Name: Delicato isolamento dei nuclei dal tessuto cerebrale del killifish turchese africano adulto, un modello naturalmente di breve durata per la ricerca sullinvecchiamento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri un protocollo delicato per isolare nuclei di alta qualità dal cervello di Nothobranchius furzeri, un modello per lo studio dell'invecchiamento. Questo metodo consente analisi a singolo nucleo come RNA-seq e ATAC-seq.

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Alcuni pannelli sono stati generati con BioRender.com. Questo lavoro nel nostro laboratorio è stato supportato dal NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant a B.T., una sovvenzione della Simons Foundation come parte della Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, una sovvenzione pilota della Navigage Foundation e un premio Hanson-Thorell Family a B.A.B.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per generare in modo riproducibile nuclei di alta qualità da cervelli killifish. Questo protocollo doveva essere specificamente progettato per il cervello killifish poiché i tipici protocolli di isolamento dei nuclei cerebrali basati sui mammiferi applicati ai cervelli killifish hanno costantemente portato a una scarsa qualità dei nuclei nelle nostre mani. Sospettiamo che ciò sia dovuto al più basso contenuto di mielina relativa del cervello killifish rispetto alle loro controparti dei mammiferi, che si liserebbero e si aggregherebbero in risposta alle dure condizioni richieste per la lisi delle cellule cerebrali dei mammiferi. Questo protocollo è un progresso nei campi dell'invecchiamento e dei killifish in quanto facilita l'esplorazione dell'invecchiamento cerebrale a livello di singola cellula in un modello economico e tempestivo di invecchiamento cerebrale dei vertebrati. 
Questo protocollo è robusto per campioni freschi o congelati, anche se è necessario considerare le applicazioni a valle quando si utilizza tessuto fresco o congelato. Il tessuto congelato è spesso conveniente in quanto può essere raccolto e conservato per mesi mentre vengono raccolti i campioni. Tali campioni possono essere tranquillamente utilizzati per applicazioni come snRNA-seq. Tuttavia, il congelamento dei campioni può interrompere la struttura nucleare e quindi la capacità di misurare con precisione il paesaggio cromatinico da ATAC-seq21. Pertanto, per applicazioni a valle come ATAC-seq o snATAC-seq, si raccomanda di utilizzare cervelli appena sezionati invece di cervelli congelati. Inoltre, poiché tutti i passaggi dopo l'omogeneizzazione cerebrale possono essere eseguiti in parallelo, questo protocollo è suscettibile di eseguire più campioni in un lasso di tempo ragionevole, limitando così la degradazione dell'RNA causata da un'incubazione prolungata sul ghiaccio.
Inoltre, è imperativo preparare i tamponi freschi (entro poche ore) dall'esecuzione dell'estrazione dei nuclei. Abbiamo scoperto che i detergenti e BSA devono essere aggiunti ai tamponi immediatamente prima di iniziare il protocollo. I tamponi contenenti solo sali (PBS, NaCl, ecc.) possono essere prodotti come concentrati, sterilizzati con filtro (0,22 μm) e conservati a tempo indeterminato a temperatura ambiente. Le soluzioni madre BSA possono essere preparate, sterilizzate e conservate a 4 °C entro pochi giorni dall'estrazione dei nuclei (se preparate da polvere), ma devono sempre essere aggiunte ai tamponi utilizzati in questo protocollo immediatamente prima di intraprendere il protocollo. Tuttavia, si consiglia di preparare le soluzioni BSA il giorno del protocollo. Se si utilizzano soluzioni BSA prefabbricate da terzi, si consiglia di utilizzare bottiglie fresche e non aperte. L'uso di BSA fresco porta generalmente a un contenuto inferiore di detriti nella preparazione dei nuclei.
