Name: Sviluppo di linee cellulari muscolari knock-out utilizzando lediting genetico CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Impara a generare linee cellulari muscolari knock-out con CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus per studiare la funzione genica nelle miopatie. Questo metodo rapido ed economico supera i modelli animali tradizionali.

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Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dell'Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) e dell'Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

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<li>Luis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+old+and+the+new%3A+Prospects+for+non-integrating+lentiviral+vector+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology.</a> Viruses. 12 (10), 1103(2020).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Un passo importante sulla strada verso la caratterizzazione di geni di funzione sconosciuta coinvolti in patologie è lo sviluppo di modelli cellulari rilevanti per studiare la funzione di questi geni. L'uso dell'editing genetico utilizzando CRISPR / Cas9 è un campo di ricerca in crescita esponenziale e lo sviluppo di modelli knock-out come presentato qui è tra le sue applicazioni più utilizzate. In questo contesto, proponiamo qui un protocollo versatile per sviluppare un knock-out della linea cellulare umana in qualsiasi...

Con il progredire del sequenziamento genico e l'identificazione di mutazioni in geni di funzioni sconosciute in un tessuto specifico, lo sviluppo di modelli cellulari rilevanti per comprendere la funzione di un nuovo gene bersaglio e confermare il suo coinvolgimento nei relativi meccanismi fisiopatologici costituisce uno strumento essenziale. Inoltre, questi modelli sono di grande importanza per i futuri sviluppi terapeutici 1,2 e costituiscono un'interessante alternativa allo sviluppo di modelli animali knock-out in linea retta con le raccomandazioni internazionali per la riduzione dell'uso di animali nella sperimentazione. L'editing genetico con CRISPR/Cas9 è tra gli strumenti più potenti attualmente disponibili, che ha permesso lo sviluppo di molti modelli knock-out/knock-in, e la validazione genica mirata con CRISPR/Cas9 è tra le applicazioni più utilizzate di CRISPR/Cas93. Il successo dell'editing genetico si basa sulla capacità di introdurre gli strumenti CRISPR (gli RNA guida e la nucleasi Cas9) nel modello cellulare target, che può essere una sfida in molte cellule difficili da trasfettare, come le cellule muscolari4. Questa sfida può essere superata con l'uso del virus, di solito lentivirus, che ha il grande vantaggio di trasdurre in modo efficiente molti tipi di cellule e fornire il suo transgene. Ma il suo principale svantaggio è l'integrazione del transgene nel genoma della cellula ospite, che porta a una potenziale alterazione dei geni localizzati nel sito di integrazione e all'espressione permanente del transgene, che nel caso della nucleasi Cas9 comporterebbe conseguenze dannose5. Merienne e colleghi6 hanno proposto una soluzione intelligente, che consiste nell'introduzione nelle cellule di un RNA guida mirato al gene Cas9 stesso, portando all'inattivazione di Cas9. Un adattamento di questa strategia è presentato qui come un protocollo facile da usare e versatile che consente di eliminare praticamente qualsiasi gene in cellule difficili da trasfettare.
L'obiettivo del protocollo qui presentato è quello di indurre l'inattivazione di un gene di interesse nelle cellule muscolari immortalizzate. Può essere usato per mettere fuori uso qualsiasi gene di interesse, in diversi tipi di cellule immortalizzate. Il protocollo qui descritto contiene passaggi per progettare gli RNA guida e la loro clonazione in plasmidi lentivirali, per produrre gli strumenti CRISPR in vettori lentivirali, per trasdurre le cellule con i diversi lentivirus e per clonare le cellule per produrre una linea cellulare omogenea modificata.
Utilizzando questo protocollo, sono state sviluppate cellule muscolari scheletriche umane immortalizzate con delezione del recettore della rianodina di tipo 1 (RyR1), un canale del calcio essenziale coinvolto nel rilascio intracellulare del calcio e nella contrazione muscolare7. Il knock-out (KO) del gene è stato confermato a livello proteico utilizzando Western blot e a livello funzionale utilizzando l'imaging del calcio.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-CACNA1S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>CalPhos Kit di trasfezione dei mammiferi</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>Kit di trasfezione</td></tr><tr><td>Easy blot anti IgG di topo</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Easy blot anti IgG di coniglio</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP anticorpo secondario</td></tr><tr><td>Fluo-4 diretto</td><td>Sonde molecolari</td><td>F10472</td><td>Imaging del calcio</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) MAb di coniglio&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>#2118</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Enzima di restrizione</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Kit di legatura</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion Alta fedeltà con GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix per reazione PCR con Taq polimerasi ad alta fedeltà e dNTP</td></tr><tr><td>Anticorpo a catena pesante della miosina</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Anticorpo primario</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; 740424</td><td>Kit di maxipreparazione per la purificazione dei plasmidi</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel e PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>Purificazione del DNA</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td> 740952 <td>Kit per l'estrazione del DNA dalla cellula</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chimicamente competente&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Cellule chimicamente competenti</td></tr><tr><td>Plasmide #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Plasmide lentivirale che codifica per SpCas9 (per LV-Cas9)</td></tr><tr><td>Plasmide #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Spina dorsale lentivirale per l'inserimento di cassette con guide (per LV-guide-target)</td></tr><tr><td>Plasmide #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plasmide lentivirale che codifica per l'imballaggio lentivirale GAG POL</td></tr><tr><td>Plasmide #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Proteina dell'involucro codificante per il plasmide lentivirale lentivirale e MuLV per la produzione di particelle retrovirali lentivirali</td></tr><tr><td>V5 Tag Anticorpo monoclonale</td><td>Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>Anticorpi primari</td></tr><tr><td>XL10-Gold Cellule ultracompetenti</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Cellule chimicamente competenti</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Enzima di restrizione</td></tr></tbody></table>

