Tomografia a emissione di positroni Imaging del traffico cellulare: un metodo di radiomarcatura cellulare

Questo protocollo descrive un metodo graduale per la radiomarcatura di cellule e zirconio-89-DBN e il suo tracciamento non invasivo mediante PET. Questa tecnica fornisce anche un metodo affidabile e stabile per la radiomarcatura delle cellule mediante una coniugazione covalente di zirconio-89-DBN ai mezzi primari delle proteine della superficie cellulare. I medici e gli scienziati che lavorano con le terapie cellulari per le malattie neurologiche e vari tipi di cancro troveranno questo protocollo fondamentale per comprendere la farmacocinetica delle terapie cellulari attraverso l'imaging PET non invasivo.

Il protocollo dettagliato fornisce una guida ai nuovi utenti per imparare e adottare questa tecnica di radiomarcatura. I nodi aggiuntivi inclusi nei passaggi critici aiuteranno a risolvere i problemi per un nuovo utente. Per iniziare, preparare una colonna con circa 100 milligrammi di resina idrossimato e attivarla lavando la colonna con otto millilitri di acetonitrile anidro puro seguito da un lavaggio con cinque o sei millilitri di aria.

Passare due millilitri di acido cloridrico 0,5 normale sulla colonna. Dopo aver passato un ulteriore lavaggio di cinque o sei millilitri d'aria, caricare lentamente la soluzione contenente sia zirconio-89 che ittrio naturale nella resina di idrossiammato. Lavare l'ittrio naturale non legato dalla resina di idrossimato con 20 millilitri di due acidi cloridrico normali, seguiti da 10 millilitri di acqua deionizzata.

Per eludere lo zirconio sotto forma di idrogeno fosfato di zirconio-89, aggiungere 0,5 millilitri di tampone fosfato dipotassico potassico a 1,2 molari alla colonna e lasciarlo riposare sulla colonna per 30 minuti. Aggiungere altri 1,5 millilitri di tampone molare a 1,2 per eluire lo zirconio dalla colonna. Successivamente, prelevare circa 120 microlitri di idrogeno fosfato di zirconio-89 formulato nel tampone e neutralizzare la soluzione con HEPES-KOH e carbonato di potassio per ottenere un pH di 7,528.

Aggiungere quattro microlitri di DFO-Bn-NCS da cinque millimolari appena preparati a circa 285 microlitri di fosfato di zirconio-89 neutralizzato. E miscelare la soluzione mediante pipettaggio. Dopo aver isolato lo zirconio dall'ittrio, aggiungere 0,5 millilitri di acido ossalico molare alla colonna e lasciarlo riposare sulla colonna per un minuto per eluire lo zirconio sotto forma di ossalato di zirconio-89.

Aggiungere altri 2,5 millilitri di acido ossalico molare alla colonna. Per convertire l'ossalato di zirconio-89 in cloruro di zirconio-89, lavare la colonna a scambio anionico con sei millilitri di acetonitrile, seguita da un lavaggio con cinque o sei millilitri di aria. Quindi, lavare la colonna con 10 millilitri di soluzione fisiologica seguita da un altro getto d'aria.

Caricare lentamente la soluzione contenente ossalato di zirconio-89 sulla colonna a scambio anionico attivato prima di rilavarla con aria. Quindi, lavare la colonna con 50 millilitri di acqua deionizzata per rimuovere lo ione ossalato non legato. Per eludere lo zirconio sotto forma di cloruro di zirconio-89, aggiungere 0,1 millilitri di un normale acido cloridrico alla colonna e lasciarlo riposare sulla colonna per un minuto.

Eluire lo zirconio dalla colonna con altri 0,4 millilitri di un normale acido cloridrico. Asciugare il cloruro di zirconio-89 eluso in una fiala a forma di V mettendolo in un blocco riscaldante a 65 gradi Celsius sotto un flusso costante di azoto gassoso per 10-30 minuti, quindi ricostituire il cloruro di zirconio-89 essiccato in acqua. Preparare 500 microlitri di sospensione cellulare con circa 6 milioni di cellule in 500 microlitri di HBSS tamponato con HEPES in una micro provetta da centrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere circa 100 microlitri di zirconio-89-DBN formulato.

Miscelare lo zirconio-89-DBN e la sospensione cellulare pipettando delicatamente la soluzione su e giù con una micropipetta. Incubare le cellule e la miscela di zirconio-89-DBN su uno shaker a circa 550 giri/min a 25-37 gradi Celsius per 30-45 minuti per la marcatura cellulare. Eseguire TLC radioattivo sulla reazione di radiomarcatura cellulare utilizzando un solvente TLC radioattivo appena preparato.

Calcolare la percentuale di radioattività a Rf uguale a 0,01 a 0,02 utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo. In una provetta da microcentrifuga separata da 1,5 millilitri, miscelare circa 100 microlitri di zirconio-89-DBN formulato con circa 500 microlitri di HBSS tamponato HEPES per utilizzarlo come controllo senza cellule per la correzione dello sfondo. Calcolare la percentuale di radioattività a Rf uguale a 0,01 a 0,02 utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo, quindi calcolare la radiomarcatura efficace delle cellule sottraendo le due percentuali di radioattività calcolate.

Dopo aver confermato il completamento della radiomarcatura, aggiungere 600 microlitri di terreno completo adatto alla cella refrigerata per eseguire l'estinzione della reazione di radiomarcatura. Centrifugare le celle a 96 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. E scartare il surnatante.

Risospendere delicatamente le cellule pellettate in 500 microlitri di terreno refrigerato pipettando il terreno su e giù con una micropipetta. Centrifugare le cellule a 96G per 10 minuti a quattro gradi Celsius ed eliminare il surnatante. Successivamente, calcolare l'efficienza finale della radiomarcatura dopo tutti i lavaggi utilizzando l'equazione mostrata sullo schermo.

Per garantire la qualità delle cellule radiomarcate, ispezionare visivamente la sospensione finale delle cellule radiomarcate e, se non sono presenti grumi, eseguire un test di vitalità di esclusione del blu di tripano utilizzando una soluzione di blu di tripano allo 0,4% preparata in PBS entro un'ora dalla radiomarcatura e dalle fasi di lavaggio. L'efficienza di chelazione di DFO-Bn-NCS per lo zirconio-89 utilizzando l'idrogeno fosfato di zirconio-89 e il cloruro di zirconio-89 sono diverse come misurato dal TLC radioattivo. La stabilità di varie cellule radiomarcate con zirconio-89 nell'arco di sette giorni è mostrata qui.

La ritenzione della radioattività dello zirconio-89 da parte delle cellule radiomarcate è risultata stabile in tutte le cellule studiate, con un efflusso trascurabile osservato nei sette giorni successivi alla marcatura. In questa tabella sono mostrate le efficienze di radiomarcatura cellulare in diversi tipi di cellule con zirconio-89-DBN. L'efficienza di radiomarcatura cellulare varia dal 20 al 50% come resa non corretta osservata nel pellet cellulare radiomarcato dopo il lavaggio.

La fase più critica di questo protocollo è l'aggiunta di DFO-Bn-NCS alla miscela chelante e la valutazione della qualità delle cellule radiomarcate. L'applicazione di questa tecnica aiuterà a comprendere la farmacocinetica delle terapie cellulari. Solleverebbe anche interrogativi su qualsiasi necessità clinica di alterare il profilo di clearance delle terapie cellulari.