Sia che vengano utilizzati campioni freschi o congelati come input, è importante valutare la qualità dei nuclei dopo l'isolamento dei nuclei. Sebbene questo protocollo sia specificamente progettato per evitare l'eccessiva, questa è la causa più comune di perdita di qualità dei nuclei. L'eccessiva lisi può derivare da un tempo eccessivo trascorso nel tampone di lisi, da una manipolazione eccessivamente approssimativa dei nuclei come un pipettaggio eccessivo con una punta di pipetta standard o da una quantità eccessiva di tempo trascorso tra l'isolamento dei nuclei e le applicazioni a valle (>1 ora). I nuclei sovralisati hanno spesso periferie nucleari danneggiate, che perdono DNA e causano aggregazione (Figura 2B). Ciò porterà ad un aumento del numero di multipletti e contribuirà agli acidi nucleici di fondo che interferiranno con le applicazioni a valle, in particolare snRNA-seq. Entrambe le qualità possono essere valutate al microscopio dopo l'isolamento dei nuclei. Se si osserva un eccessivo aggregazione nucleare, si consiglia di provare ad abbreviare l'incubazione della fase di lisi per ridurre la possibilità di iperlisi. Come metodo alternativo per aumentare i singoletti dei nuclei, la selezione cellulare assistita da fluorescenza (FACS) può essere utilizzata per arricchire i singoletti a valle di questo protocollo. Tuttavia, notiamo che, quando si lavora con nuclei già fragili da tessuto congelato, lo stress di taglio che si verifica durante la selezione può portare ad un aumento della rottura nucleare e quindi ad un aumento dell'RNA / DNA ambientale. Inoltre, notiamo che il tempo necessario per eseguire un FACS yield sort per i nuclei durante l'elaborazione di più campioni richiederebbe che tutti i campioni di nuclei rimangano sul ghiaccio per ore, mentre altri campioni vengono ordinati. Pertanto, l'aumento dei tempi di attesa durante l'elaborazione di più campioni in parallelo con l'approccio FACS potrebbe anche portare a una qualità complessiva ridotta dei nuclei e aumentare il rischio di degradazione dell'RNA. Pertanto, se FACS è desiderato per una velocità di doppietto ridotta, raccomandiamo che il contenuto di detriti venga controllato nuovamente dopo il tipo di resa e che la possibile qualità ridotta dell'RNA sia presa in considerazione per le applicazioni di RNA-seq a singola cellula come potenziale avvertimento. 
Una stima accurata della conta dei nuclei e della proporzione di singoletto è essenziale per quasi tutte le applicazioni "omiche" a valle ed è della massima importanza. Grazie alla capacità di controllare e contare facilmente i nuclei per dimensione, la citometria a flusso è il metodo più accurato di conteggio dei nuclei che abbiamo valutato. In alternativa, è possibile quantificare i nuclei utilizzando contatori di cellule come il contatore automatico di cellule Countess 2 FL di Invitrogen o il contatore automatico di celle DeNovix CellDrop. Da notare, il contatore automatico di celle Countess 2 FL di Invitrogen e, in misura molto minore, il DeNovix, tendono a sovrastimare i conteggi dei nuclei contando i detriti come nuclei, il che significa che potrebbe essere necessario il gating manuale delle dimensioni. Inoltre, il citometro a flusso consente di valutare facilmente la purezza dei nuclei. Si può discernere la proporzione relativa dei nuclei di singoletto rispetto ai nuclei di multipletti in un modo quantitativo che è difficile al microscopio. Ciò è vitale per snRNA-seq e snATAC-seq, poiché tali protocolli soffriranno di un surplus di campioni multipli, che devono essere esclusi dalle analisi a valle. Oltre ai multipletti, la proporzione relativa di "detriti" (nuclei frammentati, detriti cellulari) può essere quantificata mediante citometria a flusso e deve essere relativamente bassa, poiché questo materiale contiene spesso acidi nucleici contaminanti che possono contribuire a un segnale di fondo e corrompere i dati "omici" del singolo nucleo. 
Come per i protocolli di isolamento dei nuclei precedentemente descritti, le proporzioni dei tipi cellulari nel tessuto originale potrebbero non essere ricapitolate fedelmente nella preparazione dei nuclei19, e quindi dovrebbero essere interpretate con cautela. Da notare, come tutti i teleostei, i killifish turchesi africani hanno eritrociti nucleati, che dovrebbero anche essere rappresentati nella preparazione dei nuclei. Questi nuclei possono essere identificati nei set di dati snRNA-seq e snATAC-seq dalla maggiore espressione/accessibilità dei geni dell'emoglobina e possono essere esclusi computazionalmente se lo si desidera.

