Trasformazione indotta dal mediatore dei fosfolipidi in colture tridimensionali

Le nostre colture di analisi 3D modificate possono essere utilizzate per studiare il ruolo di vari componenti in un microambiente tumorale, portando all'identificazione di nuovi biomarcatori e bersagli farmacologici. Questo metodo consente di studiare i cambiamenti nel fenotipo cellulare e nella segnalazione molecolare che assomigliano molto al sistema immunitario. Può anche essere modificato per soddisfare i requisiti specifici di uno studio.

Questo metodo può aiutare a identificare nuovi biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi precoce del cancro al seno. Inoltre, le intuizioni molecolari possono essere utilizzate per identificare nuovi bersagli farmacologici. Questo metodo può essere utilizzato per studiare sia la tumorigenesi che la morfogenesi dopo la perturbazione del gene o dei geni che possono fornire informazioni sul ruolo svolto dal gene o dai geni.

Per iniziare, tripsinizzare le cellule aspirando il mezzo e lavando con 2 millilitri di PBS. Aggiungere 900 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,05% e incubare a 37 gradi Celsius per circa 15 minuti o fino a quando le cellule sono completamente tripsinzzate. Preparare un letto di lrECM in otto pozzetti di un vetrino di copertura camerato rivestendo ciascun pozzetto con 60 microlitri di lrECM.

Posizionarlo in un incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un massimo di 15 minuti. Per preparare la sospensione cellulare, aggiungere 5 millilitri di mezzo di risospensione per estinguere l'attività della tripsina e ruotare le cellule a 112 volte g per 10 minuti a 25 gradi Celsius. Aspirare il mezzo esaurito e risospendere le cellule in 2 millilitri di mezzo di analisi.

Mescolare bene la sospensione per garantire la formazione di una sospensione a cella singola. Contare le cellule usando un emocitometro e calcolare il volume di sospensione cellulare necessaria per seminare 6.000 cellule in ciascun pozzetto. In base al numero di pozzetti richiesti, diluire la sospensione cellulare nel mezzo di sovrapposizione.

Aggiungere 400 microlitri della sospensione cellulare diluita ai letti lrECM preparati, assicurandosi attentamente di non disturbare il letto lrECM. Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica. Dopo 3 ore, aggiungere 200 nanomoli di PAF a ciascun pozzetto.

Aggiungere la stessa concentrazione di PAF durante ogni cambio di terreno e reintegrare le cellule con terreno fresco ogni 4 giorni. Dopo 20 giorni di coltivazione, pipettare accuratamente il terreno da ciascun pozzetto e lavare i pozzetti con 400 microlitri di PBS preriscaldato. Fissare le strutture acinose aggiungendo 400 microlitri di paraformaldeide al 4% appena preparata e incubando per 20 minuti a temperatura ambiente.

Risciacquare i pozzetti una volta con PBS ghiacciato e permeabilizzare con PBS contenente 0,5% Triton X-100 per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, pipettare accuratamente la soluzione di Triton X-100 e risciacquare con 400 microlitri di glicina PBS appena preparata. Aggiungere 400 microlitri della soluzione bloccante primaria contenente il 10% di siero di capra in tampone di immunofluorescenza e incubare a temperatura ambiente per 60 minuti.

Rimuovere la soluzione bloccante primaria, aggiungere 200 microlitri di anticorpo bloccante secondario al 2% preparato nella soluzione bloccante primaria e lasciarlo a temperatura ambiente per 45-60 minuti. Preparare l'anticorpo primario in una soluzione di anticorpi bloccanti secondari al 2% in una diluizione 1:100. Rimuovere la soluzione di blocco secondaria, aggiungere l'anticorpo appena preparato e incubare durante la notte a 4 gradi Celsius.

Pipettare accuratamente la soluzione anticorpale primaria e lavarla tre volte con 400 microlitri di tampone immunofluorescenza. Quindi, preparare una diluizione 1:200 dell'anticorpo secondario coniugato con fluoroforo nella soluzione bloccante primaria e incubare i vetrini nella soluzione anticorpale secondaria per 40-60 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare i vetrini con 400 microlitri di tampone immunofluorescenza per 20 minuti, seguiti da due lavaggi con PBS per 10 minuti ciascuno.

Contro-colorare i nuclei con PBS contenente 0,5 nanogrammi per millilitro di macchia nucleare per 5-6 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini tre volte con 400 microlitri di PBS per rimuovere la macchia in eccesso. Pipettare accuratamente l'intero PBS e assicurarsi di rimuovere la soluzione residua.

Quindi aggiungere una goccia di reagente di montaggio in ciascun pozzetto e lasciarlo riposare a temperatura ambiente durante la notte. Infine, immagina i vetrini con ingrandimento 40x o 63x su un microscopio confocale, prendendo sezioni Z ottiche di dimensioni di 0,6 millimetri. Le immagini rappresentano i nuclei delle cellule in acini colorati con una colorazione nucleare.

La costruzione 3D degli acini e l'immagine a contrasto di fase degli acini MCF10A cresciuti su lrECM per 20 giorni sono mostrati qui. La sezione più centrale mostra la presenza di un lume vuoto. PAF interrompe la polarità e induce cambiamenti simili a EMT negli acini mammari MCF10A.

Le cellule MCF10A sono state coltivate come 3D su colture top'in lrECM. Le colture sono state trattate con PAF nei giorni 0, 4, 8, 12 e 16. Le colture sono state mantenute per 20 giorni e poi immunocolorate per alfa6-integrina e colorazione nucleare, GM130, un marker per la polarità apicale, e Vimentin, un marcatore EMT.

La pila più centrale dei rispettivi acini è stata mostrata qui. I dati rappresentativi sono per 40-50 acini provenienti da tre esperimenti biologicamente indipendenti. Il letto lrECM deve essere realizzato con cura in modo che sia distribuito uniformemente senza bolle d'aria.

Inoltre, la sospensione cellulare deve essere miscelata uniformemente e aggiunta lentamente per evitare l'aggregazione. Si possono ottenere proteine e RNA dalle colture 3D che possono quindi essere utilizzate per studiare i diversi percorsi molecolari.