Name: La tecnica peel-blot: un metodo di preparazione dei campioni crio-EM per separare singoli strati da campioni biologici multistrato o concentrati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Impara la tecnica peel-blot per la preparazione di campioni cryo-EM, separando strati multipli in singoli strati sottili. Questo metodo aumenta la concentrazione del campione e facilita l'elaborazione delle immagini per una raccolta dati efficiente.

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1. Fasi di preparazione per la tecnica peel-blot
Nota : la preparazione richiede che i seguenti elementi siano posizionati adiacenti l'uno all'altro.
<ol><li>Impilare due pezzi di carta da filtro da 20-25 μm (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Posizionare un film di paraffina lungo ~ 8 cm x 10 cm adiacente alla carta da filtro con la carta rivolta verso l'alto.</li>
	<li>Posizionare un pezzo di carta da filtro submicron sopra altri due pezzi di carta da filtro #4 (Figura 1-1).</li>
	<li>Posizionare la pinza anti-capillare con la gamba piegata rivolta verso l'alto e la gamba dritta rivolta verso il basso. Quindi, selezionare una griglia a 600 maglie con il lato liscio / lucido verso l'alto. Posizionare la pinza su una piastra di Petri o su un'altra superficie rialzata per evitare il contatto della griglia pulita con altri oggetti.</li>
	<li>Rimuovere la carta dal film di paraffina e tirare i lati (~ 5 mm) per creare un piccolo bordo. Pipettare due gocce da 150 μL di soluzione di trealosio al 4% ~1-2 cm da un lato corto del film di paraffina e ~1 cm di distanza sul film di paraffina.</li>
	<li>Su una panca separata o sul pavimento, versare azoto liquido in un piccolo contenitore di polistirene espanso (vedi Tabella dei materiali). ATTENZIONE: Ricevere una formazione per una corretta manipolazione utilizzando guanti e una visiera per evitare il morso di gelo.</li>
	<li>Posizionare un piccolo contenitore griglia crio-EM nell'azoto liquido e coprire il contenitore in polistirene espanso con salviette prive di lanugine.</li>
</ol>2. Posizionamento del film di carbonio sulla griglia
<ol><li>Utilizzare la pinza Dumont #5 (vedi Tabella dei materiali) per far galleggiare il film di carbonio dalla mica toccando un lato della mica con una leggera angolazione verso il basso (~ 20 ° -40 °) su una delle gocce di soluzione di trealosio e lentamente lasciare che la tensione dell'acqua si sollevi dal film di carbonio spostando la mica verso il basso. Rilasciare la mica una volta che il film di carbonio galleggia sulla superficie della goccia.</li>
	<li>Ispezionare visivamente il film di carbonio per evitare l'uso di carbonio con danni sotto forma di fratture.</li>
	<li>Inserire la griglia tenuta dalla pinza anti-capillare con un angolo (~20°-30°) in una goccia di trealosio in una posizione adiacente e quindi centrata sotto il film di carbonio. Raccogliere il film di carbonio (Figura 1-2).</li>
	<li>Mantenere la griglia nello stesso orientamento e abbassarla lentamente sulla superficie della seconda goccia di trealosio senza rompere la tensione superficiale della goccia per rimuovere la pellicola di carbonio non necessaria che potrebbe essersi avvolta attorno al bordo della griglia sul lato ruvido.</li>
</ol>3. Separazione di cristalli 2D multistrato in singoli strati
<ol><li>Ruotare le pinze anti-capillari (vedi Tabella dei materiali) e posizionarle su una piastra di Petri con il lato in carbonio della griglia rivolto verso il basso (Figura 1-3).</li>
	<li>Pipettare 1,3 μL del campione nel leggero menisco del trealosio sulla parte superiore della griglia. Pipettare la soluzione ~ 8-10 volte per mescolare e distribuire il trealosio e il campione su entrambi i lati della griglia.</li>
	<li>Durante l'incubazione della soluzione per 1 minuto, pipettare una o più gocce da 1,7 μL di soluzione di trealosio sul film di paraffina.</li>
	<li>Ruotare la griglia nella sua posizione originale con il film di carbonio rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Utilizzare la pinza anti-capillare per premere la griglia sulla carta da filtro submicronica (Figura 1-4). Una volta che la soluzione è stata assorbita dalla carta da filtro e il film di carbone è piatto, attendere 3 secondi prima di sollevare la griglia e spostarla verticalmente sulla goccia da 1,7 μL della soluzione di trealosio (Figura 1-5). NOTA: ripetere questo passaggio più volte per campioni altamente impilati o la griglia viene preparata per la vetrificazione nei passaggi successivi.</li>
	<li>Asciugare la griglia sui due pezzi di carta da filtro, quindi sollevare la griglia dalla carta da filtro (Figura 1-6). Dopo circa 13 secondi, a seconda dell'umidità e del tampone del campione, immergere la griglia nell'azoto liquido nel piccolo contenitore di polistirolo e posizionare la griglia nel contenitore della griglia crio-EM o trasferirla direttamente per lo screening crio-EM o la raccolta dei dati. NOTA: Per ottimizzare rapidamente il protocollo, colorare negativamente la griglia bucciata in questa fase piuttosto che immergerla nell'azoto liquido. Colorare negativamente il campione applicando 3 μL di acetato di uranile all'1% alla griglia, incubare la griglia per 30 s e asciugarla con un pezzo strappato di carta da filtro da 20-25 μm pore. Le griglie di cristalli 2D vetrificati in trealosio, tannino o glucosio vengono regolarmente immerse a mano per la vetrificazione poiché trealosio, tannino e glucosio impediscono la formazione di ghiaccio cristallino alle velocità utilizzate per l'immersione manuale2.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.