Comprendere i meccanismi dell'invecchiamento cerebrale dei vertebrati è fondamentale per affrontare le malattie neurodegenerative legate all'età come l'Alzheimer e la demenza1. Il killifish turchese africano (Nothobranchus furzeri) è il vertebrato più breve che può essere allevato in cattività e, grazie alla sua breve durata di vita e al deterioramento cognitivo associato all'età, è un eccellente modello di invecchiamento cerebrale 2,3,4,5. Recentemente, l'avvento di tecnologie "omiche" a singola cellula, come l'RNA-seq a nucleo singolo (snRNA-seq) e il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (snATAC-seq), hanno permesso ai ricercatori di interrogare il cervello che invecchia a una risoluzione senza precedenti 6,7,8. Questi metodi si basano sull'isolamento dei nuclei, poiché il recupero delle cellule cerebrali come i neuroni è spesso troppo difficile da isolare 6,7,8,9,10. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli di isolamento dei nuclei pubblicati sono ottimizzati per organismi modello di mammiferi 11,12,13,14,15. Pertanto, poiché attualmente esiste un bisogno insoddisfatto di isolare i nuclei cerebrali nel killifish come nuovo organismo modello emergente nel campo della ricerca sull'invecchiamento2, l'obiettivo di questo protocollo è stabilire un metodo per isolare nuclei di alta qualità dal tessuto killifish cerebrale congelato.
Qui, viene stabilito un flusso di lavoro semplificato e robusto che utilizza materiali comunemente disponibili per isolare nuclei di alta qualità dai cervelli killifish. Questo protocollo è stato modificato da un protocollo di genomica 10x per cervelli di topo per accogliere i cervelli a basso contenuto di mielina del killifish turchese africano, la fragilità del tessuto congelato e la necessità di ridurre il contenuto di detriti ambientali per applicazioni correlate al sequenziamento16. Infatti, protocolli precedentemente ottimizzati per il tessuto cerebrale dei mammiferi17,18 portano a una scarsa qualità dei nuclei (cioè overlysis) e / o ad un alto contenuto di detriti quando utilizzati su cervelli di killifish congelati, rendendoli inadatti per l'uso con snRNA-seq secondo le raccomandazioni per i singoli nuclei RNA-seq usando la microfluidica (Figura supplementare 1).
Oltre all'isolamento dei nuclei, dimostriamo come valutare la qualità e la resa dei nuclei mediante microscopia e citometria a flusso. In questo articolo vengono forniti esempi di risultati ottimali e non ottimali e viene illustrata la risoluzione dei problemi. Questo protocollo è stato progettato e ottimizzato per i cervelli di killifish congelati, ma può anche essere utilizzato senza grandi modifiche su campioni di killifish appena sezionati. I nuclei cerebrali di Killifish isolati usando questo metodo sono stati ottimizzati per l'uso in RNA-seq a singolo nucleo (snRNA-seq) come applicazione a valle, ma dovrebbero anche essere suscettibili di uso in snATAC-seq e bulk ATAC-seq.

