Name: Imaging a singola cellula dellintero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Impara a quantificare i nuclei cellulari nel cervello di topo neonatale usando microscopia a foglio luminoso e il pipeline computazionale NuMorph. Questo metodo consente analisi 3D ad alta risoluzione dell'architettura cerebrale.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH (R01MH121433, R01MH118349 e R01MH120125 a JLS e R01NS110791 a GW) e dalla Foundation of Hope. Ringraziamo Pablo Ariel del Laboratorio Servizi di Microscopia per l'assistenza nell'imaging dei campioni. Il Laboratorio di Servizi di Microscopia presso il Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio è supportato in parte dal Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 al Lineberger Comprehensive Cancer Center dell'Università della Carolina del Nord (UNC). Il nucleo di microscopia neuroscientifica è supportato dalla sovvenzione P30 NS045892. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata in parte dal North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

I metodi di pulizia dei tessuti sono tecniche utili per misurare l'organizzazione cellulare 3D del cervello. Ci sono una miriade di metodi di pulizia dei tessuti descritti in letteratura, ognuno con i suoi vantaggi e limiti 6,7,8,9. Le opzioni per gli strumenti computazionali per analizzare i tipi di cellule nelle immagini tessutali sono relativamente limitate. Altri strumenti disponibili sono ...

L'imaging dell'intero cervello con risoluzione di una singola cellula è una sfida importante nelle neuroscienze. Le immagini cerebrali a risoluzione cellulare consentono un'analisi dettagliata e la mappatura a livello di sistema dei circuiti cerebrali e di come tali circuiti siano interrotti da fattori di rischio genetici o ambientali per disturbi neuropsichiatrici, comportamento cellulare negli embrioni in via di sviluppo e circuiti neurali nel cervello adulto 1,2,3. Esistono diversi metodi istologici che consentono immagini ad alta risoluzione del cervello 3D ricostruito; tuttavia, queste tecniche richiedono attrezzature costose e specializzate, potrebbero non essere compatibili con l'immunomarcatura e la natura bidimensionale (2D) di alcuni metodi può portare a danni tissutali e taglio durante il sezionamento 4,5.
I recenti progressi hanno fornito un approccio alternativo per l'imaging di interi cervelli che non richiede il sezionamento dei tessuti; Implicano l'uso della pulizia dei tessuti per rendere trasparente il cervello. La trasparenza si ottiene nella maggior parte dei metodi di pulizia dei tessuti sia rimuovendo i lipidi, in quanto sono una delle principali fonti di diffusione della luce, sia abbinando l'indice di rifrazione (RI) dell'oggetto con il RI della soluzione di immersione del campione durante l'imaging. La luce può quindi passare attraverso il confine tra i materiali senza essere dispersa 6,7,8,9.
I metodi di pulizia dei tessuti, come iDISCO+, sono spesso combinati con l'imaging 3D rapido utilizzando la microscopia a eccitazione a singolo fotone, come LSFM 6,7,10. All'interno di tessuti trasparenti marcati con un fluoroforo, la microscopia a fluorescenza a foglio di luce immagini sezioni per eccitazione con un sottile piano di luce11. Il vantaggio principale di LSFM è che una singola sezione ottica viene illuminata alla volta, con tutta la fluorescenza delle molecole all'interno di quella sezione eccitata, il che riduce al minimo il fotosbiancamento. Inoltre, l'imaging di un'intera fetta ottica consente il rilevamento basato su telecamera di quella fetta eccitata, aumentando la velocità rispetto alla scansione puntuale12. LSFM produce in modo non distruttivo sezioni ottiche ben registrate che sono adatte per la ricostruzione 3D.
