>per RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>per RNAi</td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>solvente per farmaci</td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>per LB</td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>per piastre NGM, M9</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>per stress ossidativo/mitocondriale</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>per soluzione di candeggina</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>per piastre NGM</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>per</td></tr><tr><td>Cannocchiale da dissezione M9 S7E Leica</td><td></td><td>10450840</td><td>Microscopio da dissezione standard</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>per piastre NGM,</td></tr><tr><td>M9 Ipoclorito di sodio</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>per soluzione di candeggina</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>per M9</td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>per RNAi</td></tr><tr><td>Tunicamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td><td>per stress ER</td></tr></tbody></table>

rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

La scoperta e lo sviluppo di Caenorhabditis elegans come organismo modello è stato influente in biologia, in particolare nel campo dell'invecchiamento. Molti studi storici e contemporanei hanno identificato migliaia di paradigmi che alterano la durata della vita, tra cui mutazioni genetiche, espressione genica transgenica e ormesi, un'esposizione benefica e di basso grado allo stress. Con i suoi numerosi vantaggi, tra cui una breve durata, una manutenzione facile e a basso costo e un genoma completamente sequenziato con omologia a quasi i due terzi di tutti i geni umani, C. elegans è stato rapidamente adottato come modello eccezionale per la biologia dello stress e dell'invecchiamento. Qui, vengono esaminati diversi metodi standardizzati per misurare la durata della vita e la durata della salute che possono essere facilmente adattati a quasi tutti gli ambienti di ricerca, in particolare quelli con attrezzature e fondi limitati. L'incredibile utilità di C. elegans è caratterizzata, evidenziando la capacità di eseguire potenti analisi genetiche nella biologia dell'invecchiamento senza la necessità di ampie infrastrutture. Infine, i limiti di ciascuna analisi e gli approcci alternativi sono discussi per la considerazione.

Caenorhabditis elegans funge da eccellente sistema modello con metodi robusti e a basso costo per il rilevamento della durata della salute, della durata della vita e della resilienza allo stress.

Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Questo protocollo presenta i metodi più economici e tecnologici più bassi per servire l'invecchiamento negli elegans marini. Un organismo modello influente nella biologia dell'invecchiamento. Il più grande vantaggio di questi metodi è la facilità di implementazione, utilizzando attrezzature e materiali a basso costo.Rendendoli accessibili a qualsiasi ricercatore indipendentemente dall'esperienza o dai finanziamenti disponibili. Come vecchi studi sull'invecchiamento c'è una variabilità naturale nella salute all'interno delle popolazioni. Pertanto, è essenziale che gli esperimenti vengano eseguiti su animali sani, ben nutriti e strettamente sincronizzati.Per garantire la disabilità dello strappo Iniziare la preparazione di un litro di terreno di crescita nematode o piastra a coclea NGM. Aggiungere 2,5 grammi di pep tone, 3,0 grammi di cloruro di sodio e 20 grammi di coclea in un pallone da un litro con una barra di mescolamento e aggiungere acqua distillata a un volume finale di 970 millilitri. Sterilizzare la soluzione a coclea NGM in un pallone da un litro utilizzando un'autoclave standard o uno sterilizzatore per supporti.E lasciare che la soluzione si mescoli fino a quando non si raffredda a 60-75 gradi Celsius. Mentre la soluzione si raffredda, riscaldare un bagno di perline da 65 a 70 gradi Celsius. Una volta che la soluzione della coclea NGM si raffredda a 60-75 gradi Celsius.Aggiungere gli additivi liquidi e lasciare che la soluzione si mescoli completamente per cinque minuti. Quindi immergere il pallone in un bagno di perline a 65-70 gradi Celsius per evitare che il supporto si solidifichi mentre si versa nella piastra. Pipettare da nove a 11 millilitri della soluzione in ciascuna piastra da 60 millilitri.Al termine, riposizionare la pipetta nella soluzione riscaldata per mantenere la temperatura ed evitare che il fluido si solidifichi nella pipetta. Ripetere la procedura per tutte le piastre e lasciare che le piastre NGM a si solidifichino durante la notte. Una volta solidificati, usali per seminare piastre con batteri o conservare le piastre in contenitori sigillati per un massimo di tre mesi a quattro gradi Celsius per sincronizzare i vermi tramite sbiancamento.Raccogliere i nematodi versando una piccola quantità di soluzione di M9 su una piastra contenente i vermi senza riempire eccessivamente la capsula di Petri. Quindi ruotare delicatamente la soluzione M nine per allentare i vermi dai prati batterici. Quindi, raccogliere vermi gravidi adulti in un tubo da 15 millilitri con una pipetta sierologica.Evitare di forare la coclea con la punta della pipetta. Pellettare gli animali per centrare per 30 secondi a 1100 volte G e aspirare il surnatante. Aggiungere cinque millilitri della soluzione sbiancante appena preparata al pellet di verme e controllare i vermi al microscopio da dissezione ogni pochi minuti insieme a un vigoroso agitazione intermittente fino a quando tutti i corpi dei vermi adulti sono sciolti e solo le uova sono rimaste nel mix.Quindi, pellettare le uova facendo girare la miscela di candeggina per 30 secondi a 1100 volte G e aspirare la soluzione sbiancante. Quindi lavare le uova pellettate aggiungendo fino a 15 millilitri di soluzione M9 e capovolgendo il tubo quattro o cinque volte per disperdere le uova e la soluzione. Anche in questo caso, centrifugare il tubo per 30 secondi a 1100 volte G per pellettare le uova e aspirare la soluzione M9.Eseguire il lavaggio quattro volte per eliminare la candeggina dal mix di uova. Dopo il quarto lavaggio centrifusion aspirare la soluzione M9 da 100 microlitri a due millilitri a seconda del numero totale di vermi sbiancati. Agitare accuratamente le uova per rompere i grumi e assicurarsi che le uova siano completamente risospese nella soluzione M9.In alternativa, gli animali possono essere arrestati per una sincronizzazione temporale più stretta aggiungendo da 10 a 12 millilitri di soluzione M9 al pellet di uova in un tubo cronico da 15 millilitri. Lascia che i vermi girino in un rotatore per un massimo di 24 ore a 20 gradi Celsius. Per approssimare l'uovo o L una concentrazione pipettare quattro microlitri della miscela di uova su una piastra NGM seduta con batteri.Quindi contare e calcolare le uova presenti per microlitro di supporto. Ripetere il conteggio tre o quattro volte per migliorare l'approssimazione, in base alla piastra di approssimazione, il numero appropriato di uova o L uno animali arrestati sulla piastra della coclea NGM seminata con batteri di scelta. Per misurare il comportamento della locomotiva dei vermi tramite thrashing.Spostare un piccolo numero di vermi adulti del primo giorno da una piastra a coclea NGM su 10-20 microlitri di soluzione M9 sotto un cannocchiale da dissezione. Quindi concentrati su un verme alla volta e conta il numero di volte in cui il campione passa da una formazione concava a una convessa in 15 secondi. Utilizzare un contatore manuale e un timer e ripetere la procedura per 10-15 vermi.Invecchiare i vermi all'età desiderata e ripetere le misurazioni di thrashing a tutte le età desiderate. Come visualizzato, i vermi più vecchi si muovono a velocità significativamente più lente. Per misure di quantità e fertilità.In 10-15 vermi Caenorhabditis elegans, individuano L quattro vermi in una piastra a coclea NGM separata seminata con batteri di scelta. Consentire agli animali di crescere durante la notte a 20 gradi Celsius e assicurarsi che un nuovo lotto di piatti seminato sia pronto per il giorno successivo. Per misurare la quantità di uova deposte da Caenorhabditis elegans trasferire i vermi adulti in una lama di coclea NGM fresca seminata con quei batteri saccheggiati ogni 12-24 ore per sette-otto giorni o fino a quando le uova non sono più visibili e contare il numero di uova deposte sui piatti.Per misurare le dimensioni della covata di Caenorhabditis elegans Trasferire i vermi adulti su una piastra a coclea NGM fresca seminata con batteri ogni 12-24 ore, o da sette a otto giorni o fino a quando la progenie non è più visibile. Conservare tutti i piatti contenenti uova a 20 gradi Celsius. Due giorni dopo il trasferimento dei vermi.Conta la progenie sviluppata sul piatto. Contare tutti i vermi vivi e in via di sviluppo allo stadio L quattro o prima per garantire che la generazione F due non confonda i risultati. Rimuovere tutti i vermi dal piatto man mano che vengono contati.Mantenere le piastre per altri uno o due giorni prima di segnarle di nuovo per garantire che tutti gli animali con schiusa o sviluppo ritardati non vengano persi. L'effetto del metodo di sterilizzazione sulla durata della vita dei nematodi selvatici tipo N2 ha mostrato che i cambiamenti nella durata della vita dei vermi cresciuti sulle piastre della coclea NGM erano simili a quelli dei vermi cresciuti sulle piastre FUDR della coclea NGM o sui quattro animali mutanti BN2 GLP cresciuti sulle piastre della coclea NGM. L'animale da abbattimento HSF di breve durata ha mostrato un calo significativo della durata della vita per tutte le condizioni.Una sostanziale diminuzione del numero di uova deposte e delle dimensioni della covata è stata riscontrata negli animali HSF rispetto ai controlli di tipo selvatico. Alcuni animali HSF hanno mostrato una completa sterilità indicando che la salute riproduttiva può essere inversamente correlata alla longevità. Il tasso di thrashing ha fornito un metodo affidabile per misurare la salute durante l'invecchiamento, misurato da una significativa diminuzione del thrashing negli animali anziani rispetto a quelli giovani.La sopravvivenza allo stress sono test affidabili per misurare la salute dell'organismo, la tunicamicina che causa lo stress del reticolo ha comportato una riduzione della durata della vita indipendentemente dalla concentrazione rispetto al controllo DMSO. Gli alti livelli di paraquat hanno notevolmente ridotto la durata della vita, mentre basse concentrazioni di paraquat hanno aumentato la durata della vita a causa dell'effetto ormetico. Nei saggi di tolleranza termica, la sovraespressione di HSF ha aumentato la tolleranza termica a 37 gradi Celsius per tutti gli esperimenti di durata della vita e invecchiamento.È importante ricordare che le tecniche di sterilizzazione possono avere un effetto pleiotropico sulla salute dell'organismo, che influisce sui risultati. Esistono molti approcci aggiuntivi e complementari per misurare la durata della salute se sono disponibili attrezzature e infrastrutture, comprese le misurazioni della trascrizione, l'aggregazione delle proteine di traduzione, l'organello, la morfologia e le funzioni metaboliche.

