Utilizzo di un elettrodo bipolare per creare un modello murino per l'epilessia del lobo temporale mediante accensione elettrica dell'amigdala

Questo protocollo ha proposto un modello di epilessia con l'amigdala come origine. Apre la strada allo studio delle strutture del lobo temporale mesiale. Questo modello potrebbe essere interpretato come la base dell'esperimento.

Poiché questo protocollo è un metodo economico ed efficiente, può essere eseguito rapidamente nella maggior parte dei laboratori. A dimostrare la procedura sarà Yongchang Lu, un post-laurea nel nostro laboratorio. Inizia raccogliendo i componenti pre-preparati iniziando con pezzi lunghi due centimetri di filo di tungsteno rivestito in teflon con un diametro dell'orso di 76,2 micrometri.

Un pezzo di filo d'argento con un diametro dell'orso di 127 micrometri della stessa lunghezza e una serie di perni di corda a due per due gauge. Utilizzare un accendino per bruciare un'estremità di ciascun filo di tungsteno per rimuovere cinque millimetri del rivestimento isolante. Sbucciare una sezione di filo multifilo ultra sottile.

Scartare dal basso verso l'estremità superiore dove inizia a fare buio continuando verso l'alto. Combina questo filo super sottile e il filo di tungsteno pizzicando un'estremità e ruotando delicatamente l'altra, consentendo ai due materiali di essere facilmente intrecciati insieme. Tirare delicatamente per assicurarsi che i fili siano ben avvolti e tagliare il filo super sottile in eccesso.

Cerca di mantenere il filo di tungsteno dritto durante tutto il processo. Fissare il perno della corda al morsetto sul tavolo di saldatura con il lato più lungo dei perni rivolto verso l'esterno. Utilizzare l'ago della siringa per raccogliere un po 'di pasta saldante e applicarla ai perni.

Riscaldare la torcia di saldatura a 320 gradi Celsius. Sciogliere e spalmare del filo di stagno senza piombo con la punta della torcia. Sovrapporre l'estremità superiore del filo di tungsteno con un ago dei perni della corda e utilizzare la saldatura sulla torcia per legare il filo di tungsteno al perno.

Saldare un altro filo di tungsteno e un altro filo d'argento al perno della corda allo stesso modo in modo che ogni filo corrisponda a un ago. Tagliare due tubi termorestringenti leggermente più lunghi dell'estremità superiore del filo di tungsteno. Metterli sul giunto di saldatura di due fili di tungsteno assicurandosi che la parte conduttiva sia completamente coperta nel tubo in modo che il circuito dei due fili di tungsteno non sia posizionato in serie.

Rimuovere l'elettrodo dal morsetto del tavolo di saldatura e tenere delicatamente l'elettrodo con pinze di grandi dimensioni poiché è facile che gli elettrodi perdano la loro forma quando si riscalda il tubo restringibile. Utilizzare un buon morsetto di conducibilità termica con una forza leggermente maggiore. Accendere il condotto dell'aria e riscaldare fino a raggiungere una temperatura di 320 gradi Celsius.

Soffiare il tubo termorestringente per alcuni secondi fino a quando non viene serrato. Rinforzare l'elettrodo con adesivo hot melt. Tenere i due fili di tungsteno e torcerli insieme, mantenendo le estremità separate.

Tagliare i fili di tungsteno intrecciati a circa 10 millimetri di lunghezza in modo che la separazione alle estremità non superi 0,5 millimetri. Controllare gli elettrodi con un multimetro posizionando una barra del multimetro sul lato non saldato dei perni della corda e toccando delicatamente l'estremità del filo di tungsteno o del filo d'argento sull'altra barra. Verifica se il circuito è liscio.

Assicurarsi che le linee non siano posizionate in serie. Staccare cinque millimetri della pelle isolante a ciascuna estremità per esporre il filo metallico all'interno. Aggiungere una sezione di tubo termorestringente a ciascun filo di avviamento.

Saldare ogni filo con la spina del connettore del dispositivo EEG. Restringere il tubo termorestringente con aria calda. Aggiungere una sezione di tubo termorestringente a ciascun filo del rotore.

Avvitare insieme le parti conduttrici dei fili rossi e arancioni e saldarle a un giunto e alla testata per adattarsi al perno della corda. Saldare gli altri due fili sulla testata a ciascun giunto. Pesare il mouse.

Quando il mouse è completamente anestetizzato, radere i peli dall'occhio all'area dell'orecchio con un rasoio. Fissare il mouse sulla cornice stereotassica. Inserire i denti anteriori superiori nella barra incisiva e inserire entrambe le barre auricolari a profondità uguali nelle orecchie.