Il peel-blot è un metodo potente per superare l'impilamento e lo spessore di cristalli 2D multistrato e campioni simili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione delle immagini. Una decisione sull'uso del peel-blot sarà basata sui parametri biologici del campione e richiederà anche una valutazione una volta che sarà disponibile un modello crio-EM 3D. L'importanza biologica dei contatti e la potenziale flessibilità delle regioni di contatto saranno particolarmente importanti in questa valutazione.
<p class="jov...

La tecnica peel-blot è stata sviluppata per separare cristalli bidimensionali impilati di proteine di membrana in singoli strati per ottenere campioni adeguatamente sottili per la raccolta di dati crio-EM 2D e 3D e facilitare l'elaborazione delle immagini1. Il protocollo è adatto allo stesso modo per altri tipi di campioni multilamellari e per ottenere elevate concentrazioni di campioni di entrambi i tipi di campioni sulla griglia senza aumentare lo spessore in Z.
La riduzione degli strati di campione a uno strato si ottiene applicando una combinazione di pressione capillare e forze di taglio in un protocollo che estende e modifica sostanzialmente il metodo di back-injection2. Una prima fase di blotting si traduce in uno stretto sandwiching e aderenza al film di carbonio e una barra della griglia su entrambi i lati del campione multistrato durante la blotting su submicron piuttosto che la dimensione dei pori della carta da filtro di 20-25 μm nel metodo di back-injection. La separazione, o peeling, di un singolo strato avviene forzando la separazione degli strati a sandwich una volta che la griglia viene premuta verticalmente su una goccia di trealosio, forzando il film di carbonio lontano dalla barra della griglia (Figura 1). Il riposizionamento del film di carbonio lontano dal punto di contatto originale con la barra della griglia avviene nella fase successiva, quando la griglia viene nuovamente cancellata su carta da filtro submicron. Il numero di iterazioni di questi passaggi può essere ottimizzato per campioni specifici. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per aumentare le concentrazioni del campione evitando l'aggregazione in Z. A causa della dipendenza dall'aderenza alla barra della griglia e al film di carbonio, nonché della separazione forzata, questo approccio potrebbe non essere adatto per molecole altamente fragili come alcune proteine delicate e / o instabili e complessi proteici.
La tecnica peel-blot non richiede attrezzature specializzate né costose forniture. L'applicabilità a campioni specifici richiederà, tuttavia, un'attenta considerazione dei parametri biologici. La decisione è più facile per i cristalli 2D poiché è necessaria una pellicola di carbonio per garantire la planarità, ma la manipolazione tramite la tecnica peel-blot può influire sull'integrità biologica del campione o sull'ordine cristallino. L'idoneità della tecnica peel-blot a singole particelle è limitata e può essere testata per quelle che richiedono pellicola di carbonio e sono stabili alla manipolazione. I campioni con interazioni biologiche critiche tra gli strati potrebbero non essere adatti per la caratterizzazione con l'aiuto della tecnica peel-blot a causa dell'interruzione di tali interazioni.
La tecnica peel-blot ("peel-blot") viene ottimizzata più rapidamente testando e vagliando con macchie negative o campioni non colorati da TEM a temperatura ambiente. Una volta identificato il numero ottimale di iterazioni peel-blot, è possibile determinare il tempo necessario per controllare lo spessore prima della vetrificazione.

