Osservazione profonda della fluorescenza nei germogli di riso tramite tecnologia di compensazione
27 giugno 2022
Il presente protocollo descrive una tecnica di compensazione per i germogli di riso, che sono difficili da preparare per le osservazioni strutturali interne a causa della natura dura, spessa o stratificata dei tessuti. Questo metodo facilita osservazioni continue e profonde di fluorescenza, anche in piante di riso adulte.
Questo metodo affronta le sfide nell'osservazione profonda della fluorescenza nei germogli di riso, come una limitata penetrazione tissutale della soluzione di compensazione e la risoluzione reale al microscopio confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'osservazione della struttura di tessuti molto grandi da una prospettiva macro, anche sollecita con tessuti duri e spessi, come i germogli adulti. Questo metodo si applica all'imaging profondo di tessuti duri e spessi in specie vegetali di grandi dimensioni.
Può aiutare ad accelerare la scoperta di nuovi fenomeni nella ricerca biologica vegetale. Per iniziare, tagliare le radici con cura senza danneggiare le piante e lavarle con acqua per rimuovere lo sporco. Ora, usa le pinzette per staccare le vecchie foglie esterne.
Per evitare di schiacciare le cellule, utilizzare un rasoio a taglio singolo con un movimento scorrevole per tagliare il tessuto dal germoglio, dal meristema apicale o dalla giovane pannocchia alla base. Se la posizione del meristema apicale del germoglio o della giovane pannocchia non è visibile, tagliarla più a lungo. Il germoglio di riso ha una sezione trasversale ovale.
Usa un rasoio a doppio taglio per radere un lato dell'ovale sottilmente, nella direzione del suo asse lungo. Confermare la posizione del meristema apicale del germoglio o della giovane pannocchia con la comparsa di un colore bianco-astre nel campione e tagliare il tessuto in eccesso. Mettere il campione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di soluzione fissativa.
Tagliare un pezzo di pellicola di paraffina di 2,5 centimetri quadrati e modellarlo in una palla. Ora, posiziona queste sfere sopra i campioni per evitare che fluttuino fuori dalla soluzione fissativa. Porre la provetta contenente il campione in un essiccatore.
Chiudere il coperchio dell'essiccatore e avviare la pompa per vuoto per depressurizzare lentamente l'interno dell'essiccatore fino a raggiungere una pressione di meno 0,095 megapascal. Dopo aver chiuso l'essiccatore a meno 0,095 megapascal, spegnere la pompa per vuoto e lasciarla riposare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aprire leggermente l'essiccatore e riportarlo lentamente alla pressione atmosferica.
Se il campione è fissato correttamente, affonda nella soluzione fissativa. E se non affonda, ridurre nuovamente la pressione. Rimuovere la pellicola di paraffina.
Chiudere il coperchio e tenere i tubi durante la notte a quattro gradi Celsius. Utilizzando salviette prive di lanugine, rimuovere la soluzione fissativa in eccesso dal campione e fissare il campione su un vassoio vibrante per micro-affettatrici con colla istantanea. Posizionare il campione su un vassoio con il lato piatto verso il basso che è stato rasato durante il campionamento e impostare le condizioni di rifilatura in base al campione fissato.
Regolare la posizione del campione con il pulsante di inversione o avanti e il pulsante su o giù e riempire il vassoio con acqua deionizzata fino a quando tutti i campioni sono immersi. Dopo aver riempito il vassoio, premere il pulsante di avvio e posizionare i campioni tagliati su un vetrino con una goccia di PBS. Controllare il campione contenente il sito target al microscopio stereo e trasferire il campione tagliato su una piastra multi-pozzetto con un millilitro di PBS.
Rimuovere il PBS dalla piastra multipozzetto. Aggiungere PBS fresco e lasciare riposare per un minuto. Rimuovere PBS e aggiungere il CS. Posizionare la piastra multipozzetto contenente il campione in un essiccatore e chiudere il coperchio.
Quindi avviare la pompa per vuoto per depressurizzare l'interno dell'essiccatore fino a meno 0,09 megapascal, lentamente. Dopo aver chiuso l'essiccatore a meno 0,09 megapascal, spegnere la pompa per vuoto e lasciarla riposare per un'ora a temperatura ambiente. Aprire leggermente l'essiccatore e riportarlo lentamente alla pressione atmosferica.
Versare acqua deionizzata nello spazio tra i pozzetti per evitare l'evaporazione del CS e conservare le piastre multi-pozzo a temperatura ambiente al buio per la pulizia. Quando il CS diventa verde, sostituirlo con una soluzione fresca. I campioni non tagliati sono rimasti verdi e non sono diventati trasparenti dopo tre mesi di trattamento con i campioni CS.In che sono stati staccati da tutte le foglie i nodi sono diventati bianchi dopo una settimana, anche se i nodi sono rimasti verdi.
Il campione non è diventato trasparente dopo quattro settimane. I campioni tagliati a mano sono diventati bianchi dopo una settimana di trattamento CS, ma non sono diventati trasparenti dopo quattro settimane. I campioni tagliati a 130 micrometri di spessore sono diventati traslucidi dopo una settimana di trattamento CS.
Il campione era quasi trasparente dopo due settimane. Nel nodo, la profondità osservabile dopo una settimana di trattamento CS era meno 60 micrometri e meno 90 micrometri dopo due settimane. I segnali fluorescenti sono stati osservati a una profondità di meno 80 micrometri a tre settimane e a una profondità di meno 100 micrometri a quattro settimane.
Nell'internodo, i segnali fluorescenti sono stati osservati a una profondità di meno 60 micrometri senza il trattamento CS. La profondità osservabile era di meno 90 micrometri dopo una settimana o tre settimane di trattamento CS e meno 100 micrometri dopo quattro settimane. Nelle foglie sono stati osservati segnali fluorescenti a una profondità di meno 90 micrometri senza trattamento CS, ma la luminosità era più debole rispetto ad altri tessuti.