sviluppo di linee cellulari muscolari knock-out utilizzando l'editing genetico crispr/cas9 mediato da lentivirus

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Un'importante applicazione delle ripetizioni palindrome brevi intervallate regolatorie raggruppate (CRISPR)/Cas 9 è lo sviluppo di linee cellulari knock-out, in particolare per studiare la funzione di nuovi geni/proteine associati a una malattia, identificati durante la diagnosi genetica. Per lo sviluppo di tali linee cellulari, due questioni principali devono essere districate: l'inserimento degli strumenti CRISPR (il Cas9 e l'RNA guida) ad alta efficienza nelle cellule scelte e la restrizione dell'attività Cas9 alla delezione specifica del gene scelto. Il protocollo qui descritto è dedicato all'inserimento degli strumenti CRISPR in cellule difficili da trasfettare, come le cellule muscolari. Questo protocollo si basa sull'uso di lentivirus, prodotti con plasmidi pubblicamente disponibili, per i quali vengono descritte tutte le fasi di clonazione per colpire un gene di interesse. Il controllo dell'attività di Cas9 è stato effettuato utilizzando un adattamento di un sistema precedentemente descritto chiamato KamiCas9, in cui la trasduzione delle cellule con un lentivirus che codifica un RNA guida mirato al Cas9 consente la progressiva abolizione dell'espressione di Cas9. Questo protocollo è stato applicato allo sviluppo di una linea cellulare muscolare umana RYR1-knock out, che è stata ulteriormente caratterizzata a livello proteico e funzionale, per confermare il knockout di questo importante canale del calcio coinvolto nel rilascio intracellulare di calcio muscolare e nell'accoppiamento eccitazione-contrazione. La procedura qui descritta può essere facilmente applicata ad altri geni nelle cellule muscolari o in altre cellule difficili da trasfettare e produrre strumenti preziosi per studiare questi geni nelle cellule umane.

Questo protocollo è stato applicato a mioblasti immortalizzati da un soggetto sano15 (le cosiddette cellule HM, per i mioblasti umani), in cui il RyR1 è stato precedentemente caratterizzato16, al fine di eliminare il gene RYR1 che codifica per la proteina RyR1. Il design dell'RNA delle guide è stato fatto per eliminare la sequenza che comprende parte dell'esone 101 e dell'introne 101 del gene. Si prevede che la cancellazione di parte dell'esone 101 provocherà l'int...

Il protocollo descrive come generare mioblasti knock-out utilizzando CRISPR/Cas9, partendo dalla progettazione di RNA guida alla clonazione cellulare e alla caratterizzazione dei cloni knock-out.

Sviluppo di linee cellulari muscolari knock-out utilizzando l'editing genetico CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Questo protocollo consente lo sviluppo del knock-out delle cellule muscolari in qualsiasi gene, al fine di studiare ulteriormente la funzione di questo gene nel muscolo. Il vantaggio è che è economico e più veloce dello sviluppo di animali knock-out per studiare qualsiasi gene. Questa tecnica può essere utilizzata, ad esempio, per studiare il coinvolgimento di un gene appena identificato in una miopatia.Se la tecnica qui descritta viene applicata alle cellule iPS può portare allo sviluppo di cellule knock-out per qualsiasi gene in qualsiasi tipo di cellule. Per iniziare a raggruppare brevi ripetizioni palindrome regolarmente intervallate o la delezione genica mediata da CRISPR, utilizzare prima gli strumenti del browser del genoma come ensembl. org per identificare il gene bersaglio insieme alle sequenze di DNA su entrambi i lati di esso.Per ottenere l'elenco degli esoni genici, fare prima clic sulla trascrizione della sequenza di codifica proteica e poi su Exons. Quindi, fare clic su Scarica sequenza e selezionare solo Sequenza genomica per scaricare la sequenza di consenso completo dell'intero gene. Scorri l'elenco degli esoni e degli introni del gene per selezionare quelli mirat

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Il sistema / Cas9 CRISPR offre il potenziale per fare l'editing genoma mirato accessibile e conveniente per la comunità scientifica. Questo protocollo ha lo scopo di dimostrare come creare virus che sarà ad eliminazione diretta di un gene di interesse utilizzando il sistema / Cas9 CRISPR, e poi iniettare stereotassica nel cervello di topo adulto.