<table><tbody><tr><td>Griglie da 600 maglie</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>Pinza anticapillare</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>Carbonio per rivestire la mica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM</td><td></td><td></td><td>Le griglie Cryo-EM possono essere schermate a 120 kV o 200 kV. I dati ad alta risoluzione vengono raccolti a 300 kV.</td></tr><tr><td>Dumpont #5 pinze</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Scatola a griglia per lo stoccaggio cryo-EM</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td>Mica</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>La mica è rivestita di carbonio e tagliata in quadrati leggermente più grandi di una griglia TEM. Lo spessore del carbonio può richiedere un'ottimizzazione per evitare che il carbonio sottile si rompa facilmente dopo più peel blot.</td></tr><tr><td>L'acetato</td> di uranile all'1-2% è <td></td><td></td><td>adatto per molti campioni. Altri coloranti come l'acido fosfotungstico possono essere sostituiti.</td></tr>Contenitore in polistirene <tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Utilizzato per la vetrificatura della griglia peel-blot.<td></td><td></td><td> A questo scopo, un contenitore di polistirolo può essere riciclato e rivestito con un foglio di alluminio.</td></tr><tr><td>Carta da filtro submicronica</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>Qualsiasi TEM azionato a una tensione di accelerazione di 80-120 kV sarà adatto per lo screening di griglie colorate negativamente.</td></tr><tr><td>Trealosio</td><td></td><td></td><td>Preparare una soluzione di trealosio al 4%.</td></tr><tr><td>Carta da filtro Whatman #4</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>Questo corrisponde al 20-25 &mu; m carta da filtro per pori nel protocollo.</td></tr></tbody></table>

la tecnica peel-blot: un metodo di preparazione dei campioni crio-em per separare singoli strati da campioni biologici multistrato o concentrati

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La tecnica di preparazione della griglia crio-EM peel-blot è un metodo di back-injection significativamente modificato con l'obiettivo di ottenere una riduzione degli strati di campioni multistrato. Questa rimozione degli strati prima del congelamento a tuffo può aiutare a ridurre lo spessore del campione a un livello adatto alla raccolta di dati crio-EM, migliorando la planarità del campione e facilitando l'elaborazione delle immagini. La tecnica peel-blot consente la separazione di membrane multilamellari in singoli strati, di cristalli 2D stratificati in singoli cristalli e di strutture impilate simili a fogli di proteine solubili da separare allo stesso modo in singoli strati. L'elevato spessore del campione di questi tipi di campioni pone spesso problemi insormontabili per la raccolta di dati crio-EM e l'elaborazione di immagini crio-EM, specialmente quando lo stadio del microscopio deve essere inclinato per la raccolta dei dati. Inoltre, le griglie di alte concentrazioni di uno qualsiasi di questi campioni possono essere preparate per una raccolta efficiente dei dati poiché la concentrazione del campione prima della preparazione della griglia può essere aumentata e la tecnica peel-blot regolata per ottenere una distribuzione densa di campione a strato singolo.

Un esperimento di successo peel-blot si tradurrà in singoli strati di campioni a concentrazioni spesso elevate. È prevedibile che alcune regioni nella maggior parte dei quadrati della griglia conterranno ancora più livelli, specialmente a un numero inferiore di iterazioni delle fasi peel-blot. La maggior parte dei quadrati della griglia, tuttavia, conterrà estese regioni di singoli strati come osservato per i cristalli 2D di leucotriene C4 sintasi umana (Figura 2) e liposomi (aggiunti nel passaggio <strong cla...

La tecnica peel-blot è un metodo di preparazione della griglia crio-EM che consente la separazione di campioni biologici multistrato e concentrati in singoli strati per ridurre lo spessore, aumentare la concentrazione del campione e facilitare l'elaborazione delle immagini.

La tecnica peel-blot: un metodo di preparazione dei campioni crio-EM per separare singoli strati da campioni biologici multistrato o concentrati

