Imaging delle cellule B CD19⁺ in un modello murino sperimentale di encefalomielite autoimmune utilizzando la tomografia a emissione di positroni

Questa tecnica utilizza l'imaging PET per chiarire la distribuzione e la dinamica in vivo delle cellule B nel sistema nervoso centrale. Il nostro approccio è utile per lo studio delle malattie neurologiche, in cui il midollo spinale interessato rende l'analisi più impegnativa. Quindi ci sono un paio di vantaggi principali nella nostra tecnica.

Innanzitutto, abbiamo creato un nuovo strumento per tracciare un biomarcatore di cellule pan B che ci consente di catturare una serie di sottoinsiemi di cellule B e visualizzarli in vivo. In secondo luogo, il nostro metodo di analisi del midollo spinale consente una quantificazione altamente accurata e riproducibile dei segnali PET in questa regione. La cosa grandiosa della nostra tecnica è che è indipendente dalla malattia.

Può essere utilizzato dall'imaging PET preclinico a quello clinico in qualsiasi scenario in cui le cellule B e/o il midollo spinale sono di interesse. Da 18 a 24 ore dopo la radiomarcatura e l'iniezione dell'anticorpo nel topo, preparare il topo per la scansione applicando il gel per gli occhi sugli occhi. Assicurarsi che il letto di scansione a quattro mouse sia dotato di un cuscinetto riscaldante con isoflurano impostato dall'1.5 al 2%Posizionare il mouse in posizione supina sul piano di scansione e tirare delicatamente la coda del mouse per raddrizzare la colonna vertebrale.

Una volta che il topo è in posizione supina, fissarlo saldamente con del nastro morbido per microscopio sulla testa e sulla pancia per ridurre al minimo il movimento della respirazione. Registrare la posizione di scansione di ciascun mouse in un taccuino di laboratorio. Dopo aver messo in sicurezza il primo gruppo, chiudere il letto e controllare il posizionamento del letto eseguendo una TAC.

Fare clic su Campo visivo centrale TC e, una volta che il letto è in posizione, eseguire la scansione di prova TC per assicurarsi che il posizionamento sia corretto. Ripetere fino a quando la posizione del letto non è soddisfacente. Posizionare un piccolo nastro adesivo bianco sul piano dello scanner per contrassegnare il corretto posizionamento del letto per il resto dello studio.

Apri il menu Motion Controller e fai clic su PET Center Field of View per spostare i mouse nell'anello PET. Una volta che il letto si trova nell'anello PET, avviare la sequenza di scansione facendo clic su Esegui, attendere che lo scanner completi automaticamente la scansione PET e spostarsi dall'anello PET alla TC per l'acquisizione TC. Poiché l'encefalomielite autoimmune sperimentale, o EAE, i topi hanno una curvatura pronunciata della colonna vertebrale a causa della progressione della malattia, la scansione mentre sono sulla schiena aiuta a raddrizzare la colonna vertebrale.

Fai un'incisione lungo il lato dorsale dell'animale e rimuovi la pelle e il pelo per esporre la colonna vertebrale. Tagliare lungo tre piani trasversali attraverso la colonna vertebrale all'altezza del collo, direttamente sotto la gabbia toracica e nella parte superiore del bacino per separare la regione lombare da quella cervicale e toracica. Rimuovere con cautela la colonna vertebrale segmentata per ottenere due pezzi, lombare e cervicale toracica.

Quindi isolare la colonna vertebrale lombare tagliando con cura la colonna vertebrale dall'estremità pelvica fino a quando il midollo spinale lombare non è visibile. Per espellere il midollo spinale lombare, utilizzare una siringa a punta mobile riempita di PBS e creare un sigillo tra la siringa e la colonna vertebrale utilizzando il pollice e l'indice. Spingere delicatamente il PBS attraverso la siringa per espellere il midollo spinale su un tampone assorbente e ripetere per il midollo spinale toracico cervicale inserendo la siringa dal lato cervicale.

Posizionare i tessuti del midollo spinale in una provetta per il conteggio gamma. Registrare il peso secco e aggiungere PBS per assicurarsi che il tessuto sia sul fondo della provetta per evitare che si secchi. Metti il tubo sul ghiaccio fino al momento del conteggio.