<table><tbody><tr><td>Soluzione di Trypan Blue allo 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo per centrifuga per coni</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Grinder per tessuti</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Dounce Omogeneizer</td></tr><tr><td>5 mL Polistirene Provetta a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M Cloruro di sodio, Soluzione</td> di risciacquo autoMACS <td>Promega</td><td>V4221</td><td></td>di grado di biologia molecolare</tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Ciò corrisponde a 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (utilizzato per la citometria a flusso)</td></tr><tr><td>Soluzione per la rimozione dei detriti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio DNA LoBInd Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve (dotato di obiettivo 60x)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>Nessun numero di catalogo; Utilizzato per ispezionare visivamente i nuclei.</td></tr><tr><td>Provette in polistirene a fondo tondo Falcon, provette</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS</td>da 5 mL</tr><tr><td>Filtri cellulari FLOWMI, 40 &; M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Indicati come filtri on-tip nel protocollo</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>Utilizzato per abbassare il pH TRIS da 8,0 a 7,4</td></tr><tr><td>Cannocchiale da dissezione Leica NA</td><td></td><td></td> Numero di catalogo <td></td></tr><tr><td>MACS BSA soluzione stock</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu; M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Citometro a flusso</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>Nessun numero di catalogo</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio, esaidrato, grado di biologia molecolare (polvere)</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 16R Centrifuga</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Micro vetrini Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Sostituto</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ Catalogo: 983739 P Codice: -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione detergente NP-40 Surfact-Amps ThermoFisher</td><td></td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Acqua HyPure per biologia molecolare senza nucleasi HyClone</td><td></td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase Inibitore (50.000 U)</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di ioduro di propidio</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI Colorante nucleare</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT Puntali per pipette (a bassissima ritenzione, filtrati) in 10 &micro; L, 20 & micro; L, 200 & micro; L, e 1000 &micro; USA</td><td>Scientific</td><td>#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina-S (MS 222)</td><td>Syndel</td><td>Tricaina10G</td><td>Syndel è un fornitore approvato dalla FDA per Tricaina</td></tr> TRIS di grado farmaceutico<tr><td>, 1 M, pH 8.0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette a foro largo</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr></tbody></table>

delicato isolamento dei nuclei dal tessuto cerebrale del killifish turchese africano adulto, un modello naturalmente di breve durata per la ricerca sull'invecchiamento

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

Studiare l'invecchiamento cerebrale alla risoluzione di singole cellule nei sistemi di vertebrati rimane impegnativo a causa di costi, tempi e vincoli tecnici. Qui, dimostriamo un protocollo per generare librerie di sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo (snRNA-seq) dal cervello del killifish turchese africano vertebrato naturalmente di breve durata Nothobranchius furzeri. Il killifish turchese africano ha una durata di vita di 4-6 mesi e può essere ospitato in modo economico, riducendo così i costi e i tempi per studiare l'invecchiamento cerebrale dei vertebrati. Tuttavia, sono necessari protocolli su misura per isolare nuclei di qualità sufficiente per esperimenti a valle a singola cellula dal cervello di pesci giovani e anziani. Qui, dimostriamo un protocollo empiricamente ottimizzato per l'isolamento di nuclei di alta qualità dal cervello di killifish turchesi africani adulti, un passo fondamentale nella generazione di librerie omiche a singoli nuclei di alta qualità. Inoltre, dimostriamo che i passaggi per ridurre l'RNA di fondo contaminante sono importanti per distinguere chiaramente i tipi di cellule. In sintesi, questo protocollo dimostra la fattibilità dello studio dell'invecchiamento cerebrale in organismi modello di vertebrati non tradizionali.

Il protocollo di isolamento dei nuclei cerebrali killifish qui descritto è ottimizzato specificamente per il killifish ed è riassunto nella Figura 1. Oltre all'estrazione dei nuclei, il protocollo descrive diversi metodi per valutare la qualità e la quantità dei nuclei isolati. La Figura 2 mostra esempi di nuclei sani (Figura 2A) e non sani (Figura 2B) valutati al microscopio ottico. Nuclei sani adatti all'analisi a valle (Figura 2A) si presentano come nuclei singoletti con membrane intatte. Come mostrato nella Figura 2B, la modalità di guasto più comune di questo protocollo (e di altri protocolli di isolamento dei nuclei) è la generazione di nuclei sovralisati, che sono caratterizzati da membrane nucleari danneggiate. Ciò porta spesso all'aggregazione dei nuclei e può contribuire ai segnali di fondo nelle applicazioni a valle a causa della perdita di acidi nucleici dai nuclei rotti. Se si osserva un'aggregazione eccessiva, si raccomanda di essere più delicati durante le fasi di dounce e/o di ridurre i tempi di incubazione nel tampone di lisi.
