Selezione in vitro di aptameri per differenziare i virus infettivi da quelli non infettivi

Questo protocollo descrive come selezionare aptameri del DNA in grado di distinguere i virus infettivi dai virus non infettivi al fine di ottenere molecole sensibili in grado di informare l'infettività di campioni clinici o ambientali. Questa tecnica può essere applicata per ottenere aptameri selettivi per molti altri virus, compresi i virus emergenti, perché non richiede una conoscenza preliminare delle strutture o delle sequenze del virus. Questa tecnica consente lo sviluppo di sensori aptameri per la diagnostica clinica e il monitoraggio ambientale dei virus infettivi per rilevare se qualcuno è contagioso o se un metodo di disinfezione ambientale funziona come previsto.

La selezione può essere un processo difficile, soprattutto per coloro che sono nuovi ad esso. È importante ottimizzare le condizioni della PCR e monitorare l'avanzamento della selezione con qPCR. A dimostrare la procedura sarà Marcos Gramajo, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per iniziare, progetta la libreria iniziale a singolo filamento o SS-DNA e i primer. Ottenere gli oligo di DNA da fonti commerciali con la purificazione di desalinizzazione standard. Purificare la libreria e i primer SS-DNA sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante al 10% seguita da precipitazione di etanolo.

Quindi, ottenere una soluzione madre di virus infettivi e non infettivi o prepararli come descritto nel manoscritto di testo. Per la denaturazione della libreria SS-DNA, mescolare 10 microlitri di 100 micromolari della libreria SS-DNA con 240 microlitri di tampone SELEX. Riscaldare la miscela a 95 gradi Celsius per 15 minuti in un bagno asciutto, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti.

Mescolare 250 microlitri di libreria SS-DNA nel tampone SELEX con 50 microlitri di virus infettivo per una selezione positiva. Incubare per due ore a temperatura ambiente. Quindi aggiungere 400 microlitri di una sequenza T20 millimolare a un filtro da 0,5 millilitri per bloccare i siti non specifici.

Incubare i filtri per 30 minuti. Centrifugare il filtro a 14.000 G per 10 minuti per rimuovere la soluzione T20. Quindi lavare il filtro tre volte con tampone SELEX per rimuovere le sequenze T20 in eccesso.

Quindi, aggiungere la miscela di virus infettivi della libreria SS-DNA al filtro da 100 kilodalton bloccato e alla centrifuga per lavare le sequenze non legate. Lavare il filtro tre volte aggiungendo 400 microlitri di tampone SELEX e centrifugazione. Mantenere la frazione nel filtro ed eliminare il flusso passante.

Per eluire le sequenze legate, cambiare il tubo di raccolta del filtro centrifugo e aggiungere 300 microlitri di tampone SELEX contenente otto molari di urea al filtro. Riscaldare il filtro a 95 gradi Celsius per 15 minuti, quindi centrifugare per raccogliere il flusso contenente le sequenze eluite. Una volta fatto, lavare i materiali con il 10% di candeggina.

Quindi, aggiungere la soluzione di virus infettivo SS-DNA raccolta nella fase precedente a un filtro da 10 kilodalton bloccato, centrifugare a 14.000 G per 15 minuti e scartare il flusso attraverso. Lavare il filtro tre volte con 300 microlitri di tampone SELEX per rimuovere l'urea mediante centrifugazione ed eliminare il flusso continuo. Recuperare la soluzione nel filtro capovolgendola in un tubo di raccolta pulito e centrifugando per cinque minuti.

Misurare il volume finale della soluzione recuperata utilizzando una pipetta ed etichettarla come campione Round 1A. Prendi il 90% del campione del Round 1A come modello nel primo round ed esegui la PCR utilizzando condizioni ottimizzate. Per recuperare SS-DNA utilizzando sfere magnetiche modificate con streptavidina o MB, dividere il prodotto in aliquote da 50 microlitri e aggiungerle a provette da microcentrifuga contenenti 50 microlitri MB. Incubare il tubo per 30 minuti con lieve agitazione a temperatura ambiente.

Quindi posizionare il tubo sul rack magnetico per isolare il MB e rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Lavare il MB due volte aggiungendo 200 microlitri di legatura e tampone di lavaggio al tubo. Quindi rimuovere il tubo dal rack magnetico e picchiettarlo prima di risospendere il MB in una soluzione omogenea mediante pipettaggio.

