Name: In vivo Imaging cronico a due fotoni della microglia nellippocampo del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri l'imaging cronico in vivo della microglia nell'ippocampo del topo mediante microscopia a due fotoni. Questo metodo consente di osservare le interazioni microglia-neuroni con alta risoluzione per studiare il loro ruolo nell'apprendimento e nelle patologie cerebrali.

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Ringraziamo M. Kondo e M. Matsuzaki per averci prestato l'obiettivo XLPLN25XSVMP. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) da Grant-in-Aid for JSPS Research Fellow (18J21331 a R.K.) e Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 a S.O.), dall'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (JP19gm1310003 e JP17gm5010003 a S.O.), e dalla Japan Science and Technology Agency da Moonshot R&D (JPMJMS2024 a H.M.).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati e condotti seguendo le politiche del Comitato etico animale e del Comitato per la sicurezza degli esperimenti genetici ricombinanti dell'Università di Tokyo. Negli esperimenti sono stati utilizzati topi CX3CR1-GFP maschi e femmine, di età compresa tra 2-4 mesi. Per la sicurezza degli sperimentatori e il mantenimento delle condizioni sterili, tutte le procedure sono state eseguite con camici bianchi, maschere e guanti sterili. Tutti gli strumenti sono stati sterilizzati prima dell'uso.
1. Preparazione di strumenti e animali
<ol><li>Assemblare un tubo metallico con fondo di vetro (Figura 1A).<ol><li>Applicare una piccola goccia di adesivo ottico a polimerizzazione UV su un'estremità di un tubo inossidabile su misura (diametro esterno 3,0 mm, diametro interno 2,8 mm, altezza 1,7 mm). Stendere uniformemente la colla sul bordo circolare del tubo. NOTA: una quantità sufficiente di adesivo deve essere utilizzata per coprire l'intero bordo del tubo.</li>
		<li>Posizionare un coprivetro circolare (diametro 3,0 mm, spessore 0,15 ± 0,02 mm) all'estremità del tubo metallico ricoperta di colla e premere leggermente il vetrino contro il tubo in modo che lo spazio tra il tubo e il vetro sia riempito con la colla. Quindi, regolare la posizione del vetro per adattarla al bordo esterno del tubo metallico.</li>
		<li>Irradiare il vetro con luce UV per un tempo sufficiente a polimerizzare l'adesivo. NOTA: Assicurarsi che il vetro e il tubo siano completamente attaccati. Se l'adesione è insufficiente, il vetro può staccarsi dopo l'intervento chirurgico, con conseguente imaging non riuscito o perdita di liquido cerebrospinale (CSF).</li>
		<li>Disinfettare il tubo metallico con fondo di vetro assemblato con etanolo al 70% e lavare con soluzione salina sterile per rimuovere i detriti.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con uno sterilizzatore a calore secco.</li>
	<li>Preparare i topi per l'intervento chirurgico di impianto della finestra. NOTA: I topi devono avere l'età appropriata. È preferibile che siano geneticamente modificati per esprimere proteine fluorescenti nel CA1 e nel giro dentato (DG). Questi punti sono ulteriormente spiegati nella sezione Discussione.</li>
</ol>2. Anestesia e fissazione della testa
<ol><li>Anestetizzare un topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina-xilazina (100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina). Somministrare meloxicam (2 mg/kg) mediante iniezione sottocutanea per analgesia preoperatoria. Confermare la scomparsa della risposta a stimoli dolorosi, come il pizzicamento della coda per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia. Aggiungere una mezza dose di ketamina-xilazina ogni volta che l'anestesia svanisce durante l'intervento chirurgico, in genere 1 ora dopo la somministrazione iniziale e ogni 30 minuti successivamente. Utilizzare una piastra riscaldante sotto il corpo per fornire supporto termico e applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza in anestesia. NOTA: La scelta dell'anestesia per la chirurgia è essenziale. Questo punto è discusso in dettaglio nella sezione Discussione.</li>
	<li>Applicare la crema depilatoria per rimuovere i capelli dal cuoio capelluto. Disinfettare il cuoio capelluto più volte con movimenti circolari con scrub povidone-iodio seguito da alcool. Posizionare il mouse sulla piattaforma chirurgica preparata con un tampone impermeabile sterile e applicare teli sterili per fissare il sito chirurgico. Quindi, tagliare e rimuovere il cuoio capelluto circolarmente con un bisturi in modo che le ossa parietali e occipitali siano completamente esposte sul lato operatorio.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto connettivo sottocutaneo strofinando con un batuffolo di cotone mentre si applica soluzione salina sterile per eliminare l'emorragia. Raschiare delicatamente la superficie cranica con un coltello in miniatura a punta rotonda per rimuovere il periostio, che aiuta a rafforzare l'adesione tra il cemento e l'osso (vedi passo 2.6).</li>
	<li>Applicare il materiale di incisione dentale su tutta la superficie, attendere decine di secondi e risciacquare con soluzione salina sterile sufficiente.</li>
	<li>Utilizzando inchiostro impermeabile, segnare l'area dell'osso da rimuovere (un'area circolare con un diametro di 3,0 mm, centrata di circa 2,5 mm posteriormente e 2,5 mm lateralmente al bregma). Dopo la marcatura, asciugare accuratamente la superficie del cranio. NOTA: La posizione della craniotomia dipende dalle dimensioni dell'ippocampo e dovrebbe essere ottimizzata per le diverse età. Di seguito verranno presentati indicatori utili per la posizione della craniotomia (vedi punto 3.4.5, NOTA).</li>
	<li>Fissare la piastra rettangolare in alluminio con uno spessore di 1,0 mm e con un foro di diametro di 5,0 mm al centro al cranio utilizzando cemento in resina dentale secondo le istruzioni del produttore.<ol><li>Allineare con attenzione il foro al centro della piastra con l'area circolare contrassegnata con una penna (vedere il punto 2.5) in modo che la piastra di alluminio sia parallela alla superficie marcata del cranio (Figura 1B). Assicurarsi che il cemento sigilli saldamente tutti gli spazi tra la piastra e l'osso. Attendere circa 5 minuti affinché il cemento sia sufficientemente indurito.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare il mouse sul dispositivo di fissaggio della testa con regolatori angolari tramite la piastra allegata.</li>
</ol>3. Impianto della finestra di osservazione
NOTA: Le seguenti procedure chirurgiche devono essere eseguite al microscopio stereo.