Questo protocollo utilizza la citometria a flusso per quantificare il numero di nuclei isolati e determinare la proporzione relativa di nuclei multipli in un campione. Inoltre, la citometria a flusso può essere utilizzata per valutare il contenuto relativo di detriti contaminanti, frammenti di nuclei spesso rotti e altri detriti cellulari che possono influenzare negativamente i saggi a valle nel campione di nuclei. I dati di flusso rappresentativi possono essere visualizzati nella Figura 3. Una procedura di isolamento dei nuclei di alta qualità produrrà: 1) una piccola frazione di detriti e 2) un'alta frazione di nuclei singoletto rispetto a multipli (&gt; l'80% della frazione nucleica). L'uso della colorazione PI, che colora gli acidi nucleici, consente di separare i nuclei di singoletto dai detriti e dai nuclei multipli. La figura 3A è un esempio di preparazione contaminata da detriti, mentre la figura 3B è un esempio di esperimento di alta qualità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro di isolamento dei nuclei cerebrali di Killifish. Flusso di lavoro sperimentale per l'isolamento di nuclei da cervelli di killifish congelati o freschi. Una volta isolati e valutati, i nuclei possono essere utilizzati per varie analisi "omiche" a valle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg"> Figura 2: Valutazione della qualità dei nuclei mediante microscopia. I nuclei sono stati miscelati 1:1 in una soluzione di 0,4% di Trypan Blue e visualizzati su un microscopio Echo Revolve mediante imaging a campo chiaro a 60x. (A) Un esempio di nucleo di alta qualità. Il nucleo è presente come singoletto e la membrana nucleare è intatta. (B) Un esempio di nuclei di scarsa qualità. Le membrane nucleari sono danneggiate e i nuclei si stanno aggregando in un doppietto, probabilmente a causa della perdita di DNA appiccicoso, che può essere visto fuoriuscire dalla parte superiore del nucleo più alto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg"> Figura 3: Quantificazione dei nuclei e valutazione della purezza mediante citometria a flusso. I campioni di nuclei sono stati colorati con una diluizione 1:100 di PI e eseguiti su un citometro a flusso. I nuclei sono presenti in forme singoletto e multipletto nel quadrante superiore destro di (A,B) con singoletti come la nube più bassa di eventi seguita da doppietti, terzine, ecc. in ordine crescente. I detriti sono contrassegnati dagli eventi nei due quadranti più a sinistra. (A) Un esempio di preparazione dei nuclei di bassa qualità, in cui la fase di rimozione dei detriti è stata omessa e i detriti costituiscono il &gt;40% degli eventi. (B) Un esempio di campione di nuclei di alta qualità, con la fase di rimozione dei detriti inclusa. In questo esempio, i detriti costituiscono il &lt;10% di tutti gli eventi registrati dal citometro a flusso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tipo di campione (2 cervelli)</td>
			<td>Resa media (4 preparazioni indipendenti)</td>
		</tr><tr><td>Cervelli maschili di 5 settimane</td>
			<td>3,59 ± 1,76 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cervelli maschili di 10 settimane</td>
			<td>6,41 ± 1,33 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cervelli maschili di 15 settimane</td>
			<td>14,59 ± 2,05 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cervelli femminili di 5 settimane</td>
			<td>2,54 ± 0,75 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cervelli femminili di 10 settimane</td>
			<td>4,66 ± 1,29 x 105</td>
		</tr><tr><td>Cervelli femminili di 15 settimane</td>
			<td>7,95 ± 3,51 x 105</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Rese medie attese da due cervelli di killifish turchese africano attraverso il sesso e l'età. Le rese medie espresse in 105 nuclei ± errore standard della media su quattro preparazioni di nuclei indipendenti in ciascuna categoria.
Figura supplementare 1: Confronto della qualità dell'isolamento dei nuclei utilizzando protocolli standard e il nostro protocollo ottimizzato su cervelli di killifish congelati. (A) Valutazione della qualità dei nuclei mediante microscopia. I nuclei sono stati miscelati 1:1 in una soluzione di 0,4% di Trypan Blue e visualizzati al microscopio mediante imaging a campo luminoso a 60x. (B) Quantificazione del carico di nuclei e detriti mediante citometria a flusso. I campioni di nuclei sono stati colorati con una diluizione 1:100 di PI e eseguiti su un citometro a flusso. (C) Riepilogo delle metriche di valutazione della qualità mediante microscopia e citometria a flusso con i diversi protocolli di riferimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Rappresentazione schematica delle fasi di rimozione dei detriti. (A) Schema di stratificazione della stratificazione per la rimozione dei detriti. (B) Schema di rimozione del surnatante dopo centrifugazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui presentiamo un protocollo per isolare i nuclei dal cervello del modello di vertebrati di breve durata Nothobranchius furzeri per applicazioni a valle come il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo o il saggio a nucleo singolo per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento (ATAC-seq).