Posizionare nuovamente il tubo sul rack magnetico e rimuovere il surnatante. Dopo il secondo lavaggio, risospendere il MB in 100 microlitri di tampone SELEX e riscaldare la soluzione a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Posizionare immediatamente il tubo nel rack magnetico e raccogliere il surnatante contenente il pool di SS-DNA.

Ripetere questo passaggio di recupero aggiungendo 50 microlitri di tampone SELEX. Misurare il volume finale della frazione recuperata ed etichettarla come Round 1X. Per la denaturazione del pool di SS-DNA, prelevare il 60% del campione Round 1X e mescolarlo con 50 microlitri di tampone SELEX.

Riscaldare il campione in un bagno asciutto, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi, mescolare il pool di SS-DNA denaturato nel tampone SELEX con 50 microlitri di ciascun virus come fase di controselezione e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver bloccato i siti non specifici nei filtri centrifughi, aggiungere il pool di SS-DNA denaturato della miscela incubato con una soluzione virale a un filtro bloccato da 100 kilodalton.

Centrifugare il filtro a 14.000 G per 10 minuti e raccogliere il flusso attraverso. Prendi 300 microlitri di frazione e mescola con 50 microlitri di virus infettivo contenente 100 milioni di copie per millilitro. Incubare per due ore a temperatura ambiente.

Preparare una master mix qPCR standard e diluizioni della libreria SS-DNA purificata come descritto nel testo. Eseguire la qPCR per determinare il ciclo di soglia. Dopo la corsa, utilizzare una curva standard per quantificare la quantità di SS-DNA nel Round 1A e nel Round 1X.

Quindi calcolare la resa di eluizione come quantità di DNA legato divisa per la quantità iniziale di DNA e tracciare la resa di eluizione rispetto al numero tondo. Infine, tracciate le curve di fusione per diversi arrotondamenti. Per un sequenziamento a throughput elevato, selezionare un kit appropriato disponibile in commercio.

Preparare più pool di cicli di selezione che rappresentano l'arricchimento alto, medio e basso, nonché il pool finale utilizzando una coppia diversa di indici negli adattatori per ogni pool. Quindi inviare la libreria finale preparata alla struttura di sequenziamento. Per l'analisi di sequenziamento, le sequenze sono state demultiplexate dalla funzione di sequenziamento.

Rimuovere gli adattatori di sequenziazione e i primer di selezione utilizzando il programma a riga di comando Cutadapt. Quindi utilizzare il programma FASTX-Toolkit per rimuovere le sequenze di bassa qualità. Quindi unire i file di sequenza nella direzione inversa con quelli nella direzione di avanzamento utilizzando la funzione complementare di FASTX_reverse_ FASTX-Toolkit sui file di direzione inversa.

Quindi utilizzare il programma CAT integrato per unire i file in un singolo file. Utilizzare il toolkit di analisi FASTAptamer per analizzare l'arricchimento delle sequenze in diversi pool di selezione. Innanzitutto, utilizzare le funzioni FASTAptamer count e FASTAptamer cluster per raggruppare sequenze simili in cluster.

Successivamente, utilizzare la funzione FASTAptamer enrich per ottenere informazioni sull'arricchimento di sequenze e cluster. Identificare le sequenze di aptameri candidati dalle informazioni di arricchimento ottenute attraverso l'analisi delle sequenze. Selezionare diverse sequenze di aptameri ed eseguire lo screening iniziale utilizzando un test di legame.

In questa analisi, la qPCR è stata utilizzata per monitorare i progressi di SELEX degli aptameri infettivi specifici di SARS-CoV-2. La resa di eluizione è inizialmente aumentata ad ogni round di SELEX e livellata ai round otto e nove. Confrontando le curve di fusione, è stato osservato uno spostamento dal picco ad alta temperatura di fusione da 77 a 79 gradi Celsius.

Inoltre, negli ultimi due round, è stato osservato un picco a bassa temperatura di fusione. Viene mostrata l'abbondanza relativa di letture per milione per il SARS2 AR10 sequenziato ottenuto in turni di selezione consecutivi. La struttura prevista di SARS2 AR10 ha mostrato una struttura secondaria strutturata contenente una regione dell'anello staminale che potrebbe essere coinvolta nel riconoscimento del virus.

Una volta ottenuti, gli aptameri possono essere incorporati nell'ottica elettrica, un altro tipo di sensori, per sviluppare portali e test rapidi di rilevamento dei virus in grado di informare l'infettività del virus. Prevediamo che sia possibile ottenere aptameri specifici per diverse varianti o stereotipi di virus, rendendo possibile un rapido monitoraggio delle varianti che sono la più grande minaccia per la società.