<ol><li>Fai un solco circolare sul cranio usando un pugno dermico con un diametro di 3,0 mm. Allineare la scanalatura circolare e l'area contrassegnata con una penna nel punto 2.5. Ruotare il punch dermico con una leggera pressione in modo che la profondità della scanalatura aumenti gradualmente. Controllare frequentemente che la profondità della scanalatura sia costante su tutta la circonferenza.</li>
	<li>Quando il punch dermico raggiunge lo strato più interno del cranio, prima di toccare la dura sottostante, sollevare delicatamente l'isola ossea centrale utilizzando un ago da 30 G. NOTA: Una leggera perdita di liquido dal fondo della scanalatura indica che la scanalatura è vicina alla dura.</li>
	<li>Rimuovere la dura usando un raccoglitore di dura. NOTA: La rimozione completa della dura all'interno della finestra cranica è necessaria e richiederà un'attenta resezione della dura residua alla periferia usando una pinza fine.</li>
	<li>Aspirare delicatamente il tessuto per esporre l'alveo dell'ippocampo con aghi smussati da 23 G o 25 G collegati all'aspiratore. NOTA: questo passaggio è il più critico per una corretta creazione di immagini. I punti tecnici chiave per l'aspirazione tissutale sono descritti in dettaglio nella sezione Discussione.<ol><li>Aspirare la pia e i vasi piali.</li>
		<li>Aspirare il tessuto corticale dalla superficie. Mantenere omogenea la profondità della superficie del tessuto esposto su tutta la finestra cranica. Approfondire gradualmente l'aspirazione fino a quando le fibre della capsula esterna sono esposte.</li>
		<li>Posizionare con cautela la punta di aspirazione alla capsula esterna vicino al ventricolo laterale (LV) situato all'estremità rostrolaterale della finestra cranica. Rimuovere lo strato superficiale della capsula esterna che scorre nella direzione caudomediale a quella rostrolaterale, quindi lo strato interno che corre nella direzione mediolaterale. NOTA: La capsula esterna vicino al ventricolo sinistro può essere facilmente rimossa dalla struttura sottostante.</li>
		<li>Confermare la rimozione dell'intera capsula esterna controllando la piena esposizione della superficie dell'alveo e della commissura ippocampale dorsale (DHC). NOTA: il DHC copre la porzione caudomediale del CA1. L'alveo e il DHC possono essere distinti dalla capsula esterna per i loro orientamenti delle fibre. Vale a dire, le fibre all'interno dell'alveo e del DHC corrono nella direzione da rostromediale a caudolaterale e possono essere distinte dalle fibre nella capsula esterna. L'alveo e il DHC sono strettamente fissati al CA1 e non devono essere danneggiati. Tutti i frammenti della capsula esterna devono essere rimossi, poiché eventuali frammenti rimanenti impediranno il contatto diretto del vetrino di copertura con l'alveus.</li>
		<li>Confermare che l'emorragia si è fermata completamente e riempire il foro con soluzione salina sterile a livello della superficie del cranio. NOTA: il campo visivo qui aiuta a giudicare se il foro è nella posizione appropriata per l'età specifica del mouse. Idealmente, l'alveo e il sottostante CA1 dovrebbero occupare la maggior parte dell'area centrale. Una parte del DHC è visibile nell'area caudomediale. L'apertura del ventricolo sinistro è rilevabile sul bordo rostrolaterale (Figura 3A).</li>
	</ol></li>
	<li>Inserire il tubo metallico con fondo di vetro (vedere punto 1.1) verticalmente nel foro aspirando l'acqua in eccesso che trabocca dai lati del tubo fino a quando il fondo di vetro preme leggermente contro l'alveo e appiattisce parzialmente il CA1 sottostante. NOTA: questa pressione deve essere regolata in modo appropriato. Se è troppo forte, il CA1 sarà danneggiato. Se è troppo debole, l'aberrazione sferica dovuta alla curvatura del CA1 comprometterà la risoluzione delle immagini nelle strutture profonde.</li>
	<li>Utilizzando cemento in resina dentale, fissare la parete del tubo inserito al cranio circostante (Figura 1C). Assicurarsi che l'intera circonferenza sia ben sigillata e che non vi siano perdite di aria o liquido cerebrospinale. Attendere circa 5 minuti affinché il cemento si indurisca. NOTA: Se il cemento viene posizionato quando la sua viscosità è bassa, può fuoriuscire nel parenchima cerebrale attraverso lo spazio tra il tubo e il cranio e danneggiare il cervello. Pertanto, il cemento deve essere applicato dopo l'inizio della polimerizzazione, che aumenta la viscosità e riduce le perdite attraverso lo spazio.</li>
	<li>Lavare l'intera piastra, il cranio e l'interno del tubo con soluzione salina sterile per rimuovere i detriti.</li>
</ol>4. Microscopia a due fotoni subito dopo l'intervento chirurgico per il controllo di qualità dell'intervento chirurgico
<ol><li>Posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta della testa sotto la lente dell'obiettivo del microscopio a due fotoni e sullo stadio di scansione XY motorizzato. Utilizzare una piastra riscaldante per il supporto termico. Monitorare e regolare la profondità dell'anestesia come descritto al punto 2.1, poiché questo controllo di qualità può richiedere fino a 30 minuti. NOTA: Si consiglia l'obiettivo ad immersione in acqua con una distanza di lavoro (WD) superiore a 3 mm e un'elevata apertura numerica (NA). Un collare di correzione della lente dell'obiettivo può migliorare la risoluzione compensando la mancata corrispondenza dell'indice di rifrazione tra il vetro e i biomateriali.</li>
	<li>Riempi lo spazio tra il vetro e la lente dell'obiettivo con acqua, facendo particolare attenzione ad evitare bolle d'aria. Se necessario, espandere l'area della piastra metallica utilizzando un film plastico, che trattiene più acqua, per coprire l'intera lente frontale dell'obiettivo.</li>
	<li>Accendere un laser pulsato a femtosecondi di lunghezza d'onda di 920 nm per l'eccitazione delle sonde fluorescenti espresse nel cervello e avviare il software di acquisizione immagini.</li>
	<li>Regolare la messa a fuoco sul CA1 con l'uso del palco motorizzato e del sistema di messa a fuoco motorizzato. Posizionare la struttura target con la guida della fluorescenza emessa dal parenchima cerebrale e la luce riflessa dal bordo del tubo metallico sotto l'illuminazione continua del laser pulsato.</li>