Mentre il metodo iDISCO+ consente una pulizia dei tessuti economica entro ~ 3 settimane, le fasi di disidratazione all'interno del protocollo possono portare al restringimento del tessuto e alla potenziale alterazione della morfologia del campione, influenzando così le misurazioni volumetriche 6,10. L'aggiunta di un metodo di imaging secondario, come la risonanza magnetica, da utilizzare prima della procedura di pulizia del tessuto può misurare il grado di restringimento indotto dalla pulizia del tessuto attraverso il campione. Durante le fasi di disidratazione, le differenze nelle proprietà meccaniche tra la materia grigia e bianca possono portare a deformazioni non uniformi della materia cerebrale, con conseguenti deformazioni di volume indotte dalla pulizia dei tessuti dissimili tra campioni wild-type e mutanti e possono confondere le interpretazioni delle differenze volumetriche in questi campioni10,13 . La risonanza magnetica viene eseguita prima perfondendo l'animale con un agente di contrasto (ad esempio, gadolinio), seguita dall'incubazione del tessuto estratto di interesse in una soluzione di immersione (ad esempio, fomblin) prima di imaging14. La risonanza magnetica è compatibile con la pulizia dei tessuti e l'esecuzione di LSFM sullo stesso campione.
LSFM viene spesso utilizzato per creare immagini di microscopia su larga scala per la visualizzazione qualitativa del tessuto cerebrale di interesse piuttosto che la valutazione quantitativa della struttura cerebrale (Figura 1). Senza una valutazione quantitativa, è difficile dimostrare differenze strutturali derivanti da insulti genetici o ambientali. Con il miglioramento delle tecnologie di pulizia dei tessuti e di imaging, insieme alla riduzione dei costi di archiviazione e potenza di calcolo, la quantificazione delle localizzazioni dei tipi di cellule all'interno del tessuto di interesse sta diventando più accessibile, consentendo a più ricercatori di includere questi dati nei loro studi.
Con oltre 100 milioni di cellule nel cervello del topo15 e sessioni di imaging dell'intero cervello in grado di generare terabyte di dati, vi è una crescente domanda di strumenti avanzati di analisi delle immagini che consentano una quantificazione accurata delle caratteristiche all'interno delle immagini, come le cellule. Esistono numerosi metodi di segmentazione per le immagini con eliminazione tissutale che applicano soglie per l'intensità della colorazione nucleare e filtrano oggetti con forme, dimensioni o densità predefinite10,16,17,18. Tuttavia, interpretazioni imprecise dei risultati possono derivare da variazioni di parametri quali dimensioni delle celle, contrasto dell'immagine e intensità dell'etichettatura. Questo articolo descrive il nostro protocollo stabilito per quantificare i nuclei cellulari nel cervello del topo. In primo luogo, descriviamo in dettaglio i passaggi per la raccolta dei tessuti del cervello del topo P4, seguiti da un protocollo di pulizia dei tessuti e immunoetichettatura ottimizzato dal metodo iDISCO +10 disponibile pubblicamente. In secondo luogo, descriviamo l'acquisizione delle immagini utilizzando la risonanza magnetica e la microscopia a foglio leggero, compresi i parametri utilizzati per l'acquisizione delle immagini. Infine, descriviamo e dimostriamo NuMorph19, una serie di strumenti di analisi delle immagini che il nostro gruppo ha sviluppato che consente la quantificazione specifica del tipo di cellula dopo la pulizia dei tessuti, l'immunomarcatura con marcatori nucleari e l'imaging a foglio luminoso di regioni annotate.