Progettazione, Packaging, e consegna di alto titolo CRISPR Retro e lentivirus via Stereotassica iniezione

I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.

Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

Un protocollo per la veloce rottura CRISPR/Cas9-mediata del gene nel topo ed emopoietici umani primari è descritto in questo articolo. Cas9-sgRNA ribonucleoproteine vengono introdotti tramite elettroporazione con sgRNAs generato tramite trascrizione in vitro e commerciale Cas9. Alta efficienza di editing si ottiene con tempo limitato e costi finanziari.

Rottura del Gene altamente efficiente di cellule progenitrici ematopoietiche Murine ed umane di CRISPR/Cas9

Qui, presentiamo un protocollo per modificare geneticamente le cellule primarie o espanso umana naturale dell'assassino (NK) utilizzando Cas9 ribonucleoproteine (Cas9/RNP). Utilizzando questo protocollo, abbiamo generato le cellule NK umane carenti per trasformare il recettore del fattore di crescita – b 2 (TGFBR2) e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1 (HPRT1).

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

Descritto sono protocolli per l'editing genomico altamente efficiente di cellule staminali e progenitrici (HSPC) murine (HSPC) dal sistema CRISPR/Cas9 per sviluppare rapidamente sistemi di modelli murini con modifiche genetiche specifiche del sistema ematopoietico.

Modifica del genoma mediato da Lentiviral/Cas9 per lo studio delle cellule ematopoietiche nei modelli di malattia

Man mano che i protocolli relativi a CRISPR diventano sempre più utili e accessibili, possono ancora sorgere complicazioni e ostacoli in specifiche condizioni sperimentali. Questo protocollo delinea la creazione di una linea cellulare umana knockout per serina/treonina-proteina chinasi 1 (RIPK1/RIP1) che interagisce con il recettore utilizzando CRISPR/Cas9 ed evidenzia le potenziali sfide incontrate durante questo processo.

Generazione di una linea cellulare RIP1 knockout U937 utilizzando il sistema CRISPR-Cas9

Il metodo presentato descrive la generazione di un knockout genico mediato da CRISPR nella linea H9 di cellule staminali embrionali umane (hESC), che esprime stabilmente sgRNA che hanno come bersaglio il gene L2HGDH utilizzando un sistema di rilascio genico lentivirale mediato altamente efficiente.

Delezione genica mediata da CRISPR-Cas9 in cellule staminali pluripotenti umane coltivate in condizioni prive di alimentatore

La linea cellulare THP-1 è ampiamente utilizzata come modello per studiare le funzioni dei monociti/macrofagi umani in varie aree di ricerca legate alla biologia. Questo articolo descrive un protocollo per l'ingegneria efficiente basata su CRISPR-Cas9 e l'isolamento di cloni di singole cellule, che consente la produzione di dati fenotipici robusti e riproducibili.

Knockout genico mediato da CRISPR-Cas9 basato sull'elettroporazione in cellule THP-1 e isolamento di cloni a singola cellula

Qui presentiamo un protocollo per generare cellule chemoresistenti utilizzando un approccio di aumento della dose, seguito da uno screening basato su CRISPR/Cas9 utilizzando una libreria sgRNA focalizzata che mira ai modificatori epigenetici per identificare i regolatori della chemioresistenza acquisita. Il protocollo fornisce inoltre molteplici punti di ottimizzazione adattati a modelli cellulari chemoresistenti, offrendo un quadro solido per i ricercatori che studiano i meccanismi di...

Screening knockout a livello epigenomico basati su CRISPR-Cas9 su cellule chemoresistenti

Sono mostrati i dettagli su come mappare QTL con una mappa genetica basata su una sequenza intero di genoma può essere utilizzata per identificare un gene di resistenza alla droga in Toxoplasma gondii e come questo può essere verificato con il sistema CRISPR / Cas9 che modifica in modo efficiente un obiettivo genomico, in questo caso il Gene di resistenza alla droga.

Mapping QTL e modifica CRISPR / Cas9 per identificare un gene di resistenza alla droga in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Impara a generare linee cellulari muscolari knock-out con CRISPR/Cas9 mediato da lentivirus per studiare la funzione genica nelle miopatie. Questo metodo rapido ed economico supera i modelli animali tradizionali.

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