	<li>Misurare le profondità del parenchima cerebrale toccando il fondo di vetro regolando la messa a fuoco con il sistema di messa a fuoco motorizzato. Confronta le profondità in diverse posizioni orizzontali per giudicare l'allineamento del fondo di vetro e del piano di imaging.<ol><li>Regolare l'angolazione della testa del mouse inclinando il dispositivo di tenuta della testa fino a quando il fondo del vetro non è impostato per essere parallelo al piano di imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Regolare il collare di correzione dell'obiettivo per ottenere la massima risoluzione alla profondità della struttura target nel CA1.</li>
	<li>Verificare che le cellule fluorescenti nello strato molecolare (ML) della lama superiore DG a una profondità di 500 μm dal fondo di vetro possano essere visualizzate nell'intero campo visivo. NOTA: Questo passaggio è importante per giudicare la qualità della chirurgia. Se il CA1 è danneggiato, l'edema cerebrale focale impedisce il rilevamento della fluorescenza a una profondità di oltre 200 μm dalla superficie. Solo quando non vi è alcun danno al CA1 e la curvatura degli strati CA1 è opportunamente appiattita dal coprislip sovrastante, i segnali DG possono essere rilevati immediatamente dopo l'intervento chirurgico (Figura 2A-D). La sezione Risultati rappresentativi fornisce un modo semplice per determinare il confine tra CA1 e DG.</li>
</ol>5. Cure postoperatorie
<ol><li>Aspirare l'acqua all'interno del tubo e coprirla con un sigillo di plastica per evitare l'ingresso di detriti.</li>
	<li>Tenere il mouse al caldo e attendere il recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Somministrare meloxicam (2 mg/kg) per via sottocutanea ogni 24 ore finché il topo mostra un comportamento correlato al dolore.</li>
	<li>Sollevare il topo postoperatorio in un alloggiamento individuale per diverse settimane.</li>
</ol>6. Imaging cronico a due fotoni in vivo di microglia utilizzando topi CX3CR1-GFP
<ol><li>Dopo l'induzione dell'anestesia, lavare l'interno del tubo metallico con soluzione salina sterile per rimuovere i detriti. Assicurarsi che l'alveo bianco dell'ippocampo sia visibile attraverso il vetro (Figura 3A) e non ci siano complicazioni come il sanguinamento postoperatorio.</li>
	<li>Posizionare il mouse sotto il microscopio a due fotoni seguendo i passaggi da 4.1 a 4.6.</li>
	<li>Controllare la qualità e l'intensità delle immagini ottenute dall'eccitazione a due fotoni dell'ippocampo (Figura 3B). Assicurarsi che le immagini prese dopo la riduzione dell'edema postoperatorio siano paragonabili o migliori di quelle prese il giorno dell'intervento (Figura 2A, vedere punto 4.5). NOTA: Il deterioramento dell'immagine indica la presenza di danni ai tessuti all'interno del cervello.</li>
	<li>Assicurarsi che le microglia abbiano già recuperato la loro morfologia ramificata (Figura 3C). NOTA: I dati di imaging delle microglia indicano che sono necessarie almeno 3-4 settimane affinché le microglia tornino al loro stato basale.</li>
	<li>Eseguire l'imaging in vivo in qualsiasi strato del CA1 per lo scopo particolare dell'esperimento.</li>
</ol>

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</ol>

Nessuno degli autori ha conflitti di interesse.

Questo metodo contiene elaborate procedure chirurgiche, ma può fornire immagini ad alta risoluzione sull'intero CA1 per un periodo prolungato se preparato correttamente. Esperimenti con diversi topi hanno confermato che la qualità dell'immagine nella fase postoperatoria cronica è migliore di quella dell'imaging postoperatorio acuto. La migliore qualità dell'immagine è stata mantenuta per più di 2 mesi. La causa più comune di fallimento è il danno non intenzionale al CA1 durante l'intervento chirurgico, che viene identificato nel controllo di qualità postoperatorio (vedere fase 4). Ciò può essere dovuto a lesioni dirette per aspirazione, essiccazione del cervello, eccessiva pressione dal vetro o tossicità dal cemento dentale nella fase finale. Un'altra causa di fallimento è il sanguinamento postoperatorio, che può essere confermato attraverso la finestra con fondo di vetro entro 1 settimana dall'intervento chirurgico (vedere il punto 6.1). Leggere attentamente il protocollo e prendere tutte le precauzioni per evitare tali problemi.
Anche con l'attuale configurazione del microscopio a due fotoni con rivelatori GaAsP in laboratorio, il tentativo di visualizzare il CA1 dorsale attraverso la corteccia si traduce in una significativa perdita di risoluzione a causa della diffusione non trascurabile della luce. Pertanto, per ottenere una risoluzione sufficiente per osservare il movimento dei processi microgliali o la formazione di spine dendritiche dei neuroni nel CA1, la rimozione di una parte della corteccia sovrastante è inevitabile, come nel presente metodo. L'unico modo alternativo per ridurre l'estensione della rimozione corticale mantenendo un'elevata risoluzione dell'immagine consiste nell'incorporare una lente a relè, ad esempio una lente con indice di rifrazione gradiente (GRIN). In questo approccio, una lente GRIN è stata posizionata all'interno di un tubo guida impiantato direttamente sopra il CA1 per l'imaging CA1 cronico28,29. Il diametro esterno del tubo guida era di 1,8 mm, che è inferiore ai 3,0 mm del dispositivo in questo documento, pur producendo un'alta risoluzione (NA; 0,82) paragonabile al sistema qui (NA effettivo; 0,88). Tuttavia, l'approccio che utilizza un obiettivo GRIN ha un campo visivo ristretto per l'osservazione ad alta risoluzione e una breve profondità di imaging limitata dal WD dell'obiettivo GRIN. Pertanto, l'imaging di tutti gli strati ippocampali in un ampio campo visivo ad alta risoluzione è un vantaggio specifico del metodo in questo articolo.
Una limitazione di questa procedura è che la rimozione parziale della corteccia e l'infiammazione possono avere alcuni effetti dannosi sull'ippocampo. Tuttavia, poiché la corteccia rimossa non ha alcun input diretto all'ippocampo, la corteccia entorinale non è danneggiata e l'ippocampo stesso non è direttamente danneggiato, la valutazione complessiva è che la compromissione funzionale dell'ippocampo non è significativa. Diversi studi precedenti hanno confermato che le funzioni ippocampali, tra cui l'apprendimento e la memoria, sono preservate dopo l'impianto della finestra ippocampale 25,26,27,30,31,32,33,34. Pertanto, ci si aspetta che l'approccio di imaging qui descritto riporti fedelmente le funzioni dell'ippocampo dopo un periodo postoperatorio sufficiente.