Dopo una settimana, i segnali erano più luminosi e osservati a una profondità di meno 120 micrometri. L'espressione del fattore di trascrizione OS MASU 15 mOrange è stata osservata in giovani Pannocchia, foglia, nodo, internodo e fleurette. La chiave è trovare le migliori condizioni per le piante o i tessuti, ad esempio, periodo e pressione del vuoto, o posizione, e trattamento CS, tempistica, spessore, velocità e soluzione di colorazione appropriata.
La combinazione di temporizzazione e tecnologia di polimerizzazione consente l'osservazione temporale spaziale del modello di espressione genica e della comunicazione intercellulare in più tessuti di una singola sezione.
Panoramica
Questo studio presenta una nuova tecnica di chiarificazione per le foglie di riso che supera le difficoltà nell'osservazione della fluorescenza in profondità, in particolare nelle piante adulte con strutture tessutali resistenti. Il protocollo migliora l'immagine dei tessuti permettendo osservazioni continue della fluorescenza, facilitando una migliore comprensione delle strutture interne.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia vegetale
- Tecniche di imaging tissutale
- Microscopia a fluorescenza
Sfondo
- I metodi tradizionali presentano limitazioni nell'osservazione della struttura interna dei germogli del riso.
- Questa particolare tecnica affronta problemi legati alla penetrazione dei tessuti e alla risoluzione in microscopia confocale.
- Comprendere la struttura interna consente nuove scoperte in biologia vegetale.
Metodi Utilizzati
- Sviluppato un approccio sistematico per la preparazione delle pliche del riso, inclusi protocolli accurati di taglio e fissazione.
- Concentrato su piante adulte di riso per supportare l'imaging approfondito dei tessuti duri.
- Utilizzata la pressione sotto vuoto e soluzioni di chiarificazione per migliorare la visibilità e la profondità del segnale di fluorescenza.
Risultati principali
- Definito lo spessore di taglio ottimale e le condizioni per ottenere la trasparenza in campioni di culmi di riso.
- Dimostrata l'osservazione con successo di segnali fluorescenti a profondità specificate e in diversi periodi di tempo.
- Analizzata la relazione tra trattamento del campione e intensità del segnale fluorescente.
Conclusioni
- Questa tecnica permette una visualizzazione migliorata delle strutture interne delle piante e dell'espressione genica attraverso diversi tessuti.
- Ha implicazioni significative per il progresso della ricerca in biologia vegetale e per la comprensione di processi biologici complessi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'osservazione profonda della fluorescenza nelle piantine di riso mediante tecnologia di chiarificazione ottimizzata affronta un collo di bottiglia fondamentale nell'imaging dei tessuti vegetali, consentendo una visualizzazione tridimensionale ad alta risoluzione delle strutture interne in tessuti duri e spessi. Questa capacità aumenta la fiducia predittiva negli studi sull'espressione genica e supporta la riduzione del rischio meccanicistica nelle fasi iniziali di scoperta e validazione del bersaglio. L'approccio è rilevante per team di ricerca e sviluppo che cercano flussi di lavoro di imaging robusti e scalabili per sistemi vegetali complessi e per la ricerca traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la mappatura spazio-temporale dell'espressione genica attraverso le fasi di sviluppo nei tessuti vegetali.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli genetici mediante la visualizzazione in situ dell'espressione di reporter.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando i modelli di espressione specifici per tessuto.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara sezioni di tessuto standardizzate e trasparenti adatte per saggi quantitativi di fluorescenza.
- Migliora la riproducibilità e la confrontabilità dei risultati basati sull'imaging tra diversi campioni.
- Permette flussi di lavoro di imaging scalabili per lo screening ad alto contenuto di fenotipi vegetali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i risultati dell'imaging alla scoperta di biomarcatori traslazionali nei sistemi vegetali.
- Supporta la continuità dalla fase iniziale di scoperta fino alla validazione preclinica della funzione genica.
- Fornisce un valore predittivo per la selezione di caratteri successivi e per gli studi di miglioramento delle colture.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di chiarificazione si integra nel percorso di scoperta, dal test iniziale delle ipotesi alla validazione preclinica, sostenendo sia l'identificazione dei bersagli che la genomica funzionale nella ricerca e sviluppo vegetale.
- Biologia della Scoperta: Consente l'analisi guidata da ipotesi dell'espressione genica e dell'architettura tissutale.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per analisi comparative.
- Analisi: Offre misurazioni di fluorescenza con risoluzione in profondità per supportare la valutazione statistica delle condizioni sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega le fasi di scoperta e preclinica consentendo l'allineamento di biomarcatori in tessuti complessi.
- Riutilizzo Aziendale: Offre una capacità di imaging ampiamente applicabile a diverse specie vegetali e tipi di tessuto.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità negli studi sulla funzione genica.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione dei tessuti e l'imaging per flussi di lavoro scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avvio/cessazione e l'allocazione delle risorse nei percorsi di ricerca e sviluppo vegetale.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione dei bersagli genetici e dei tratti fenotipici adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella sezionatura dei tessuti, fissazione e microscopia a fluorescenza.
- Necessita dell'accesso a microtomi vibranti, sistemi a vuoto e piattaforme di imaging confocale.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei campioni e i protocolli di acquisizione delle immagini.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse specie vegetali o tipi di tessuto con barriere strutturali specifiche.
- L'efficienza della chiarificazione e la profondità di imaging sono influenzate dallo spessore del tessuto, dalla penetrazione della soluzione chiarificante e dai tempi di trattamento.