Delicato isolamento dei nuclei dal tessuto cerebrale del killifish turchese africano adulto, un modello naturalmente di breve durata per la ricerca sull'invecchiamento

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

Questo è il primo protocollo ottimizzato per isolare nuclei di alta qualità per esperimenti di sequenziamento di singoli nuclei utilizzando cervelli congelati di killifish turchese africano, un modello di vertebrato emergente per la ricerca sull'invecchiamento. Questo protocollo isola i nuclei molto delicatamente, il che lo distingue dai protocolli più duri ottimizzati per altri organismi con cervelli più mielinici, che si traducono in nuclei degradati quando usati nel killifish. Questo metodo sarà fondamentale per aiutarci a comprendere l'invecchiamento cerebrale a livello di singola cellula.Dovrebbe tradursi bene in altri tessuti che richiedono un isolamento dei nuclei più delicato. Questo protocollo è facile da usare. Il compito più impegnativo è la centrifugazione a gradiente per la rimozione dei detriti, in cui è meglio essere lenti e precisi che veloci e disordinati.A dimostrare la procedura saranno Ari Adler e Brian Teefy, un tecnico di laboratorio di ricerca e uno studioso post-dottorato del laboratorio di Benayoun. Dopo aver sezionato il killifish, scongelare il tessuto cerebrale congelato sul ghiaccio per 10 minuti e rimbalzare il cervello in un millilitro di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati in un omogeneizzatore di dounce da due millilitri. Durante la lisatura del campione, tenere l'omogeneizzatore sul ghiaccio ed evitare di generare bolle.Ripulire il tessuto come descritto nel manoscritto e lasciare riposare il campione sul ghiaccio nell'omogeneizzatore di dounce per due minuti. Quindi, filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 15 millilitri preverniciato con 5% BSA. Aggiungere quattro millilitri di tampone di lavaggio nuclei al campione pipettando il tampone di lavaggio sul filtro cellulare da 70 micrometri e mescolare invertendo delicatamente il tubo cinque volte.Utilizzando un rotore a benna oscillante, centrifugare il campione a 500 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante versandolo delicatamente in un contenitore di rifiuti liquidi. Tenere il campione in posizione verticale e rimuovere il tampone di lavaggio rimanente utilizzando una pipetta P1000.Risospendere immediatamente i nuclei in un millilitro di tampone di lavaggio dei nuclei con una punta per pipetta P1000 ad ampio foro. Quindi, portare il campione a cinque millilitri aggiungendo quattro millilitri di tampone di lavaggio dei nuclei e miscelare come dimostrato in precedenza. Pellettare la cella mediante centrifugazione.Eliminare il surnatante e risospendere i nuclei in un millilitro di tampone di lavaggio dei nuclei con una punta di pipetta ad ampio foro. Ora, trasferire i nuclei in un tubo di citometria a flusso. Aggiungere 300 microlitri di soluzione di rimozione dei detriti alla sospensione cellulare e mescolarla accuratamente mediante pipettaggio con una punta larga fino a quando la miscela è omogenea.Tenere il tubo con una leggera angolazione e sovrapporre delicatamente un millilitro di tampone di lavaggio nuclei sopra la soluzione nucleica utilizzando una pipetta P1000. Centrifugare il campione in un rotore a benna oscillante a 3000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Eliminare completamente le due fasi superiori utilizzando una pipetta P1000.Trasferire lo strato inferiore in un tubo conico da 15 millilitri preverniciato con 5% BSA. Quindi, portare il volume a 15 millilitri con tampone di lavaggio nuclei e mescolare invertendo il tubo tre volte. Centrifugare il tubo a 1000G per 10 minuti a quattro gradi Celsius in un rotore a benna oscillante.Rimuovere accuratamente il surnatante e risospendere immediatamente il pellet in 150 microlitri di tampone di lavaggio nuclei utilizzando una punta di pipetta ad ampio foro. Passare a una punta per pipetta standard impostata su 300 microlitri. Pipettare l'intero campione e quindi collegare un