Le direzioni future dei soggetti di ricerca basate su questa tecnica di imaging possono includere la potatura sinaptica rilevata dall'imaging simultaneo di microglia e neuroni5, l'interazione microgliale correlata all'apprendimento con sinapsi35, la motilità microgliale regolata dall'attività neurale ippocampale36 e le risposte microgliali all'infiammazione periferica o al danno tissutale7. Questo metodo aiuterà anche a chiarire la progressione delle malattie neurodegenerative. Ad esempio, nella malattia di Alzheimer (AD), le proteine amiloide β e tau si accumulano in parallelo con la morte delle cellule neuronali e l'atrofia dell'ippocampo, portando a disfunzioni cognitive; microglia sono stati segnalati per essere coinvolti in questo processo37,38. L'imaging cronico in vivo di microglia e neuroni utilizzando i modelli murini di AD ci permetterà di monitorare la correlazione tra funzioni microgliali e patologia neuronale nell'ippocampo dei modelli murini di AD.
Questo articolo si concentra sull'imaging microgliale, ma la stessa procedura di imaging è applicabile agli altri tipi di cellule neuronali e gliali nel CA1. Inoltre, il protocollo è limitato all'imaging di topi anestetizzati, ma la tecnica può anche essere estesa al monitoraggio della microglia ippocampale nei topi svegli. Gli artefatti di movimento indotti dalla respirazione, dai battiti cardiaci e dai movimenti del corpo, specialmente negli strati profondi dell'ippocampo lontano dalla finestra di vetro, possono esistere in esperimenti con topi svegli. Pertanto, potrebbe essere necessario un sistema di correzione del movimento appropriato per catturare la morfologia e la dinamica microgliale.
Discussione relativa al protocollo Si consiglia di selezionare topi di età appropriata e modificazioni genetiche per l'espressione di sonde fluorescenti con specificità temporale e spaziale (vedere punto 1.3). I topi a 1 mese di età possono essere utilizzati per esperimenti, ma i topi di età superiore ai 2 mesi sono più facili da gestire, con le loro dimensioni corporee più grandi e la resistenza allo stress chirurgico. Inoltre, la capsula esterna e l'alveo dell'ippocampo sono più difficili da separare nei topi più giovani. Pertanto, la rimozione della capsula esterna nei topi giovani richiede abilità chirurgiche (vedere punti 3.4.3-4). La valutazione dell'intervento chirurgico e della successiva imaging sarà più semplice con topi che esprimono proteine fluorescenti in modo riproducibile e uniforme nel CA1 e nel DG (vedere punto 4.7). Quindi, nelle prove iniziali dell'intervento chirurgico, è consigliabile utilizzare topi transgenici con neuroni scarsamente marcati, come i topi Thy1-YFP o Thy1-GFP39, o topi con microglia marcata, come i topi CX3CR1-GFP24.
Per un intervento chirurgico di successo, la scelta dell'anestesia è importante (vedere il passaggio 2.1). Diversi tipi di anestesia possono causare vari gradi di edema cerebrale intraoperatorio, che influenzano la difficoltà dell'intervento chirurgico, la posizione relativa del tubo metallico impiantato e l'entità della compressione cerebrale dalla finestra di vetro. Questi fattori possono anche influenzare la sopravvivenza dei neuroni ippocampali dopo l'intervento chirurgico.
Nel processo di aspirazione per esporre l'ippocampo (vedi passo 3.4), i seguenti punti dovrebbero essere notati per ridurre al minimo il danno al cervello e garantire il successo dell'imaging. Fornire costantemente soluzione salina sterile sulla superficie del tessuto posizionando uno sbocco sul lato della finestra cranica. Evitare l'esposizione della superficie del tessuto all'aria durante l'aspirazione. Il principio di base dell'aspirazione del tessuto è la rimozione della superficie del tessuto mediante un flusso di liquido nella punta di aspirazione. Il contatto diretto della punta di aspirazione al tessuto deve essere evitato. Regolare al minimo la pressione negativa applicata al tubo di aspirazione. Aspirare il tessuto passo dopo passo e confermare che il sanguinamento è controllato in ogni passaggio. Quando il sanguinamento è prolungato, attendere che l'emorragia si fermi spontaneamente. Mantenere l'aspirazione da una breve distanza dal punto sanguinante con un flusso costante di soluzione salina sterile. Aspirare il tessuto per creare uno spazio cilindrico con le sue dimensioni che si adattano al tubo metallico con fondo di vetro (vedere il punto 1.1). Scegli aghi da 23 G per aspirare vasi piali spessi o frammenti di tessuto di grandi dimensioni e aghi da 25 G per aspirare piccoli detriti di tessuto.

Le microglia sono le uniche cellule immunitarie e macrofagi tissutali residenti nel cervello. Oltre alle loro funzioni come cellule immunitarie, come la risposta rapida all'infiammazione, hanno dimostrato di svolgere una varietà di ruoli fisiologici nel mantenimento e nel rimodellamento dei circuiti neurali, come la potatura sinaptica, la regolazione della plasticità sinaptica e il controllo dell'attività neuronale 1,2,3,4,5 . Le interazioni fisiologiche tra microglia e neuroni sono di crescente interesse sia nello sviluppo del circuito neurale che nella neurobiologia delle malattie. L'analisi della fisiologia della microglia in vivo richiede metodi per osservare la microglia senza danni ai tessuti e risposte infiammatorie. Tuttavia, le microglia sono sensibili all'infiammazione e cambiano drasticamente le loro forme e funzioni in risposta al danno tissutale 6,7.
L'imaging in vivo a due fotoni è uno strumento ideale per catturare le dinamiche fisiologiche della microglia8. Le applicazioni iniziali dell'imaging a due fotoni in vivo hanno rivelato il movimento dinamico dei processi microgliali per la sorveglianza ambientale nella corteccia del topo adulto 9,10. I seguenti studi di imaging a due fotoni hanno ulteriormente esteso il monitoraggio in vivo della microglia per l'analisi delle interazioni funzionali e strutturali con i neuroni 5,11,12,13,14. Tuttavia, la profondità di imaging della microscopia convenzionale a due fotoni è stata limitata a meno di 1 mm dalla superficie del cervello15,16. Questo vincolo spiega la scarsità di studi precedenti che riportavano il comportamento della microglia nelle regioni profonde del cervello, come l'ippocampo.
Recenti studi di sequenziamento dell'RNA hanno rivelato una notevole eterogeneità regionale delle microglia, aumentando la possibilità di ruoli funzionali distinti 17,18,19,20,21. Pertanto, è necessario registrare le interazioni microgliali con i neuroni in varie regioni del cervello, ma le difficoltà tecniche hanno ostacolato tali studi. In particolare, il coinvolgimento attivo microgliale nel rimodellamento delle sinapsi è stato segnalato per essere critico nello sviluppo della rete neurale ippocampale e delle sue funzioni legate alla memoria22,23. Tuttavia, non sono disponibili metodi efficaci per osservare in vivo la microglia ippocampale incontrastata in vivo.
