Apprendimento associativo avversivo e formazione della memoria accoppiando due sostanze chimiche in Caenorhabditis elegans

L'apprendimento e la memoria sono vitali per gli animali per sopravvivere e riprodursi navigando in modo efficiente in ambienti in continua evoluzione. È anche una delle principali materie studiate nelle neuroscienze. Caenorhabditis elegans è un organismo attraente per lo studio dell'apprendimento e della memoria a causa della semplicità del suo sistema nervoso.

Anche i suoi schemi elettrici chimici ed elettrici sono completamente ricostruiti. L'analisi comportamentale di Caenorhabditis elegans è estremamente complicata ed è influenzata da una serie di parametri come stress chimici, meccanici e termici. Per iniziare, preparare un terreno di crescita di nematodi da sei centimetri, o piastre NGM, spargendo 0,2 millilitri di una coltura liquida di E.coli OP50 in un mezzo Luria-Bertani e incubandoli a temperatura ambiente per non più di 24 ore.

Il primo giorno, raccogli e posiziona cinque animali gravidi ben nutriti su ogni piastra NGM di sei centimetri con un raccoglitore di vermi di platino e lasciali deporre circa 50 uova per tre ore a temperatura ambiente per ottenere una popolazione sincronizzata di animali adulti. Per fermare la deposizione delle uova, rimuovere gli animali genitori dai piatti con un raccoglitore di vermi di platino. Coltiva gli animali a temperatura ambiente per circa cinque giorni per raggiungere lo stadio adulto maturo, non lo stadio di giovane adulto.

Dopo cinque giorni, raccogliere circa 200 animali adulti in un raccoglitore di animali lavando ogni piatto con un millilitro di gelatina acquosa allo 0,25% che impedirà l'adesione degli animali alla superficie della plastica, come le punte delle pipette. Quindi, lavare gli animali spostando delicatamente il collettore su e giù due volte in 10 millilitri di acqua doppia distillata. Ripeti il processo due volte.

Immergere delicatamente il raccoglitore di animali contenente circa 200 animali in 40 millilitri di una miscela di 1% 1-propanolo e acido cloridrico a pH 4 in una capsula cristallizzante per un secondo. Lavare gli animali nel collettore immergendo molto delicatamente il collettore una volta in un pozzetto della sua piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti contenente 10 millilitri di acqua doppia distillata. Quindi posizionare il collettore su un prato E.coli OP50 su una piastra NGM di sei centimetri per 10 minuti affinché gli animali possano riposare.

Quindi, lavare gli animali nel collettore con 10 millilitri di acqua doppia distillata spostando delicatamente il collettore su e giù. Ripetere questo lavaggio tre volte e procedere al test della chemiotassi. Lavare in sequenza gli animali in un collettore con miscela di propanolo e acqua bidistillata, una volta ciascuno come dimostrato in precedenza.

Quindi posizionare il collettore su un prato E.coli OP50 su un agar NGM in una capsula di Petri di sei centimetri per 10 minuti affinché gli animali possano riposare. Quindi, lavare gli animali tre volte spostando delicatamente il collettore su e giù due volte in 10 millilitri di acqua doppia distillata per prevenire la contaminazione batterica e procedere al test della chemiotassi. Preparare le piastre della coclea per il test della chemiotassi in piastre di Petri di plastica di sei centimetri.

Quindi utilizzare una punta di pipetta segata con un'apertura di oltre un millimetro per trasferire gli animali dal collettore a una provetta da microcentrifuga da due millilitri contenente un millilitro di gelatina acquosa allo 0,25%. Dopo che gli animali si sono depositati sul fondo del tubo per gravità, rimuovere il surnatante dal tubo. Risospendere gli animali in un millilitro di tampone per chemiotassi e lasciarli depositare per gravità sul fondo del tubo per circa un minuto.

Quindi, rimuovere il più possibile il surnatante mediante pipettaggio. Quindi, individuare diagonalmente quattro microlitri di 1-propanolo acquoso al 5% in due punti, quindi individuare quattro microlitri di acqua distillata doppia in altri due punti della piastra di Petri. Quindi utilizzare una punta di pipetta segata con un'apertura di un millimetro per individuare sei microlitri della sospensione animale in un tampone di chemiotassi contenente circa 60 animali al centro di tre piastre.

Rimuovere il liquido il più possibile con uno stoppino di tessuto da laboratorio senza toccare gli animali. Posizionare un coperchio sul piatto e lasciare che gli animali si muovano liberamente sul piatto per 10 minuti a temperatura ambiente. Per fermare la chemiotassi, trasferire questa piastra in una capsula di Petri di vetro sul ghiaccio per tre minuti.

Quindi, posizionare il piatto in frigorifero fino a contare il numero di animali sul piatto. Conta il numero di animali in quattro sezioni ad eccezione di quelli nel cerchio centrale sotto un microscopio stereo e calcola l'indice di chemiotassi usando l'equazione. Dai valori dell'indice di chemiotassi, calcolare i valori dell'indice di apprendimento come differenza tra il valore dell'indice di chemiotassi degli animali di riferimento e il valore dell'indice di chemiotassi degli animali condizionati.

Nel test chemiotassi, gli animali condizionati con la miscela di 1-propanolo e acido cloridrico non sono attratti dal 5%1-propanolo avvistato sulle piastre di agar, mentre gli animali ingenui e di riferimento sono stati attratti dal 5%1-propanolo. Gli animali condizionati dall'addestramento distanziato con una miscela di 1-propanolo acquoso e acido cloridrico non erano più attratti dal 5%1-propanolo rispetto agli animali trattati con 1%1-propanolo o acido cloridrico, o solo acqua distillata doppiamente. Lo studio dell'effetto delle mutazioni sulla memoria ha rivelato che la formazione della memoria a breve e lungo termine dipendeva dai geni che giocavano ruoli essenziali nel condizionamento classico degli animali.

Dopo ogni condizionamento, gli animali devono essere lavati delicatamente solo una volta con acqua distillata doppia. Dopo che la memoria a lungo termine è stata formata utilizzando la procedura, l'imaging del calcio e l'elettrofisiologia possono identificare i circuiti neuronali responsabili della memoria. Attraverso analisi genetiche e di singoli neuroni, i processi di memorizzazione e recupero della memoria possono essere affrontati a livello molecolare e di singola cellula.