Per iniziare l'analisi delle regioni di interesse nel midollo spinale, aprire lo strumento Regione di interesse 3D dal menu di navigazione. Sotto l'intestazione Regioni di interesse, utilizzare il segno più nella parte inferiore del menu per creare sei aree di interesse, regione lombare di interesse, regione toracica cervicale di interesse, scheletro lombare, scheletro toracico, midollo spinale lombare, midollo spinale toracico. Per evitare interferenze visive dal segnale PET, fare clic su F3 per disattivare il PET.

Vai nella parte superiore dell'operatore dello strumento Regione di interesse 3D e fai clic sul punto pieno a destra del simbolo del cursore per aprire il menu Modalità disegno 3D ed Erode/Dilata. Selezionare Sfera e modificare la dimensione a 20 pixel. Allo stesso modo, imposta dilatare a più cinque.

Prima di procedere ulteriormente, vai in fondo al menu e assicurati che sia selezionata la regione lombare di interesse. Sulla TC, trova la vertebra L6 della colonna vertebrale. Partendo da una vertebra sopra L6, disegna una regione lombare approssimativa di interesse sopra le cinque vertebre sopra i fianchi.

Quindi passare alla regione toracica cervicale di interesse e tracciare il resto della colonna vertebrale fino alla base del cranio. Dopo aver disegnato le regioni di interesse generalizzate, passare alla parte superiore dell'operatore e selezionare il menu Algoritmi di segmentazione. Dal menu a discesa, seleziona Otsu Thresholding, quindi seleziona la regione lombare di interesse per l'input e assicurati che lo scheletro lombare sia scelto nella parte inferiore del menu.

Nel menu a discesa accanto a Immagine, assicurati che sia selezionata la TAC, indicata qui dal numero zero. Fare clic su Applica e ripetere la procedura per la regione toracica cervicale di interesse e lo scheletro toracico. Dopo aver utilizzato Otsu Thresholding per creare le regioni di scheletro di interesse, tornare al menu di navigazione ed eliminare l'area di interesse, oppure selezionare la colonna H per entrambe le regioni di interesse lombare e toracica cervicale per nasconderle.

Selezionare la colonna I per entrambe le regioni scheletriche di interesse, in modo che non possano essere modificate. Infine, torna all'inizio dell'operatore dello strumento Area di interesse 3D e vai al menu Disegno 3D per disegnare le regioni del midollo spinale di interesse. Seleziona di nuovo lo strumento Sfera e traccia il midollo spinale all'interno dello scheletro sia per la parte lombare che per quella toracica, assicurandoti che la regione di interesse corretta sia selezionata nella parte inferiore del menu.

Per cancellare una regione di interesse, fare clic su Comando/Ctrl e disegnare sulla parte da cancellare. Controllare la regione di interesse del midollo spinale da tutti e tre i piani per assicurarsi che nessuna regione di interesse sia disegnata al di fuori della colonna vertebrale. Se il segnale PET è stato disattivato, premere F3 dopo aver disegnato le regioni del midollo spinale di interesse per riattivare il PET, oppure selezionare il controller visivo e fare clic sulla barra PET.

Torna al menu di navigazione. Fare clic sull'icona Griglia per visualizzare la tabella. Copia la tabella nel software per fogli di calcolo e salva il file.

L'imaging PET ha rivelato un elevato legame del radiotracciante nel cervello e nel midollo spinale toracico dei topi EAE rispetto ai topi naïve. Il conteggio gamma ex vivo ha mostrato un aumento del legame nei segmenti spinali toracici lombari e cervicali e nel cervello dei topi EAE rispetto ai topi naïve. Le immagini di autoradiografia ex vivo hanno mostrato un aumento del legame del radiotracciante nelle sezioni cerebrali sagittali, in particolare nel tronco encefalico, nel cervelletto e nei ventricoli dei topi EAE rispetto ai topi naïve.

Allo stesso modo, è stato osservato un aumento del legame con il radiotracciante in entrambi i segmenti del midollo spinale cervicale, toracico e lombare dei topi EAE rispetto al midollo spinale naïve. Dopo l'imaging PET e il conteggio gamma, possiamo studiare la relazione tra il segnale PET e il bersaglio di interesse attraverso tecniche di biologia molecolare, come la citometria a flusso e l'immunoistochimica. La nostra tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per porre domande sul ruolo in vivo delle cellule B in più aree patologiche, tra cui ictus, sclerosi multipla, altre malattie autoimmuni e cancro.