Questo protocollo spiega le procedure per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nel CA1 dell'ippocampo dorsale utilizzando tecniche chirurgiche controllate con precisione. L'imaging a due fotoni dell'area CA1 in topi CX3CR1-GFP (CX3CR1+/GFP), che esprimono GFP nella microglia24, ha permesso l'osservazione della microglia ramificata in tutti gli strati del CA1 con una risoluzione sufficiente. Il protocollo include diversi suggerimenti per il successo dell'impianto della finestra di osservazione e condizioni di imaging appropriate. Inoltre, la visualizzazione simultanea di neuroni piramidali e microglia nel CA1 è presentata come esempio di applicazione. Vengono anche discussi i vantaggi, i limiti e le potenzialità di questa tecnica.

<table><tbody><tr><td>23 G aghi smussati</td><td>NIPRO</td><td>02-166</td><td>Punte di aspirazione per aspirazione.</td></tr><tr><td>25 G aghi smussati</td><td>NIPRO</td><td>02-167</td><td>Punte di aspirazione per aspirazione.</td></tr><tr><td>Punzoni dermici da 3 mm (DermaPunch)</td><td>Maruho</td><td>213001610</td><td>Strumenti per craniotomia.</td></tr><tr><td>Aghi da 30 G</td><td>Dentronics</td><td>Ago monouso n. 30</td><td>Strumenti per craniotomia.</td></tr><tr><td>Un laser pulsato a femtosecondi</td><td>Spectra-Physics</td><td>MaiTai Deep See</td><td>A Ti: Laser Sapphire utilizzato a una lunghezza d'onda di 920 nm.</td></tr><tr><td>Un microscopio a due fotoni</td><td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td>Microscopio per l'imaging CA1.</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV per la marcatura neuronale.</td></tr><tr><td>AAV1-hSyn-Cre</td><td>Penn Vector Core</td><td></td><td>AAV per la marcatura neuronale.</td></tr><tr><td>Una lente obiettivo per l'imaging a due fotoni</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XSVMP</td><td>obiettivo 25> con una lunga distanza di lavoro, un'elevata apertura numerica e un collare di correzione</td></tr><tr><td>Aspiratori</td><td>Shin-ei Industries</td><td>KS-500</td><td>Strumenti per l'aspirazione.</td></tr><tr><td>Piastre in alluminio</td><td>Narishige</td><td>CP-1</td><td>Piastre in alminum per il fissaggio della testa.</td></tr><tr><td>Crema depilatoria chimica</td><td>YANAGIYA</td><td></td><td>Crema per la depilazione intorno al sito chirurgico.</td></tr><tr><td>Vetrini circolari in vetro</td><td>Matsunami Glass</td><td>3&phi; N.1</td><td>Vetrini coprioggetti incollati a tubi in acciaio inox.</td></tr><tr><td>Topi CX3CR1-GFP</td><td>Il Jackson Laboratory</td> 008451 <td>Topi transgenici per l'imaging microgliale.</td><td></td></tr><tr><td>Tubi cilindrici in acciaio inox</td><td>MORISHITA</td><td>Tubi metallici su misura</td><td>da impiantare. Diametro esterno 3,0 mm, diametro interno 2,8 mm, altezza 1,7 mm.</td></tr><tr><td>Materiale per incisione dentale</td><td>Sun Medical</td><td>204610461</td><td>Utilizzato per incidere le ossa del cranio.</td></tr><tr><td>Cemento resinoso dentale (Super-Bond C& B)</td><td>Sun Medical</td><td>204610555</td><td>Cemento dentale.</td></tr><tr><td>Raccoglitori di dura dura (Micro Points)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10063-15</td><td>Strumenti per la rimozione della dura dura.</td></tr><tr><td>Pinze fini (Dumont #5)</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11252-20</td><td>Strumenti chirurgici.</td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Bio Research Center</td><td>PRI13-3374</td><td>Utilizzato per disinfettare il sito chirurgico.</td></tr><tr><td>Dispositivo di tenuta della testa</td><td>Narishige</td><td>MAG-2</td><td>Il dispositivo di tenuta della testa dei topi con regolatori d'angolo</td></tr><tr><td>Cuscinetto riscaldante</td><td>Bio Research Center</td><td>BWT-100A e HB-10</td><td>Strumenti per fornire supporto termico al mouse durante l'intervento chirurgico.</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>ALA Scientific</td><td>HEATINGPAD-1 e Hot-1</td><td>Tools per fornire supporto termico al mouse sul dispositivo di tenuta della testa.</td></tr><tr><td>Ketamina (Ketalar)</td><td>Daiichi Sankyo Company</td><td>S9-001665</td><td>Anestesia durante l'intervento chirurgico.</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>M1959</td><td>Analgesia durante l'intervento chirurgico.</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Sato Pharmaceutical</td><td></td><td>Utilizzato per prevenire la secchezza oculare durante l'intervento chirurgico.</td></tr><tr><td>Soluzione scrub povidone-iodio</td><td>Meiji Seika Pharma</td><td>2612701Q1137</td><td>Utilizzato per disinfettare il sito chirurgico.</td></tr><tr><td>Coltelli miniaturizzati a punta tonda</td><td>Surgistar</td><td>4769</td><td>Strumenti chirurgici.</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>MURANAKA MEDICAL INSTRUMENTS</td><td>450-098-67</td><td>Strumento chirurgico monouso.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopi</td><td>Leica Microsystems</td><td>S8 APO</td><td>Microscopi per chirurgia.</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Otsuka Pharmaceutical Factory</td><td>3311401A2026</td><td>Soluzione di lavaggio durante l'intervento chirurgico.</td></tr><tr><td>Cuscinetto sterile impermeabile</td><td>AS ONE</td><td>8-5945-01</td><td>Piattaforma chirurgica.</td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7635</td><td>Un colorante per l'imaging dei vasi in vivo.</td></tr><tr><td>Telo chirurgico</td><td>Medline Industries</td><td>MP-0606F6T</td><td>Telo perforato per chirurgia.</td></tr><tr><td>Luce UV</td><td>Toshiba</td><td>GL15</td><td>Utilizzato per polimerizzare gli adesivi.</td></tr><tr><td>Adesivi ottici a polimerizzazione UV</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>Adesivi per l'incollaggio di vetrini coprioggetti su tubi in acciaio inossidabile.</td></tr><tr><td>Xilazina (Celactal 2%)</td><td>Anestesia Bayer</td><td></td><td>durante l'intervento chirurgico.</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging cronico a due fotoni della microglia nell'ippocampo del topo

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Le microglia, le uniche cellule immunitarie residenti nel cervello, partecipano attivamente al mantenimento del circuito neurale modificando le sinapsi e l'eccitabilità neuronale. Studi recenti hanno rivelato l'espressione genica differenziale e l'eterogeneità funzionale della microglia in diverse regioni del cervello. Le funzioni uniche della rete neurale ippocampale nell'apprendimento e nella memoria possono essere associate ai ruoli attivi della microglia nel rimodellamento delle sinapsi. Tuttavia, le risposte infiammatorie indotte dalle procedure chirurgiche sono state problematiche nell'analisi microscopica a due fotoni della microglia ippocampale. Qui viene presentato un metodo che consente l'osservazione cronica della microglia in tutti gli strati dell'ippocampo CA1 attraverso una finestra di imaging. Questo metodo consente l'analisi dei cambiamenti morfologici nei processi microgliali per più di 1 mese. L'imaging a lungo termine e ad alta risoluzione della microglia a riposo richiede procedure chirurgiche minimamente invasive, un'appropriata selezione della lente obiettiva e tecniche di imaging ottimizzate. La risposta infiammatoria transitoria della microglia ippocampale può impedire l'imaging immediatamente dopo l'intervento chirurgico, ma la microglia ripristina la sua morfologia quiescente entro poche settimane. Inoltre, l'imaging dei neuroni contemporaneamente alla microglia ci consente di analizzare le interazioni di più tipi di cellule nell'ippocampo. Questa tecnica può fornire informazioni essenziali sulla funzione microgliale nell'ippocampo.

