Name: Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Scopri l'isolamento e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane mediante centrifugazione differenziale. Questo metodo riproducibile supporta applicazioni terapeutiche e la ricerca sulle comunicazioni cellulari.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (32000974, 81930025 e 82170988) e della China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 e BX20190380). Siamo grati per l'assistenza del National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU) e del Analytical and Testing Central Laboratory of Military Medical Innovation Center dell'Air Force Medical University.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Quarta Università medica militare ed eseguite in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Sono stati utilizzati topi C57Bl/6 di otto settimane (nessuna preferenza per femmine o maschi). Le MSC derivate dal cordone ombelicale umano crioconservate (UCMSC), utilizzate per il presente studio, sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'uso di cellule umane è stato approvato dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare.
1. Coltura di cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs)
<ol><li>Preparare gli accessori e le soluzioni necessarie per il lavoro sperimentale, tra cui pipette, punte per pipette, capsula di Petri da 10 cm, apparecchiature termostatiche (bagno d'acqua), guanti di gomma, alcool al 75%, terreno di coltura (incubato a 37 °C), siero bovino fatale (FBS) e soluzione 100x di penicillina-streptomicina (P/S) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare il mezzo essenziale minimo alfa (α-MEM) disponibile in commercio integrando con 20% FBS e 1% P/S. NOTA: Diluire tutte le soluzioni utilizzate per l'isolamento e l'analisi dei veicoli elettrici in acqua filtrata ultrapura realizzata dal sistema di purificazione dell'acqua filtrata ultrapura (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Recuperare le MSC derivate dal cordone ombelicale umano crioconservate (UCMSC) dall'azoto liquido fondendole in un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Trasferire rapidamente e delicatamente la sospensione di cellule fuse in un tubo da 15 mL con 5 mL di terreno di coltura (fase 1.2). Centrifugare a 4 °C, 500 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta sterile e trattenere il precipitato cellulare. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura nella provetta della centrifuga e risospendere delicatamente le cellule.</li>
	<li>Seminare le cellule in una capsula di Petri da 10 cm e aggiungere 8 ml di terreno di coltura per un totale di 10 ml.</li>
	<li>Coltura di MSC a 37 °C in 5% di CO2 nell'incubatore cellulare.</li>
</ol>2. Centrifugazione differenziale per l'isolamento di Exos e MV
<ol><li>Quando le MSC raggiungono il >90% di confluenza, sostituire il terreno di coltura con α-MEM integrato con il 20% di FBS impoverito di EV e l'1% di P/S per 8 ml di ogni piatto. NOTA: Centrifugare FBS a 4 °C, 1,50.000 x g durante la notte per rimuovere EV e altre impurità.</li>
	<li>Dopo 48 ore di coltura, raccogliere il terreno di coltura (fase 2.1) in provette da centrifuga da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare il terreno di coltura MSC a 4 °C, 800 x g per 10 min.</li>
	<li>Rimuovere i frammenti cellulari e i detriti cellulari trasferendo il surnatante in tubi conici puliti da 1,5 ml. NOTA: L'utilizzo di tubi conici da 1,5 mL è necessario per aumentare la resa EV.</li>
	<li>Centrifugare il surnatante a 4 °C, 16.000 x g per 30 min. Il pellet è MV. MV da ogni piatto di cellule sono stati risospesi con 50 μL di PBS.</li>
	<li>Trasferire il surnatante ottenuto per centrifugazione al punto 2.5 mediante pipetta in provette da ultracentrifuga pulita. Centrifugare a 1,50.000 x g per 2 h a 4 °C.</li>
	<li>Scartare il surnatante e raccogliere il residuo, che è Exos. Risospendere Exos da sette piatti di cellule in 50 μL di PBS. NOTA: gli UCMSC di sesto passaggio vengono utilizzati per l'isolamento EV. Per ottenere abbastanza MV ed Exos per uso sperimentale, di solito sono necessari 7-8 piatti di cellule coltivate. I campioni EV vengono utilizzati immediatamente per le successive fasi di caratterizzazione o per applicazioni terapeutiche, che è meglio non conservare. ATTENZIONE: Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei veicoli elettrici, ed è meglio conservare i veicoli elettrici a 4 °C a breve termine e non a -80 °C.</li>
</ol>3. Rilevamento del numero di particelle e distribuzione dimensionale dei veicoli elettrici da MSC
NOTA: Per la valutazione della distribuzione dimensionale, l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) viene eseguita da un analizzatore di tracciamento delle nanoparticelle disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).
<ol><li>Diluire 1 μL di EV (dalla fase 2.5 e dalla fase 2.7) in 1.499 μL di PBS e mescolare abbastanza in una provetta da 15 ml.</li>
	<li>Utilizzare l'analizzatore di tracciamento seguendo le istruzioni del produttore. Innanzitutto, avviare il software compatibile (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Riempire la cella campione con acqua distillata, quindi consentire allo strumento di avviare il controllo della cella.</li>
	<li>Calibrare lo strumento con una soluzione standard preparata. Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia compreso tra 50 e 400 (preferibilmente circa 200). Fare clic su OK. NOTA: Preparare la soluzione standard ricostituendo 1 μL di soluzione di taratura (vedere Tabella dei materiali) in 1 mL di acqua distillata per generare una soluzione primaria, quindi prelevare 100 μL della soluzione primaria e aggiungere 25 mL di acqua distillata per preparare una soluzione standard (1:250.000). Conservare questo reagente di lavoro a 4 °C per una settimana.</li>
	<li>Risciacquare la cella del campione con 5 ml di acqua distillata.</li>
	<li>Prima dell'analisi del campione, lavare il canale con 1 mL di acqua distillata. Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia inferiore a 10.</li>
	<li>Iniettare 1 mL del campione EV preparato al punto 3.1. Eseguire il test delle vescicole secondo le istruzioni operative dello strumento. ATTENZIONE: Il campione e l'acqua distillata vengono iniettati con una siringa da 1 mL ad una velocità costante di 0,5 mL/s sotto attento controllo manuale.</li>
</ol>4. Caratterizzazione della morfologia delle EV mediante microscopio elettronico a trasmissione (TEM)
<ol><li>Diluire 1 μL di EV dalla fase 2.7 in 199 μL di PBS e mescolare abbastanza. Aggiungere 20 μL di gocce di sospensione EV alla maglia quadrata formvar/rivestita di carbonio (vedere Tabella dei materiali) e lasciarla riposare per 3 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il liquido in eccesso con una piccola carta da filtro e lasciarlo rimanere per 15 secondi per asciugare leggermente la superficie.</li>
	<li>Colorare negativamente i campioni di EV con goccioline di acido fosfotungstico all'1,5% per 40 s.</li>
	<li>Rimuovere l'acido fosfotungstico in eccesso e lasciarlo riposare per 15 s per asciugare leggermente la superficie.</li>
