La tecnica peel-blot: un metodo di preparazione dei campioni crio-EM per separare singoli strati da campioni biologici multistrato o concentrati

La tecnica peel-blot consente la separazione di campioni biologici crio-EM multistrato e concentrati in singoli strati per ridurre lo spessore, aumentare la concentrazione e facilitare l'elaborazione delle immagini. Le concentrazioni del campione possono essere aumentate prima della preparazione della griglia e la macchia può essere regolata per ottenere una distribuzione densa di campioni a strato singolo per una raccolta dati altamente efficiente. Per iniziare, impilare due pezzi di carta da filtro da 20-25 micrometri e posizionare una lunga pellicola di paraffina adiacente ad essa con la carta rivolta verso l'alto.

Posizionare un pezzo di carta da filtro submicron sopra altri due pezzi di carta da filtro. Posizionare la pinza anti-capillare con la gamba piegata rivolta verso l'alto e la gamba dritta rivolta verso il basso e selezionare una griglia a maglie 600 con il lato liscio o lucido verso l'alto. Posizionare la pinza su una piastra di Petri o su un'altra superficie rialzata per evitare il contatto della griglia pulita con altri oggetti.

Rimuovere la carta dalla pellicola di paraffina e tirare i lati per creare un piccolo bordo. Pipettare due gocce da 150 microlitri, quindi una soluzione di trealosio al 4% a circa uno o due centimetri da un lato corto della pellicola di paraffina. Le due gocce dovrebbero essere distanti circa un centimetro l'una dall'altra.

Successivamente, su una panca separata o sul pavimento, versare azoto liquido in un piccolo contenitore di polistirene espanso e posizionare un piccolo contenitore di griglia crio-EM nell'azoto liquido. Coprire il contenitore in polistirene espanso con salviette prive di lanugine. Per far galleggiare il film di carbonio dalla mica, utilizzare una pinza Dumont 5 e toccare un lato della mica con una leggera angolazione verso il basso su una delle gocce di soluzione di trealosio.

Spostare la mica verso il basso per lasciare che la tensione dell'acqua si sollevi lentamente dal film di carbonio. Rilasciare la mica una volta che il film di carbonio galleggia sulla superficie della goccia. Ispezionare visivamente il film di carbonio per evitare l'uso di carbonio con danni sotto forma di fratture.

Inserire la griglia tenuta dalla pinza anti-capillare con un angolo di 20-30 gradi in una goccia di trealosio in una posizione adiacente, quindi centrare la griglia sotto il film di carbonio. Raccogliere il film di carbonio, mantenere la griglia nello stesso orientamento e abbassare lentamente la griglia sulla superficie della seconda goccia di trealosio senza rompere la tensione superficiale della goccia. Ciò rimuoverà il film di carbonio non necessario che potrebbe essersi avvolto attorno al bordo della griglia sul lato ruvido.

Ruotare le pinze anti-capillari e posizionarle su una piastra di Petri con il lato in carbonio della griglia rivolto verso il basso. Pipettare 1,3 microlitri del campione nel leggero menisco trealosio sulla parte superiore della griglia. Quindi, pipettare la soluzione circa 8-10 volte per mescolare e distribuire il trealosio e il campione su entrambi i lati della griglia.

Pipettare una o più gocce da 1,7 microlitri di soluzione di trealosio sul film di paraffina mentre si incuba la soluzione di trealosio campione sulla griglia per un minuto. Ruotare la griglia nella sua posizione originale con il film di carbonio rivolto verso l'alto e premere la griglia sulla carta da filtro submicron usando la pinza anti-capillare. Una volta che la soluzione è stata assorbita dalla carta da filtro e la pellicola di carbone è in piano, attendere tre secondi prima di sollevare la griglia e spostarla verticalmente sulla goccia da 1,7 microlitri di soluzione di trealosio.

Questi passaggi possono essere ripetuti da una a tre reiterazioni o più, a seconda del campione. Asciugare la griglia sui due pezzi di carta da filtro e quindi sollevare la griglia dalla carta da filtro. Dopo circa 13 secondi, a seconda dell'umidità e del tampone del campione, immergere la griglia nell'azoto liquido nel piccolo contenitore di polistirolo e posizionarla nel contenitore della griglia crio-EM o trasferirla direttamente per lo screening crio-EM o la raccolta dei dati.

Un campione di cristallo 2D di leucotriene C4 sintasi umana sottoposto al metodo peel-blot è mostrato qui. La regione a sinistra della freccia è stata in gran parte ridotta a cristalli 2D a strato singolo in una regione di contatto tra il film di carbonio e la barra della griglia che è stata sbucciata e poi spostata. La regione a destra della freccia non è stata influenzata dalla macchia di buccia.

La metà inferiore dell'immagine rappresenta le regioni con grandi strati lipidici di fosforo per lo più monostrato risultanti dall'applicazione della macchia di buccia. La metà superiore non era in una zona di contatto tra la barra della griglia e il film di carbonio, e quindi conteneva liposomi completi con due doppi strati fosfolipidici. Il quadrato della griglia di una griglia a 400 maglie mostra l'impronta della barra della griglia e le regioni risultanti con peel-bok, nonché le regioni che non sono state in contatto con una barra della griglia o sottoposte a un minor numero di iterazioni peel-blot.

Queste immagini hanno mostrato l'ottunzione di una griglia EM preparata dall'iniezione posteriore su una carta da filtro submicronica utilizzando un film di carbonio molto sottile. Le immagini sono singoli fotogrammi al contatto iniziale con la membrana, 1.000 millisecondi dopo il contatto e 2.000 millisecondi dopo il contatto. La freccia indica i quadrati della griglia in cui la pressione capillare ha rotto il film di carbonio.

Evitare fratture nel film di carbonio e combinare carta da filtro submicron con una goccia di trealosio da 1,7 microlitri per aspirare e quindi separare gli strati sono passaggi chiave. I campioni peel-blotted vengono utilizzati per la raccolta di dati crio-EM ad alta risoluzione, seguita dall'elaborazione delle immagini per la determinazione della struttura. Il peel-blot consente la determinazione strutturata di cristalli 2D proteici a strato singolo che in precedenza erano troppo spessi per la crio-EM.

Inoltre, può concentrare vari campioni in singoli strati su film di carbonio.