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

La tecnica peel-blot consente la separazione di campioni biologici crio-EM multistrato e concentrati in singoli strati per ridurre lo spessore, aumentare la concentrazione e facilitare l'elaborazione delle immagini. Le concentrazioni del campione possono essere aumentate prima della preparazione della griglia e la macchia può essere regolata per ottenere una distribuzione densa di campioni a strato singolo per una raccolta dati altamente efficiente. Per iniziare, impilare due pezzi di carta da filtro da 20-25 micrometri e posizionare una lunga pellicola di paraffina adiacente ad essa con la carta rivolta verso l'alto.Posizionare un pezzo di carta da filtro submicron sopra altri due pezzi di carta da filtro. Posizionare la pinza anti-capillare con la gamba piegata rivolta verso l'alto e la gamba dritta rivolta verso il basso e selezionare una griglia a maglie 600 con il lato liscio o lucido verso l'alto. Posizionare la pinza su una piastra di Petri o su un'altra superficie rialzata per evitare il contatto della griglia pulita con altri oggetti.Rimuovere la carta dalla pellicola di paraffina e tirare i lati per creare un piccolo bordo. Pipettare due gocce da 150 microlitri, quindi una soluzione di trealosio al 4% a circa uno o due centimetri da un lato corto della pellicola di paraffina. Le due gocce dovrebbero essere distanti circa un centimetro l'una dall'altra.Successivamente, su una panca separata o sul pavimento, versare azoto liquido in un piccolo contenitore di polistirene espanso e posizionare un piccolo contenitore di griglia crio-EM nell'azoto liquido. Coprire il contenitore in polistirene espanso con salviette prive di lanugine. Per far galleggiare il film di carbonio dalla mica, utilizzare una pinza Dumont 5 e toccare un lato della mica con una leggera angolazione verso il basso su una delle gocce di soluzione di trealosio.Spostare la mica verso il basso per lasciare che la tensione dell'acqua si sollevi lentamente dal film di carbonio. Rilasciare la mica una volta che il film di carbonio galleggia sulla superficie della goccia. Ispezionare visivamente il film di carbonio per evitare l'uso di carbonio con danni sotto forma di fratture.Inserire la griglia tenuta dalla pinza anti-capillare con un angolo di 20-30 gradi in una goccia di trealosio in una posizione adiacente, quindi centrare la griglia sotto il film di carbonio. Raccogliere il film di carbonio, mantenere la griglia nello stesso orientamento e abbassare lentamente la griglia sulla superficie della seconda goccia di trealosio senza rompere la tensione superficiale della goccia. Ciò rimuoverà il film di carbonio non necessario che potrebbe essersi avvolto attorno al bordo della griglia sul lato ruvido.Ruotare le pinze anti-capillari e posizionarle su una piastra di Petri con il lato in carbonio della griglia rivolto verso il basso. Pipettare 1,3 microlitri del campione nel leggero menisco trealosio sulla parte superiore della griglia. Quindi, pipettare la soluzione circa 8-10 volte per mescolare e distribuire il trealosio e il campione su entrambi i lati della griglia.Pipettare una o più gocce da 1,7 microlitri di soluzione di trealosio sul film di paraffina mentre si incuba la soluzione di trealosio campione sulla griglia per un minuto. Ruotare la griglia nella sua posizione originale con il film di carbonio rivolto verso l'alto e premere la griglia sulla carta da filtro submicron usando la pinza anti-capillare. Una volta che la soluzione è stata assorbita dalla carta da filtro e la pellicola di carbone è in piano, attendere tre secondi prima di sollevare la griglia e spostarla verticalmente sulla goccia da 1,7 microlitri di soluzione di trealosio.Questi passaggi possono essere ripetuti da una a tre reiterazioni o più, a seconda del campione. Asciugare la griglia sui due pezzi di carta da filtro e quindi sollevare la griglia dalla carta da filtro. Dopo circa 13 secondi, a seconda dell'umidità e del tampone del campione, immergere la griglia nell'azoto liquido nel piccolo contenitore di polistirolo e posizionarla nel contenitore della griglia crio-EM o trasferirla direttamente per lo screening crio-EM o la raccolta dei dati.Un campione di cristallo 2D di leucotriene C4 sintasi umana sottoposto al metodo peel-blot è mostrato qui. La regione a sinistra della freccia è stata in gran parte ridotta a cristalli 2D a strato singolo in una regione di contatto tra il film di carbonio e la barra della griglia che è stata sbucciata e poi spostata. La regione a destra della freccia non è stata influenzata dalla macchia di buccia.La metà inferiore dell'immagine rappresenta le regioni con grandi strati lipidici di fosforo per lo più monostrato risultanti dall'applicazione della macchia di buccia. La metà superiore non era in una zona di contatto tra la barra della griglia e il film di carbonio, e quindi conteneva liposomi completi con due doppi strati fosfolipidici. Il quadrato della griglia di una griglia a 400 maglie mostra l'impronta della barra della griglia e le regioni risultanti con peel-bok, nonché le regioni che non sono state in contatto con una barra della griglia o sottoposte a un minor numero di iterazioni peel-blot.Queste immagini hanno mostrato l'ottunzione di una griglia EM preparata dall'iniezione posteriore su una carta da filtro submicronica utilizzando un film di carbonio molto sottile. Le immagini sono singoli fotogrammi al contatto iniziale con la membrana, 1.000 millisecondi dopo il contatto e 2.000 millisecondi dopo il contatto. La freccia indica i quadrati della griglia in cui la pressione capillare ha rotto il film di carbonio.Evitare fratture nel film di carbonio e combinare carta da filtro submicron con una goccia di trealosio da 1,7 microlitri per aspirare e quindi separare gli strati sono passaggi chiave. I campioni peel-blotted vengono utilizzati per la raccolta di dati crio-EM ad alta risoluzione, seguita dall'elaborazione delle immagini per la determinazione della struttura. Il peel-blot consente la determinazione strutturata di cristalli 2D proteici a strato singolo che in precedenza erano troppo spessi per la crio-EM.Inoltre, può concentrare vari campioni in singoli strati su film di carbonio.

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