	<li>Inserire il campione contenente la maglia quadrata formvar/rivestita di carbonio in un piatto pulito coperto con carta da filtro. Osserva e cattura immagini con un microscopio elettronico a trasmissione. NOTA: In questo processo, Exos sono presi come esempio.</li>
</ol>5. Etichettatura dei veicoli elettrici derivati dalle MSC
<ol><li>Dopo l'estrazione EVs (fase 2.5), risospendere con 250 μL di PBS in un tubo conico da 1,5 ml.</li>
	<li>Utilizzare un altro tubo conico da 1,5 ml per preparare la soluzione di lavoro del colorante PKH26; utilizzare 1 μL di reagente di etichettatura PKH26 diluito con 250 μL di diluente C (un componente del kit di etichettatura EV disponibile in commercio utilizzato per il presente studio, vedere Tabella dei materiali). NOTA: preparare la soluzione di lavoro immediatamente prima dell'uso. ATTENZIONE: Un eccessivo colorante PKH26 o etichettatura senza pre-diluizione rischia di danneggiare i veicoli elettrici.</li>
	<li>Mescolare i veicoli elettrici risospesi con la soluzione di lavoro. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi aggiungere 500 μL di FBS impoverito di EV per fermare la reazione.</li>
	<li>Per le MV, centrifugare a 4 °C, 16.000 x g per 30 minuti ed eliminare il surnatante con una pipetta. Aggiungere 1 mL di PBS per risciacquare il residuo.</li>
	<li>Centrifugare a 4 °C, 16.000 x g per 30 minuti ed eliminare il surnatante per rimuovere il colorante non legato.</li>
	<li>Risospendere il residuo con 200 μL di PBS. Far cadere 20 μL di sospensione sul vetrino e osservarlo al microscopio a fluorescenza. NOTA: in questo processo, gli MV vengono presi come esempio.</li>
</ol>6. Trapianto locale e iniezione sistemica di MSC-EV
NOTA: per le seguenti procedure, posizionare i veicoli elettrici sul ghiaccio prima dell'iniezione.
<ol><li>Eseguire il trapianto locale seguendo i passaggi seguenti.<ol><li>Anestetizzare i topi con isoflurano al 4% (vol/vol). Mantenere l'anestesia all'1% -3% di isoflurano durante la procedura.</li>
		<li>Prima dell'intervento chirurgico, somministrare 5 mg / kg di carprofen (IP) per l'analgesia per ridurre al minimo il dolore post-procedurale.</li>
		<li>Prima dell'escissione della ferita, radersi i peli dorsali e sterilizzare la superficie dorsale applicando 3 cicli alternati di 10% di iodio povidone e etanolo al 75%.</li>
		<li>Utilizzando un punzone bioptico (vedi Tabella dei materiali), creare una ferita a tutto spessore di 1 cm di diametro sulla pelle dorsale.</li>
		<li>Risospendere le EV derivate da MSC da due piatti in 100 μL di PBS e somministrare l'iniezione nello strato sottocutaneo del letto della ferita, attorno a ciascuna ferita con quattro siti. NOTA: viene iniettata una media di 100 μg di EV per topo (EV da due capsule di cellule da 10 cm). Sono necessari dieci piatti da 10 cm di MSC per produrre abbastanza EV per impostare un esperimento di n = 5 in un modello murino.</li>
		<li>Dopo il trattamento, avvolgere i topi con una garza sterile e posizionarli su tamponi termoisolanti (vedi Tabella dei materiali) fino al loro risveglio.</li>
		<li>Assicurarsi che i topi non siano lasciati incustoditi fino a quando non hanno riacquistato sufficiente coscienza. Non restituire i topi alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.</li>
		<li>Somministrare ulteriori dosi di analgesia il giorno 2 e il giorno 3 post-operatorio, se necessario.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire l'iniezione sistemica.<ol><li>Risospendere le EV derivate da MSC in 200 μL di PBS e quindi miscelare con soluzione di eparina in un rapporto di volume 10: 1.</li>
		<li>Posizionare i topi nel sistema di imaging della vena caudale (vedere Tabella dei materiali). Premere l'interruttore per sollevare la leva.</li>
		<li>Disinfettare la vena caudale usando un tampone imbevuto di alcool prima dell'iniezione endovenosa. Quindi, iniettare sistematicamente i topi con la sospensione preparata al punto 6.2.1 attraverso la vena caudale. La procedura è aiutata da un illustratore di vene della coda. NOTA: Iniettare la sospensione EV immediatamente dopo la miscelazione con eparina. Viene iniettata una media di 100 μg EV per topo (EV da due capsule di cellule da 10 cm). Sono necessari dieci piatti da 10 cm di MSC per produrre abbastanza EV per impostare un esperimento di n = 5 in un modello murino. ATTENZIONE: L'iniezione della vena della coda di topo è solitamente limitata a 200 μl di volume. L'iniezione deve andare lentamente e fermarsi se si vede un urto o resistenza, che suggerisce che l'ago è fuori dalla vena. Se i topi mostrano segni clinici avversi come arricciamento e tremore, questa potrebbe essere una risposta shock all'iniezione ad alto volume, all'iniezione rapida o alla tossicità / anafilassi.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Williams, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+exosomes+provide+neuroprotection+and+improve+long-term+neurologic+outcomes+in+a+swine+model+of+traumatic+brain+injury+and+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived exosomes provide neuroprotection and improve long-term neurologic outcomes in a swine model of traumatic brain injury and hemorrhagic shock.</a> Journal of Neurotrauma. 36 (1), 54-60 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+activate+autophagy+in+recipient+cells+to+induce+angiogenesis+and+dental+pulp+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles activate autophagy in recipient cells to induce angiogenesis and dental pulp regeneration.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 1525 (22), 00304-00305 (2022).</li>
<li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+a+multiple+biomarkers+strategy+including+endothelial+dysfunction+to+improve+risk+stratification+for+cardiovascular+events+in+patients+at+high+risk+for+coronary+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Significance of a multiple biomarkers strategy including endothelial dysfunction to improve risk stratification for cardiovascular events in patients at high risk for coronary heart disease.</a> Journal of the American College of Cardiology. 54 (7), 601-608 (2009).</li>
<li>Qi, Y., Ma, J., Li, S., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+of+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+in+treatment+of+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Applicability of adipose-derived mesenchymal stem cells in treatment of patients with type 2 diabetes.</a> Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 274(2019).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+diet-induced+upregulation+of+exosomal+phosphatidylcholine+contributes+to+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-fat diet-induced upregulation of exosomal phosphatidylcholine contributes to insulin resistance.</a> Nature Communications. 12 (1), 213(2021).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Le EV stanno emergendo per svolgere un ruolo importante in diverse attività biologiche, tra cui la presentazione dell'antigene, il trasporto di materiale genetico, la modifica del microambiente cellulare e altri. Inoltre, la loro ampia applicazione offre nuovi approcci e opportunità per la diagnosi e il trattamento delle malattie21. L'implementazione delle applicazioni terapeutiche delle EV si basa sul successo dell'isolamento e della caratterizzazione. Tuttavia, a causa della mancanza di metodi d...