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I microbi intestinali possono avere un impatto positivo o negativo sulla salute del loro ospite attraverso meccanismi specifici o conservati. Caenorhabditis elegans è una comoda piattaforma per lo screening di tali microbi. Il presente protocollo descrive lo screening ad alto rendimento di 48 isolati batterici per l'impatto sulla resistenza allo stress dei nematodi, utilizzati come proxy per la salute dei vermi.

Screening ad alta produttività di isolati microbici con impatto sulla salute di Caenorhabditis elegans

Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per la coltura di singoli nematodi isolati su supporti solidi in dispositivi multipozzetto microfabbricati. Questo approccio consente ai singoli animali di essere monitorati per tutta la vita per una varietà di fenotipi legati all'invecchiamento e alla salute, tra cui attività, dimensioni e forma del corpo, geometria del movimento e sopravvivenza.

Coltura a lungo termine e monitoraggio di Caenorhabditis elegans isolati su terreni solidi in dispositivi multi-pozzetto

La piattaforma di imaging "The Lifespan Machine" automatizza l'osservazione permanente di grandi popolazioni. Mostriamo i passaggi necessari per eseguire saggi sulla durata della vita, sulla resistenza allo stress, sulla patogenesi e sull'invecchiamento comportamentale. La qualità e la portata dei dati consentono ai ricercatori di studiare gli interventi sull'invecchiamento nonostante la presenza di variazioni biologiche e ambientali.

Saggi sull'invecchiamento comportamentale e sulla durata della vita ad alto rendimento utilizzando la macchina per la durata della vita

Descriviamo un morbidostat configurabile a basso costo che consente la caratterizzazione della resistenza ai farmaci antibiotici regolando dinamicamente la concentrazione del farmaco. Il dispositivo può essere integrato con una piattaforma microfluidica multiplexata. L'approccio può essere ampliato per studi di laboratorio sulla resistenza ai farmaci antibiotici.

Progettazione e l&#39;uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l'integrazione del transgene.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Qui, presentiamo un quadro per correlare la restrizione dietetica di ampio spettro di espressione genica e la durata della vita. Descriviamo i protocolli per la restrizione dietetica di ampio spettro e imaging quantitativo di espressione genica in questo paradigma. Abbiamo ulteriormente delineare analisi computazionali per rivelare alla base di funzionalità di elaborazione di informazioni dei circuiti genetici coinvolti nel rilevamento di cibo.

Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

Scopri metodi a basso costo per misurare la durata della vita e della salute in Caenorhabditis elegans. Questo protocollo utilizza tecniche di sincronizzazione e valutazione della locomozione per studiare l'invecchiamento.

Rilevamento di metodi a basso costo per misurare la durata della vita e la durata della salute in Caenorhabditis elegans

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