Utilizzando questa tecnica, la microglia ramificata e quiescente può essere osservata cronicamente all'interno di tutti gli strati della CA1 dorsale, inclusi strati oriens (SO), strato pyramidale (SP), strato radiato (SR) e strato lacunosum-molecolare (SLM), specialmente 3-4 settimane dopo l'intervento chirurgico quando l'infiammazione si attenua. Se l'intervento viene eseguito in modo appropriato, l'imaging può essere eseguito fino a diversi mesi dopo l'intervento chirurgico. Questa sezione contiene tre argomenti utili per la valutazione dell'imaging intravitale. In primo luogo, le immagini campione immediatamente dopo l'intervento chirurgico e nella fase cronica sono fornite come riferimenti per le procedure chirurgiche e di imaging appropriate. In secondo luogo, la morfologia distinta delle microglia, la loro intensità di fluorescenza e la distribuzione dei vasi sanguigni in specifici strati ippocampali sono descritti per aiutare i lettori a stimare la profondità di imaging che va dall'alveo al DG. In terzo luogo, viene fornito un esempio di applicazione che illustra l'imaging simultaneo di neuroni e microglia.
Le immagini rappresentative della microglia nei topi CX3CR1-GFP immediatamente dopo l'intervento chirurgico sono mostrate nella Figura 2. Se non vi è alcun danno apparente al CA1 e la curvatura degli strati CA1 è opportunamente appiattita dal coprislip sovrastante, le profondità di imaging a due fotoni della microglia superano gli interi strati di CA1 e raggiungono i 500 μm dalla superficie chirurgica, dove esistono il ML o lo strato di cellule granulari (GCL) del DG (Figura 2A; vedi punto 4.7 e Figura 4E). Le microglia sono leggermente meno ramificate, specialmente nello strato vicino alla superficie chirurgica rispetto a quelle dell'ippocampo intatto. Tuttavia, non mostrano alcuna attivazione prominente, suggerendo procedure chirurgiche adeguate (Figura 2B). D'altra parte, l'edema nel CA1 indotto dal danno tissutale limiterà la profondità di imaging a 200 μm (Figura 2C). Il danno tissutale induce anche un'attivazione microgliale anomala, come l'accumulo di processi di rigonfiamento verso la superficie del tessuto libero (Figura 2D; confronta con l'immagine superiore della Figura 2B). Questi sono segni di chirurgia inappropriata.
Le immagini rappresentative della microglia nella fase cronica più di 3 settimane dopo l'intervento chirurgico sono mostrate in Figura 3. Le microglia possono essere riprodotte oltre il CA1 fino agli strati più profondi del DG con maggiore intensità e risoluzione fluorescente e con una distribuzione più omogenea (vedi passo 6.3, Figura 3B). La qualità dell'imaging è migliore di quella immediatamente dopo l'intervento chirurgico (Figura 2A). Questa differenza può essere spiegata da edema e infiammazione ridotti. Le microglia in tutti gli strati hanno già ripristinato la loro morfologia ramificata (Figura 3C), diversa dal loro aspetto postoperatorio (Figura 2B). L'imaging time-lapse della microglia nel CA1 rivela i corpi cellulari immobili e i processi altamente mobili per la sorveglianza (Video 1-2). Il loro comportamento mobile è simile al precedente rapporto sulla dinamica del processo microgliale nella corteccia9.