Le cellule staminali sono cellule pluripotenti indifferenziate con capacità di auto-rinnovamento e potenziale traslazionale1. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono facilmente isolate, coltivate, espanse e purificate in laboratorio, il che rimane caratteristico delle cellule staminali dopo più passaggi. Negli ultimi anni, prove crescenti hanno sostenuto l'opinione che le MSC agiscono in modo paracrino nell'uso terapeutico 2,3. Soprattutto la secrezione di vescicole extracellulari (EV) svolge un ruolo cruciale nel mediare le funzioni biologiche delle MSC. Come nanoparticelle membranose eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi di cellule, le EV consistono in sottocategorie denominate esosomi (Exos), microvescicole (MV) e corpi apoptotici ancora più grandi 4,5. Tra questi, Exos è l'EV più studiato con una dimensione di 40-150 nm, che è di origine endosomiale e attivamente secreto in condizioni fisiologiche. Le MV si formano spargendo direttamente dalla superficie della membrana plasmatica cellulare con un diametro di 100-1.000 nm, che sono caratterizzate da un'elevata espressione di fosfatidilserina e dall'espressione di marcatori superficiali di cellule donatrici6. Le EV contengono RNA, proteine e altre molecole bioattive, che hanno funzioni simili alle cellule madri e svolgono un ruolo significativo nella comunicazione cellulare, nella risposta immunitaria e nella riparazione dei danni tissutali7. Le MSC-EV sono state ampiamente studiate come un potente strumento terapeutico privo di cellule nella medicina rigenerativa8.
L'isolamento e la purificazione dei veicoli elettrici derivati da MSC è un problema comune nel campo della ricerca e dell'applicazione. Allo stato attuale, l'ultracentrifugazione differenziale e a gradiente di densità9, il processo di ultrafiltrazione10, la separazione immunomagnetica 11, il cromatografo ad esclusione molecolare 12 e il chip microfluidico13 sono metodi ampiamente impiegati nell'isolamento e nella purificazione delle EV. Con i vantaggi e gli svantaggi di ciascun approccio, la quantità, la purezza e l'attività dei veicoli elettrici raccolti non possono essere soddisfatti contemporaneamente14,15. Nel presente studio, viene mostrato in dettaglio il protocollo di centrifugazione differenziale di isolamento e caratterizzazione delle EV da MSC in coltura, che ha supportato un uso terapeutico efficiente 16,17,18,19,20. L'adattabilità di questo metodo per una serie di approcci a valle, come la marcatura fluorescente, il trapianto locale e l'iniezione sistemica, è stata ulteriormente esemplificata. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili delle MSC-EV nella ricerca traslazionale.