<table><tbody><tr><td>Scanner MRI Bruker 9.4T/30 cm Sistema</td> di risonanza magnetica animale <td>Bruker Biospec</td><td></td><td>Sistema di risonanza magnetica animale</td></tr><tr><td>Dibenzyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Fisher-Scientific</td><td>ICN19605590</td><td></td></tr><tr><td>Siero d'asino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S30-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EVO 860 4TB SSD</td><td></td><td></td><td></td>esterno</tr><tr><td>Fomblin Y</td><td>Speciality Fluids Company</td><td>YL-VAC-25-6</td><td>lubrificante perfluoropolietere</td></tr> agente di <tr><td>contrasto gadolinio (ProHance)</td><td>Bracco Diagnostics</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>agente di contrasto al gadolinio (ProHance)</td><td>Bracco Diagnostics</td><td>0270-1111-03</td><td></td></tr><tr><td>GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU</td><td>EVGA</td><td>08G-P4-6286-KR</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico di eparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td>Disciolto in H2O a 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno, 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector Pro</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td>Software di acquisizione immagini per microscopio</td></tr><tr><td>Software di segmentazione</td> <td>ITK Snap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher-Scientific</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MVPLAPO 2x/0,5 NA Obiettivo</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide, polvere, 95% (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td>Disciolto in 1x PBS al 4%</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato 10x (PBS)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td>Diluito a 1x in H2O</td></tr><tr><td>Azide di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>Disciolto in H2O al 10%</td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tergitolo tipo NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NP40S-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher-Scientific</td><td>BP337 500</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicroscope II Microscopio a foglio luminoso</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xeon Processor E5-2690 v4</td><td>Intel</td><td>E5-2690</td><td></td></tr><tr><td>Zyla sCMOS Camera</td><td>Andor</td><td></td><td>Fotocamera a semiconduttore di ossido di metallo complementare</td></tr><tr><td><forte>Anticorpo</forte></td><td></td><td></td><td><forte>Concentrazione di lavoro</forte></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11369</td><td>(1:50)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A11077</td><td>(1:200)</td></tr><tr><td>Rat anti-Ctip2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td>(1:400)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Brn2</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12137</td><td>(1:100)</td></tr><tr><td>To-Pro 3 (TP3)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>T3605</td><td>(1:400)</td></tr></tbody></table>

imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

La pulizia dei tessuti seguita dalla microscopia a foglio luminoso (LSFM) consente l'imaging a risoluzione cellulare della struttura cerebrale intatta, consentendo l'analisi quantitativa dei cambiamenti strutturali causati da perturbazioni genetiche o ambientali. L'imaging dell'intero cervello si traduce in una quantificazione più accurata delle cellule e nello studio delle differenze specifiche della regione che possono essere perse con la microscopia comunemente usata del tessuto fisicamente sezionato. L'uso della microscopia a foglio di luce per visualizzare i cervelli chiari aumenta notevolmente la velocità di acquisizione rispetto alla microscopia confocale. Sebbene queste immagini producano grandi quantità di dati strutturali cerebrali, la maggior parte degli strumenti computazionali che eseguono la quantificazione delle caratteristiche nelle immagini di tessuto eliminato si limitano a contare popolazioni cellulari sparse, piuttosto che tutti i nuclei.
Qui, dimostriamo NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), un gruppo di strumenti di analisi, per quantificare tutti i nuclei e i marcatori nucleari all'interno delle regioni annotate di un cervello di topo postnatale giorno 4 (P4) dopo la pulizia e l'imaging su un microscopio a foglio di luce. Descriviamo la risonanza magnetica (MRI) per misurare il volume del cervello prima del restringimento causato dalle fasi di disidratazione della pulizia dei tessuti, la pulizia dei tessuti utilizzando il metodo iDISCO +, inclusa l'immunomarcatura, seguita dalla microscopia a foglio luminoso utilizzando una piattaforma disponibile in commercio per visualizzare il cervello dei topi a risoluzione cellulare. Dimostriamo quindi questa pipeline di analisi delle immagini utilizzando NuMorph, che viene utilizzato per correggere le differenze di intensità, cucire le tessere dell'immagine, allineare più canali, contare i nuclei e annotare le regioni del cervello attraverso la registrazione agli atlanti disponibili pubblicamente.
Abbiamo progettato questo approccio utilizzando protocolli e software disponibili pubblicamente, consentendo a qualsiasi ricercatore con il microscopio e le risorse computazionali necessarie di eseguire queste tecniche. Questi strumenti di pulizia dei tessuti, imaging e calcolo consentono la misurazione e la quantificazione dell'organizzazione tridimensionale (3D) dei tipi di cellule nella corteccia e dovrebbero essere ampiamente applicabili a qualsiasi progetto di studio su topi wild-type/knockout.

Poiché il protocollo iDISCO+ introduce un significativo restringimento tissutale, che è facilmente visibile ad occhio nudo (Figura 2B), abbiamo aggiunto una fase di risonanza magnetica a questa pipeline prima della pulizia dei tessuti per quantificare il restringimento indotto dalla pulizia dei tessuti. Il flusso di lavoro inizia con la rimozione del tessuto non cerebrale dall'immagine MR (Figura 2C). Successivamente, viene applicata una trasformazione rigida (3...

