Un protocollo preanalitico standardizzato per biopsia liquida per applicazioni di DNA libero da circolazione a valle

Si tratta di un protocollo standard per l'elaborazione e la conservazione di campioni di sangue per applicazioni di biopsia liquida a valle basate su DNA libero circolante. Questo è il primo protocollo standard pubblicato, anche se la tecnica è in uso da diversi anni. È facile da seguire con le attrezzature standard disponibili nella maggior parte dei laboratori traslazionali o scientifici.

Il protocollo può essere eseguito da tutto il personale di laboratorio. Il protocollo aiuta a standardizzare il modo in cui raccogliamo e conserviamo i campioni, il che alla fine avrà un impatto sulla clinica e ridurrà la variabilità tra i diversi centri che eseguono analisi a valle uguali o simili in cui la precisione è della massima importanza. Questo metodo è particolarmente utile nella ricerca oncologica e anche nelle applicazioni cliniche.

Tuttavia, può anche essere applicato in altre malattie non tumorali in cui viene utilizzata anche la biopsia liquida. Dopo che il campione di sangue è stato centrifugato, sapere quanto plasma o siero rimuovere può essere difficile, ma seguire queste linee guida specifiche aiuterà in questo. Il resto del protocollo è molto facile da seguire con un'esperienza limitata in laboratorio.

A dimostrare la procedura sarà Jorge, un tecnico del nostro laboratorio. Per iniziare, centrifugare la provetta contenente sangue fresco a temperatura ambiente per 10 minuti a 1600 volte g, con la massima rottura applicata. Rimuovere con cautela il tubo dalla centrifuga.

La fase superiore del surnatante sierico apparirà chiara e giallastra. Controllare se il campione mostra segni di emolisi e registrare la presenza di emolisi quando appropriato. In un armadio di biosicurezza di classe II, trasferire il siero in provette di raccolta come aliquote da 250 microlitri.

Le aliquote devono essere etichettate correttamente. Congelare immediatamente il siero in posizione verticale nella scatola di conservazione a meno 80 gradi Celsius e registrare il tempo di conservazione del campione. Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di quattro ore.

Centrifugare il tubo EDTA a temperatura ambiente per 10 minuti a 1600 volte g, con la massima rottura applicata. Dopo la centrifugazione, il surnatante plasmatico apparirà chiaro e giallastro. Controllare se il campione mostra segni di emolisi e trasferire il plasma in una provetta da centrifuga da 15 millilitri senza disturbare lo strato cellulare utilizzando una pipetta sierologica monouso.

Lasciare un piccolo volume residuo di plasma sopra lo strato cellulare a circa cinque millimetri. Se si osserva emolisi, scartare il campione per ulteriori analisi. Centrifugare il plasma e una provetta da centrifuga da 15 millilitri per rimuovere eventuali cellule del sangue intatte residue riportate dalla prima fase di centrifugazione.

Rimuovere con cautela il tubo dalla centrifuga, non il pellet cellulare sul fondo del tubo, e trasferire da uno a quattro millilitri di plasma a bios criogenico in polipropilene da uno a quattro millilitri o Eppendorfs utilizzando una pipetta sierologica monouso. Un volume residuo di plasma deve essere lasciato sul fondo della provetta per evitare di contaminare il plasma con le cellule del sangue. Congelare immediatamente il plasma in posizione verticale nella scatola di stoccaggio a meno 80 gradi Celsius e registrare il tempo di conservazione del campione.

Verificare che i campioni siano etichettati correttamente e siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di quattro ore. Raccogliere lo strato cellulare utilizzando un P1000 e una punta filtrata e trasferirlo in un tubo da due millilitri. Congelare immediatamente e conservare a meno 80 gradi Celsius.

Un esempio di estrazione di cfDNA di alta qualità che può essere utilizzato per applicazioni a valle è mostrato qui, mentre questa immagine grafica rappresenta un esempio di un campione non adatto con un alto livello di contaminazione genomica. La frazione plasmatica o sierica deve essere di colore giallo. Questo può variare a seconda del singolo campione.

I campioni con emolisi devono essere scartati. Fare attenzione a non rimuovere alcun pellet cellulare quando si rimuove la frazione plasmatica. Questo protocollo può essere utilizzato anche per altre applicazioni basate su acidi nucleici e proteine, come la rilevazione di RNA o proteine non codificanti in campioni di siero e plasma utilizzando tecniche di rilevamento immunologico.

Questa è una tecnica molto standard utilizzata in molti laboratori. Questo protocollo aiuta i ricercatori a standardizzare il modo in cui eseguiamo le nostre analisi in quanto questo è un aspetto cruciale, necessario per le future applicazioni cliniche.