È semplice specificare gli strati ippocampali ripresi in base alla distribuzione e alla profondità dei corpi cellulari neuronali, utilizzando topi che esprimono sonde fluorescenti nei neuroni ippocampali25,26,27. Senza l'aiuto delle informazioni posizionali sui corpi cellulari dei neuroni, i segnali provenienti dalla microglia fluorescente da soli forniscono alcuni indizi per l'identificazione degli strati ippocampali (Figura 3B). Le microglia nell'alveo hanno corpi cellulari allungati e processi che tendono ad estendersi lungo i tratti assonali (Figura 4A). Le microglia in altri strati possono essere distinte dai loro corpi cellulari rotondi e dai processi che si irradiano senza direzioni preferite. Le microglia in SP sono tra i neuroni piramidali densamente imballati e possono essere distinti dalla minore densità dei processi microgliali. Gli strati sopra e sotto SP sono identificati rispettivamente come SO e SR (Figura 4B). È impossibile distinguere tra SR e SLM basandosi solo sulle proprietà microgliali. Il confine tra il CA1 e il DG è riconosciuto da spessi vasi sanguigni che corrono lungo il confine (Figura 4C). Questi vasi possono essere meglio riconosciuti etichettando i vasi con coloranti come sulforhodamine 101 (SR101; 5 mM, 4 μL / g di peso corporeo) iniettati per via intraperitoneale (Figura 4D). Il segnale di fluorescenza delle microglia diminuisce bruscamente nel DG rispetto al sovrastante CA1, probabilmente a causa della differenza nell'indice di rifrazione di queste strutture. Questo divario nell'intensità della fluorescenza può anche aiutare a specificare il confine tra il DG e CA1. Come esempio applicativo, viene mostrato l'imaging simultaneo di microglia GFP-positive e neuroni piramidali marcati con pomodoro (Figura 4E). In questo esperimento, i topi CX3CR1-GFP hanno ricevuto un'iniezione di virus adeno-associato (AAV) per l'espressione di tdTomato nei neuroni piramidali dell'ippocampo. La marcatura neuronale aiuterà a comprendere le esatte strutture degli strati del CA1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig01.jpg"> Figura 1: Disegni schematici per l'impianto della finestra di osservazione . (A) Vista in sezione trasversale del tubo metallico con fondo di vetro assemblato. Una copertura circolare in vetro aderisce a un'estremità del tubo cilindrico in acciaio inossidabile. (B) Vista in sezione trasversale della piastra di alluminio attaccata al cranio. La piastra deve essere parallela alla superficie marcata del cranio in modo da non interferire con la lente dell'obiettivo, posizionata vicino alla piastra per la messa a fuoco. (C) Vista in sezione trasversale del tubo impiantato. Il fondo di vetro deve essere strettamente attaccato all'alveo dell'ippocampo per premere delicatamente e appiattire la superficie del CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig02.jpg"> Figura 2: Imaging in vivo della microglia in topi CX3CR1-GFP immediatamente dopo l'intervento chirurgico. (A) Ricostruzione 3D rappresentativa dall'imaging CA1 in vivo di un topo CX3CR1-GFP nel giorno postoperatorio (POD) 0 (larghezza: 511 μm, altezza: 511 μm, profondità: 550 μm). La microglia fluorescente nel ML del DG a una profondità di 500 μm dal fondo di vetro può essere ripresa attraverso l'intero CA1. (B) Le tipiche microglia riempite di GFP ottenute in (A) sono mostrate come proiezioni di massima intensità (MIP) di pile di immagini con spessore di 20 μm a profondità di 100, 300 e 520 μm dal fondo di vetro. La morfologia microgliale è rilevabile dal CA1 superficiale al ML della DG, sebbene con apparente deterioramento dell'immagine nella DG. Le microglia, specialmente nello strato vicino alla superficie chirurgica, sono meno ramificate ma non mostrano alcuna attivazione evidente. Barre di scala, 50 μm. (C) Ricostruzione rappresentativa dell'immagine 3D del CA1 danneggiato chirurgicamente. I dati sono stati acquisiti da un mouse CX3CR1-GFP su POD 0 (larghezza: 399 μm, altezza: 399 μm, profondità: 450 μm). La fluorescenza microgliale è rilevabile solo fino alla profondità di 200 μm, in contrasto con il CA1 (A) non danneggiato con microglia fluorescente rilevata a una profondità di 500 μm. (D) L'immagine tipica della microglia attivata in modo anomalo in (C). Il MIP delle pile di immagini GFP con uno spessore di 20 μm a una profondità di 60 μm mostra processi di rigonfiamento microgliale che si estendono verso la superficie del tessuto esposto chirurgicamente. La morfologia microgliale complessiva è diversa dall'immagine mostrata in (B). Barra scala, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig03.jpg"> Figura 3: Imaging in vivo della microglia in topi CX3CR1-GFP in fase cronica. (A) L'aspetto rappresentativo della finestra impiantata sulla dorsale destra CA1 nella fase cronica. Attraverso il fondo di vetro, le fibre bianche dell'alveo sono chiaramente osservate senza sanguinamento postoperatorio. Il DHC e il LV sono parzialmente visibili rispettivamente nell'area caudomediale e nel bordo rostrolaterale. Barra della scala, 1 mm. (B) Ricostruzione 3D rappresentativa dall'imaging CA1 cronico in vivo di un topo CX3CR1-GFP su POD 24 (larghezza: 511 μm, altezza: 511 μm, profondità: 670 μm). Rispetto alle immagini immediatamente dopo l'intervento chirurgico (Figura 2A), le microglia mostrano una distribuzione più omogenea e possono essere osservate più chiaramente negli strati più profondi del DG a causa della riduzione dell'edema e dell'infiammazione. (C) Le immagini tipiche della microglia da (B) con morfologia ramificata completamente ripristinata sono mostrate come MIP di pile di immagini GFP con spessore di 20 μm a profondità di 100, 280 e 500 μm dalla superficie chirurgica. Barre di scala, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64104/64104fig04.jpg"> Figura 4: Indizi per identificare ogni strato dell'ippocampo durante l'imaging in vivo e un esempio di applicazione di questo metodo. (A) L'immagine tipica della microglia nell'alveo di topi CX3CR1-GFP in fase cronica. I corpi cellulari microgliali e i processi che si estendono lungo i tratti assonali sono mostrati nel MIP di pile di immagini GFP con uno spessore di 10 μm ad una profondità di 15 μm. Barra di scala, 50 μm. (B) Immagini rappresentative della microglia in SO, SP e SR nella fase cronica mostrate come MIP di pile di immagini GFP con spessore di 5 μm. La densità locale dei processi microgliali è inferiore in SP rispetto a SO o SR circostanti a causa dei neuroni piramidali densamente imballati in SP. Barre di scala, 100 μm. (C) I vasi sanguigni spessi che corrono lungo il confine tra CA1 e DG possono essere riconosciuti solo dalla fluorescenza microgliale. Viene mostrata la proiezione di intensità media di pile di immagini GFP piastrellate con spessore di 90 μm nella fase cronica a una profondità di circa 500 μm. Il vuoto del segnale GFP corrisponde ai vasi spessi. Barra della scala, 500 μm. (D) (superiore) L'immagine dello stesso campo visivo di C dopo iniezione intraperitoneale di SR101. Barra scala, 500 μm. (inferiore) Ricostruzione 3D delle immagini di piastrellatura dopo l'iniezione di SR101 (larghezza: 2,60 mm, altezza: 1,73 mm, profondità: 0,69 mm). I vasi spessi che corrono lungo il confine tra il CA1 e il DG