Questo protocollo descrive i metodi per condurre la risonanza magnetica, la pulizia e l'immunomarcatura di cervelli di topo intatti utilizzando iDISCO +, seguita da una descrizione dettagliata dell'imaging utilizzando la microscopia a foglio di luce e analisi a valle utilizzando NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Con circa 100 milioni di cellule nel cervello del topo e dimensioni delle immagini con risoluzione cellulare dell'intero cervello che si avvicinano alla scala dei terabyte, sono necessari strumenti avanzati di analisi delle immagini per quantificare con precisione le cellule. La nostra pipeline computazionale può preelaborare le immagini e quantificare i nuclei all'interno della corteccia del topo, mantenendo un ragionevole compromesso tra accuratezza del rilevamento cellulare, tempo di imaging e risorse computazionali. A dimostrare la procedura saranno Felix Kyere e Ian Curtin, studenti laureati del mio laboratorio.Per iniziare, montare il campione nel supporto della dimensione del campione corretto in modo che il campione sia orientato con la dimensione z non superiore a 5,2 millimetri di profondità a causa della distanza di lavoro nominale del microscopio UltraMicroscope II. Quindi inserire il supporto nella base del campione in modo che la vite del supporto sia inclinata di 45 gradi rispetto ai supporti della culla. Quindi, posizionare la culla in una posizione tale che il campione sia orientato perpendicolarmente al percorso della luce.Successivamente, impostare il corpo dello zoom sul microscopio su un ingrandimento 4x o superiore, ottenendo 0,75 micrometri per pixel. Nel software Inspector Pro, selezionare un singolo foglio luminoso con un valore numerico di apertura di circa 0,08. Per garantire che la risoluzione assiale venga mantenuta lungo la larghezza dell'immagine, selezionare Messa a fuoco dinamica orizzontale e applicare il numero consigliato di passaggi a seconda della lunghezza d'onda del laser.Quindi regolare la messa a fuoco fine per ciascun canale rispetto al canale di registrazione e la potenza laser per canale rispetto alle proprietà del canale. Quindi, regolare la larghezza del foglio luminoso a circa il 50% per garantire che la potenza del foglio sia distribuita in modo ottimale nella dimensione y per la dimensione del campione. Successivamente, impostare il numero di riquadri rispetto alle dimensioni del campione con una sovrapposizione consigliata del 15% tra i riquadri e acquisire immagini per ciascun canale in sequenza per ogni pila in una determinata posizione del riquadro.Innanzitutto, scarica e installa il gestore dell'ambiente Conda per Linux e gli strumenti di elaborazione delle immagini NuMorph. Nella riga di comando, esegui matlab e NM_setup. m da NuMorph per scaricare e installare i pacchetti software di analisi delle immagini necessari per l'analisi.Quindi specificare i nomi dei campioni, le directory di input e output, le informazioni sul canale e i parametri di imaging del foglio luminoso modificando il file NM_samples.m. Per la regolazione dell'intensità, in NMp_template, impostare la regolazione intensa su true e use_processed_images come false quando si lavora con un nuovo set di immagini. Quindi, imposta save_images e save_samples come true.Quindi, impostare l'ombreggiatura delle piastrelle su base per applicare la correzione dell'ombreggiatura utilizzando l'algoritmo di base o manuale per applicare la correzione dell'ombreggiatura delle piastrelle utilizzando le misurazioni di UltraMicroscope II a specifiche larghezze del foglio di luce. Per l'allineamento del canale immagine, in NMp_template, impostare channel_alignment su true e alignment_method canale su traslazione o elastici. Quindi, impostare sift_refinement come true e il valore di sovrapposizione di 0,15 per far corrispondere le sovrapposizioni dei riquadri durante l'imaging.Per eseguire le fasi di pre-elaborazione in MATLAB, specificare il nome del campione e impostare la configurazione su NM_config esempio di processo. Quindi eseguire uno dei passaggi di pre-elaborazione specificando NM_process punto di configurazione specificando lo stage utilizzando intensità, allineamento o punto e controllare la directory di output per i file di output per ciascuna delle fasi. Inizia con un'immagine