Applicare l'unguento oculare eritromicina agli occhi per prevenire secchezza e cecità causate dalla luce intensa durante l'intervento chirurgico. Disinfettare l'area chirurgica almeno tre volte con tamponi alternati di iodophor e alcool al 75%. Fare un'incisione longitudinale per esporre completamente l'area chirurgica o fare un'incisione triangolare purché esponga le fontanelle anteriori e posteriori e i siti di impianto degli elettrodi.

Arrotolare un piccolo pezzo di cotone in una palla e bagnarlo con perossido di idrogeno al 3%. Rimuovere il tessuto molle attaccato al cranio strofinando delicatamente l'area esposta con un piccolo batuffolo di cotone fino a quando non si vedono la fontanella anteriore e posteriore. Regolare le altezze anteriore e posteriore in modo che la fontanella anteriore e posteriore sia orizzontale.

Considera la posizione della fontanella anteriore come l'origine degli assi. Fissare una vite in acciaio inossidabile al cranio cerebellare sinistro. Impostare le coordinate per l'accensione dell'amigdala dal bregma e regolare il dispositivo stereotassico per individuare questo punto e contrassegnarlo.

Praticare un foro sul punto di marcia con un trapano a teschio da 0,5 millimetri di diametro. Fissare gli elettrodi all'asta di localizzazione del dispositivo stereotassico. Posizionare l'elettrodo verticalmente sopra il foro e abbassare lentamente la posizione a meno 4,9 millimetri.

Avvolgere il filo d'argento intorno alla vite tre volte. Fare attenzione a non scuotere il corpo dell'elettrodo durante il funzionamento. Mescolare il cemento dentale e applicarlo delicatamente sulla superficie dell'elettrodo e del cranio.

Quando il cemento dentale si indurisce, modificare l'esterno fino a quando il cemento che racchiude l'elettrodo fisso si trasforma in un cono. Quindi rilasciare l'elettrodo dal dispositivo stereotassico. Rimuovere il mouse e rimetterlo nella gabbia.

Tenerlo separato dagli altri topi. Inserire il mouse in una scatola personalizzata con cavi scorrevoli che collegano l'elettrodo sulla testa del mouse e il dispositivo EEG. Far passare il cavo attraverso un foro nel coperchio della scatola e regolare la lunghezza rimasta nella scatola per consentire al mouse di muoversi liberamente.

Accendere il dispositivo EEG e assicurarsi che funzioni correttamente. Impostare i parametri dello stimolatore per fornire impulsi monofasici a onde quadra di un millisecondo a 60 hertz per una durata del treno di un secondo per 10 cicli di stimolazione. Inizia con un'intensità di corrente di 50 microampere per la prima stimolazione.

Monitorare l'EEG per dopo la scarica caratterizzata da picchi ad alta frequenza. Se non si osserva alcuna scarica dopo aggiungere 25 microampere allo stimolo successivo e continuare questo processo ogni 10 minuti fino a quando non si osserva una scarica successiva che dura cinque secondi. Stimolare il mouse con l'intensità di corrente determinata ogni 15 minuti, non più di 20 volte al giorno.

Monitorare le risposte comportamentali allo stimolo. L'intervento chirurgico di impianto dell'elettrodo è stato eseguito su sei topi adulti sani C57 neri 6 e la stimolazione elettrica è stata eseguita due settimane dopo l'intervento. Il livello di crisi comportamentali è aumentato gradualmente con l'aumentare del numero di stimoli ed è stato registrato il numero di stimoli necessari per l'accensione completa.

L'EEG dopo le dimissioni è durato da cinque a 15 secondi. Poi le scariche spontanee intracraniche si sono intensificate e sono iniziati i sintomi comportamentali. La durata delle crisi era di solito inferiore a un minuto, il che riduce il rischio di morte per gravi convulsioni con conseguente apnea.

L'espressione di c-Fos nel tessuto cerebrale è stata rilevata mediante immunoistochimica due ore dopo la completa accensione. I risultati mostrano che l'espressione di c-Fos nell'amigdala omolaterale è aumentata significativamente verificando la fattibilità di questo modello. La separazione delle estremità del filo di tungsteno non deve superare i mezzi millimetri altrimenti non passerà attraverso il foro del cervello.

La lunghezza dell'elettrodo non dovrebbe essere troppo lunga, altrimenti influenzerà l'attività dei topi.