possono essere facilmente riconosciuti dalla fluorescenza intravascolare SR101. (E) (a sinistra) ricostruzione 3D del CA1 e del DG (larghezza: 255 μm, altezza: 255 μm, profondità: 730 μm) e (a destra) il MIP di GFP e tdTomato fluorescenza in SP costituito da pile di immagini con spessore di 20 μm. A 1 settimana prima dell'intervento, 1,5 μL di una miscela di AAV1-CAG-FLEX-tdTomato (5,0 x 10 12 vg/mL) e AAV1-hSyn-Cre (1,0 x10 9 vg/mL) sono stati iniettati nell'ippocampo di un topo CX3CR1-GFP per marcare i neuroni in modo scarso. L'imaging è stato eseguito su POD 0. SP e GCL sono facilmente riconoscibili dalla posizione dei corpi cellulari neuronali. Barra scala, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/64104fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Video 1: Imaging time-lapse della microglia SO nella fase cronica. Il MIP dell'immagine GFP si impila con uno spessore di 20 μm nell'imaging time-lapse della microglia SO, animato in modo che 28 minuti vengano riprodotti in 1 secondo. Barra scala, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video1.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Imaging time-lapse della microglia SR nella fase cronica. Il MIP dell'immagine GFP si impila con uno spessore di 20 μm nell'imaging time-lapse della microglia SR, animato in modo che 28 minuti vengano riprodotti in 1 secondo. Barra scala, 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64104/Video2.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

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I ruoli della microglia nell'ippocampo non sono ancora completamente compresi. Questo protocollo può visualizzare direttamente come le microglia contattano e regolano i neuroni. L'imaging in vivo della microglia e dei neuroni a riposo nell'ippocampo è stato molto difficile.Questo metodo può risolvere questo problema. Per impiantare la finestra di osservazione, creare un solco circolare di tre millimetri sul cranio usando un pugno dermico, assicurando l'allineamento del solco con l'area precedentemente contrassegnata. Quando il punch dermico raggiunge lo strato più interno del cranio prima di toccare la dura sottostante, sollevare delicatamente l'isola ossea centrale usando un ago calibro 30.Quindi, rimuovere con attenzione la dura usando un raccoglitore di dura. Aspirare la pia, i vasi piali e il tessuto corticale dalla superficie. Mantenere omogenea la profondità della superficie del tessuto esposto su tutta la finestra cranica e approfondire gradualmente l'aspirazione fino a esporre le fibre della capsula esterna.Dopo aver posizionato la punta di aspirazione sulla capsula esterna vicino al ventricolo laterale all'estremità rostrolaterale della finestra cranica, rimuovere lo strato superficiale della capsula esterna che scorre nel caudomediale verso la direzione rostrolaterale. Quindi rimuovere lo strato interno che scorre nella direzione mediolaterale. Confermare la rimozione dell'intera capsula esterna controllando la piena esposizione della superficie dell'alveo e della commissura ippocampale dorsale.Dopo essersi assicurati che l'emorragia si sia completamente fermata, riempire il foro con soluzione salina sterile fino al livello della superficie del cranio. Quindi, inserire il tubo metallico inferiore di vetro verticalmente nel foro mentre si aspira l'acqua in eccesso che trabocca dai lati del tubo fino a quando il fondo di vetro preme leggermente contro l'alveo e appiattisce parzialmente il CA1 sottostante. Utilizzando il cemento in resina dentale, fissare la parete del tubo inserito al cranio circostante.Posizionare il mouse nel dispositivo di tenuta della testa sotto la lente dell'obiettivo del microscopio a due fotoni e sullo stadio di scansione XY motorizzato. Quindi riempire lo spazio tra il fondo di vetro e la lente dell'obiettivo con acqua senza creare bolle d'aria. Regolare la messa a fuoco su CA1 con la guida della fluorescenza emessa dal parenchima cerebrale e la luce riflessa dal bordo del tubo metallico sotto illuminazione continua dal laser pulsato.Regolare l'angolazione della testa del mouse inclinando il dispositivo di tenuta della testa in modo che il fondo di vetro sia parallelo al piano di imaging. Quindi regolare il collare di correzione dell'obiettivo per ottenere la massima risoluzione a una profondità della struttura target nel CA1. Successivamente, confermare che le cellule fluorescenti nello strato molecolare del giro dentato o DG a una profondità di 500 micrometri dal fondo di vetro siano visualizzate nell'intero campo visivo.Solo in caso di intervento chirurgico di successo, i segnali DG possono essere rilevati immediatamente. Sollevare il topo postoperatorio in un alloggiamento individuale per diverse settimane. Impostare il mouse anestetizzato sotto il microscopio a due fotoni.Eseguire l'imaging dell'ippocampo. Confermare se la qualità e l'intensità delle immagini catturate dopo la riduzione dell'edema postoperatorio sono migliori o paragonabili a quelle catturate il giorno dell'intervento. Assicurarsi che le microglia abbiano recuperato la loro morfologia ramificata.Quindi eseguire l'imaging in vivo sullo strato di interesse nel CA1. La microglia nei topi CX3CR1-GFP catturati immediatamente dopo l'intervento chirurgico non ha mostrato alcuna attivazione prominente. Dopo un intervento chirurgico di successo senza induzione di edema, le profondità di imaging a due fotoni hanno superato gli interi strati CA1 e hanno raggiunto i 500 micrometri dalla superficie chirurgica.La microglia nella fase cronica di più di tre settimane dopo l'intervento chirurgico ha mostrato maggiore intensità e risoluzione fluorescente e una distribuzione più omogenea a causa della riduzione dell'edema e dell'infiammazione. Le microglia in tutti gli strati hanno già ripristinato la loro morfologia ramificata e hanno mostrato corpi cellulari immobili e processi altamente modali. Le immagini ad alta risoluzione sull'intero CA1 sono state fornite per diversi mesi.I segnali provenienti dalla microglia fluorescente aiutano a identificare gli strati ippocampali. La microglia nell'alveo aveva corpi cellulari allungati e processi che si estendevano lungo i tratti assonali. Le microglia nello strato pyramidale potrebbero essere distinte dalla minore densità dei loro processi.Il confine tra il CA1 e il DG potrebbe essere riconosciuto da spessi vasi sanguigni che corrono lungo il confine che è stato meglio riconosciuto etichettando i vasi con sulforhodamine 101. Come esempio di applicazione, sono state visualizzate simultaneamente microglia positive alla GFP e neuroni piramidali marcati con tdTomato. La marcatura neuronale ha aiutato a comprendere le esatte strutture degli strati del CA1.Il punto più importante è ridurre i danni chirurgici. Evitare danni ai tessuti per aspirazione. Applicare una leggera pressione quando si inserisce il fondo di vetro ed evitare che il cemento dentale tocchi la superficie del cervello.Questo approccio aiuterà a identificare il ruolo della microglia nell'ippocampo. Ad esempio, come le microglia interagiscono con i neuroni, come sono coinvolti nell'apprendimento e come controllano le malattie del cervello.

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