<table><tbody><tr><td>10% povidone-iodio (Betadine)</td><td>Weizhenyuan</td><td>10053956954292</td><td>Disinfezione delle ferite</td></tr><tr><td>Soluzione di calibrazione</td><td>Particella Metrix</td><td>110-0020</td><td>Calibrare lo strumento NTA</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Sigma</td><td>53716-49-7</td><td>Medicina analgesica</td></tr><tr><td>Imager della vena caudale&nbsp;</td><td>KEW Life Science</td><td>KW-XXY</td><td>Imager della vena caudale</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418R</td><td>Centrifugazione</td></tr><tr><td>Siero bovino fatale</td><td>Corning</td><td>35-081-CV</td><td>Coltura di UCMSCs</td></tr><tr><td>Formvar/maglia quadrata rivestita di carbonio</td><td>PBL Assay Science&nbsp;</td><td>24916-25</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>Cuscinetto riscaldante</td><td>Zhongke Life Science</td><td>Z8G5JBMz</td><td>Cura post-trattamento degli animali Soluzione di</td></tr><tr><td>eparina</td><td>StemCell</td><td>7980</td><td>Iniezione sistemica</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>RWD Life Science</td><td>R510-22</td><td>Anestesia animale</td></tr><tr><td>Minimo Essenziale Medium Alpha basic (1x)</td><td>Gibco</td><td>C12571500BT</td><td>Coltura di UCMSCs</td></tr><tr><td>Analizzatore di tracciamento di nanoparticelle</td><td>Particle Metrix</td><td>ZetaView PMX120</td><td>Analisi di tracciamento di nanoparticelle</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Meilunbio</td><td>MA0015</td><td>Resuspend EVs</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Procell Life Science</td><td>PB180120</td><td>Coltura di UCMSCs</td></tr><tr><td>Acido fosfotungstico</td><td>Solarbio</td><td>12501-23-4</td><td>Microscopio</td></tr> <tr>elettronico a trasmissione<td>Pipetta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000224</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 Kit di collegamento cellulare fluorescente rosso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26</td><td>Etichettatura EVs</td></tr><tr><td>Punzone per biopsia cutanea</td><td>Acuderm</td><td>69038-10-50</td><td>Difetti cutanei</td></tr><tr><td>Software ZetaView</td><td>Particle Metrix</td><td>Versione 8.05.14 SP7&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchiature termostatiche</td><td>Grant</td><td>v-0001-0005</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td> a bagno d'acqua <td>HITACHI</td><td>HT7800</td><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td></tr><tr><td>UCMSCs</td><td>Bai'ao&nbsp;</td><td>UKK220201</td><td>Commercialmente UCMSCs</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>XPN-100</td><td>Centrifugazione</td></tr> Sistema <tr>di<td>purificazione dell'acqua filtrata ultrapura</td><td>Milli-Q</td><td>IQ 7000</td><td>Preparazione di acqua ultrapura</td></tr></tbody></table>

isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle di membrana eterogenee rilasciate dalla maggior parte dei tipi cellulari e sono sempre più riconosciute come regolatori fisiologici dell'omeostasi dell'organismo e importanti indicatori di patologie; Nel frattempo, sta emergendo il loro immenso potenziale per stabilire terapie di malattia accessibili e controllabili. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) possono rilasciare grandi quantità di EV in coltura, che hanno dimostrato di promettere di avviare un'efficace rigenerazione dei tessuti e facilitare ampie applicazioni terapeutiche con una buona scalabilità e riproducibilità. C'è una crescente domanda di protocolli semplici ed efficaci per la raccolta e l'applicazione di MSC-EV. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato basato sulla centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentativi da MSC umane in coltura, esosomi e microvescicole per ulteriori applicazioni. L'adattabilità di questo metodo è dimostrata per una serie di approcci a valle, come l'etichettatura, il trapianto locale e l'iniezione sistemica. L'implementazione di questa procedura risponderà alla necessità di una raccolta e di un'applicazione semplici e affidabili di MSC-EV nella ricerca traslazionale.

MV ed Exos da UCMSC umani in coltura vengono isolati seguendo il flusso di lavoro sperimentale (Figura 1). I risultati NTA dimostrano che la dimensione di Exos da MSC umane varia da 40 nm a 335 nm con una dimensione di picco di circa 100 nm, e la dimensione delle MV varia da 50 nm a 445 nm con una dimensione di picco di 150 nm (Figura 2). La caratterizzazione morfologica degli Exos derivati da MSC mostra una tipica forma a coppa (Figura 3</s...

Il presente protocollo descrive la centrifugazione differenziale per isolare e caratterizzare EV rappresentative (esosomi e microvescicole) da MSC umane in coltura. Ulteriori applicazioni di questi veicoli elettrici sono spiegate anche in questo articolo.