dell'Atlante 3D e un'immagine di annotazione associata che assegna ogni voxel a una particolare struttura.Allineare sia l'immagine dell'Atlante che il file di annotazione per assicurarsi che corrispondano correttamente con il giusto orientamento. Dopo l'allineamento, elaborare i file in NuMorph per specificare gli input come descritto nel manoscritto eseguendo il comando. In NMa_template, imposta resample_images su true e resample_resolution in modo che corrispondano all'Atlante.Quindi specificare il numero del canale da ricampionare utilizzando resample_channels. Successivamente, impostare register_images su true, specificare il atlas_file che deve corrispondere al file nella directory Atlas e impostare registration_parameters come predefinito. Quindi impostare save_registered_images su true.Per il rilevamento dei nuclei, il conteggio delle cellule e la classificazione, impostare sia count_nuclei che classify_cells come true. Quindi impostare il count_method su 3dunet e min_intensity per definire una soglia minima di intensità per gli oggetti rilevati. Successivamente, impostare classify_method su una soglia basata su un'intensità di fluorescenza non supervisionata nelle posizioni del centroide, o SVM che modella un classificatore di macchine vettoriali a supporto lineare supervisionato.Per eseguire i passi di analisi in MATLAB, specificare il nome del campione e impostare la configurazione per NM_config analizzare il campione. Quindi, eseguire uno qualsiasi dei passaggi di analisi specificando NM_analyze fase di configurazione specificando la fase utilizzando il ricampionamento, il registro, il conteggio o la classificazione e controllare la directory di output per i file di output per ciascuna fase. In NMe_template, imposta update su true e compare_structures_by su entrambi gli indici.Quindi impostare il file modello e la tabella della struttura che specifica tutti i possibili indici di struttura e strutture da valutare specificando il conteggio delle celle e la classificazione del tipo di cella. La pulizia dei tessuti utilizzando il protocollo iDISCO + e marcatori nucleici specifici dello strato neuronale ha portato a gruppi cellulari chiaramente definiti di neuroni dello strato superiore e inferiore nell'isocorteccia. Il conteggio delle celle utilizzando NuMorph dipendeva dal successo delle fasi di pre-elaborazione che coinvolgevano la regolazione dell'intensità, l'allineamento dei canali e lo stitching.Tuttavia, gli errori nelle fasi di pre-elaborazione potrebbero causare cuciture improprie, con conseguente allineamento e cucitura impropri e, quindi, ottenere immagini con motivo a fuoco e fuori fuoco. Per contare i nuclei di specifiche regioni del cervello, le immagini cucite saranno annotate utilizzando Atlas, consentendo di sovrapporre annotazioni alle regioni del cervello. I centroidi dei nuclei sono stati rilevati con un modello U-Net 3D addestrato in NuMorph con circa 12 milioni di nuclei totali che erano TO-PRO-3-positivi nell'isocorteccia con circa 2,6 milioni di nuclei cerebrali-due positivi e 1,6 milioni CTIP2-positivi.Sono stati rilevati rispettivamente circa 3,7 e 2,9 milioni di nuclei totali TO-PRO-3-positivi nei gangli della base e nell'allocorteccia ippocampale. Tuttavia, le cellule cerebrali due positive rilevate in queste due regioni cerebrali erano trascurabili e solo circa 1,5 in meno di un milione di cellule CTIP2-positive sono state rilevate ciascuna nei gangli della base e nell'allocorteccia ippocampale. Eseguire controlli di qualità visiva durante l'acquisizione per ottenere una buona segmentazione.E impostare correttamente l'ambiente Conda per garantire che non si verifichino errori in un'analisi a valle. Oltre al conteggio delle cellule, questa pipeline consente l'integrazione con altri strumenti di segmentazione che misurano le dimensioni e la forma delle cellule che possono quindi essere confrontate tra i gruppi di genotipi. Con la nostra pipeline, possiamo identificare come l'anatomia del cervello cambia alla risoluzione cellulare, portando all'identificazione di tipi di cellule e regioni cerebrali importanti per il rischio di malattia.

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Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

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