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Questa procedura ha affrontato la necessità di una raccolta di vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali semplici e affidabili e di applicazione nella traduzione della ricerca. La raccolta di vescicole extracellulari mediante centrifugazione differenziale è semplice, facilmente scalabile e riproducibile, il che sarà utile al campo. Le vescicole extracellulari indistinte dalle cellule staminali mesenchimali indistinte sono un'applicazione indistinta nei moderni trattamenti delle malattie.Non avrò paura degli errori. Questa operazione è semplice e facile da imparare. Ci sono molti dettagli in questo semplice programma che possono essere presentati meglio attraverso il video.Per iniziare, coltivare le cellule staminali mesenchimali a oltre il 90% di confluenza. Sostituire il terreno di coltura in ogni piatto con 8 ml di alfa-MEM integrato. Dopo 48 ore di coltura, le cellule devono essere coltivate uniformemente per raccogliere completamente il terreno di coltura in provette da centrifuga da 50 ml.Quindi, centrifugare il terreno di coltura a 800 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in tubi conici da 1,5 mL per rimuovere i frammen

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Questo protocollo viene illustrato come purificare i microRNA extracellulari da terreni di coltura cellulare per piccoli RNA libreria costruzione e sequenziamento di nuova generazione. Vari punti di controllo di controllo di qualità sono descritti per permettere ai lettori di capire cosa aspettarsi quando si lavora con campioni di ingresso bassi come exRNAs.

Isolare, sequenziamento e analisi dei microRNA extracellulari dalle cellule staminali mesenchimali umane

Qui, presentiamo un protocollo per produrre un gran numero di esosomi di grado GMP da cellule staminali mesenchimali del liquido sinoviale utilizzando un bioreattore 3D.

Preparazione su larga scala di esosomi derivati da cellule staminali mesenchimali con liquido sinoviale mediante coltura di bioreattori 3D

Questo protocollo dimostra come isolare le piccole vescicole extracellulari derivate dal cordone ombelicale umano (hUC-MSC-sEV) con una semplice impostazione da banco su scala di laboratorio. La distribuzione dimensionale, la concentrazione proteica, i marcatori sEVs e la morfologia degli hUC-MSC-sEV isolati sono caratterizzati rispettivamente dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, dal saggio della proteina BCA, dal western blot e dal microscopio elettronico a trasmissione.

Un semplice metodo di filtrazione da banco per isolare piccole vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane

Questo protocollo descrive tutte le procedure, dalla coltura di cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana (ADSC) e la raccolta del surnatante all'estrazione delle vescicole extracellulari (EV) mediante ultracentrifugazione.

Purificazione e caratterizzazione di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa umana

Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata dello smistamento delle vescicole extracellulari (EV) rilasciate dalle cellule stromali mesenchimali. In particolare, si concentra sul settaggio dello strumento e sull'ottimizzazione delle condizioni di smistamento. L'obiettivo è quello di ordinare le vescicole extracellulari preservandone le caratteristiche.

Impostazione di uno smistamento di successo per l'isolamento delle vescicole extracellulari

Questo protocollo descrive l'isolamento e la successiva espansione delle cellule stromali mesenchimali e le cellule endoteliali che formano colonie senza l'uso di siero animale per generare le coppie a fini di trapianto autologo sperimentali.

Isolamento e di espansione degli animali siero gratuito di cordone ombelicale umano derivato cellule stromali mesenchimali (MSC) e cellule endoteliali progenitrici formanti colonia (ECFCs)

Un modo rapido, robusto di isolare vitali cellule staminali epiteliali adulte di pelle umana è descritta. Il metodo utilizza la digestione enzimatica della matrice di collagene della pelle, seguita da spiumatura dei follicoli piliferi e l'isolamento delle sospensioni singola cella o frammenti di tessuto per la coltura cellulare.

Isolamento e la coltura di cellule staminali epiteliali da pelle umana

In questo articolo dimostriamo l'isolamento di cellule staminali murine residente polmone mesenchimali (MSC polmone), la loro espansione, caratterizzazione e analisi delle proprietà immunomodulanti.

Isolamento e caratterizzazione di Hoechst Basso CD45 Negativo Mouse cellule staminali mesenchimali del polmone

Un metodo semplice è descritto per l'induzione della transizione epitelio mesenchimale (EMT) in una varietà di tipi cellulari. Metodi per l'analisi di cellule in EMT stati di immunocitochimica sono inclusi.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Scopri l'isolamento e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane mediante centrifugazione differenziale. Questo metodo riproducibile supporta applicazioni terapeutiche e la ricerca sulle comunicazioni cellulari.

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura (Video) | JoVE Journal

Isolamento, caratterizzazione e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari da cellule staminali mesenchimali umane in coltura

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