filtro on-tip da 40 micrometri all'estremità della punta della pipetta.Filtrare il campione espellendo con forza il campione attraverso il filtro in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri a basso legame del DNA. In una provetta FACS, risospendere 10 microlitri del campione di nuclei filtrati in 90 microlitri del tampone citometrico a flusso raccomandato. Colorare i campioni con ioduro di propidio ad una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro.Dopo aver configurato l'area di lavoro come descritto nel manoscritto, avviare il flusso premendo l'icona di riproduzione nell'angolo in basso a destra. Verificare la presenza di bolle d'aria o grumi nel campione utilizzando l'area di dispersione laterale rispetto all'HDRT. Inoltre, controllare il grafico a dispersione laterale rispetto al grafico a dispersione in avanti per verificare che gli eventi si stiano accumulando entro i limiti della finestra.Per ingrandire, fare doppio clic sull'area di dispersione laterale rispetto al grafico PerCP-Vio700-A. Fare clic sul pulsante sulla barra degli strumenti in alto a sinistra con una linea perpendicolare per selezionare un cancello del quadrante. Quindi, fare clic in un punto qualsiasi dell'area di dispersione laterale rispetto al grafico PerCP-Vio700-A e i quadranti appariranno all'interno del grafico.Fare clic in un punto qualsiasi delle linee divisorie del quadrante e far scorrere il cursore per modificare il posizionamento del quadrante. Posizionare i quadranti in modo tale che il quadrante in alto a sinistra contenga detriti e il quadrante in alto a destra contenga nuclei. Fare clic sull'icona quadrata, grigia, I per aprire la finestra delle proprietà.Vai alla scheda Funzioni regione e assicurati un segno di spunta verde accanto all'elemento superiore, che indica che l'intero grafico è selezionato. Sotto l'elenco delle funzioni, fare clic su conteggio per microlitro per produrre un segno di spunta verde. Fare clic su OK e ogni quadrante visualizzerà un conteggio per metrica microlitro.Selezionare il conteggio e la percentuale totale dalla scheda delle funzioni dell'area per visualizzare i conteggi e le percentuali non elaborati, se lo si desidera. Disegna una porta poligonale attorno a questa popolazione facendo clic sul pulsante poligono sulla barra degli strumenti in alto a sinistra. Quindi, fai clic una sola volta e fai scorrere il mouse per disegnare un segmento lineare del cancello.Fare nuovamente clic per terminare e iniziare il successivo, seguito da un doppio clic per completare il cancello. Fare clic sul bordo del cancello e far scorrere il mouse per riposizionarlo. Fare clic sui vertici del cancello per modificare la forma e verranno visualizzati i conteggi per microlitro della popolazione controllata.I nuclei sani che sono apparsi come nuclei di singoletto con membrane intatte sono adatti per l'analisi a valle. Tuttavia, i nuclei malsani sono caratterizzati da membrane nucleari danneggiate, che portano all'aggregazione dei nuclei e possono contribuire ai segnali di fondo nelle applicazioni a valle. I nuclei sono in forma singoletta e multipletto nel quadrante in alto a destra, con i singoletti come la nube più bassa di eventi seguita da doppietti e terzine in ordine crescente.I detriti sono contrassegnati da eventi nei due quadranti più a sinistra in una preparazione di nuclei di bassa qualità in cui la fase di rimozione dei detriti è stata omessa. I detriti costituiscono oltre il 40% degli eventi. Tuttavia, in un esperimento di alta qualità, i detriti costituiscono meno del 15% di tutti gli eventi.È imperativo rimuovere completamente lo strato intermedio dopo la fase di centrifugazione di rimozione dei detriti per ridurre la contaminazione dell'RNA di fondo I nuclei isolati utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo o il sequenziamento ATAC per ottenere informazioni trascrittomiche ed epigenetiche a livello di singola cellula. Questa tecnica consentirà ai ricercatori di esplorare la regolazione genica del cervello a livello di singola cellula nel killifish turchese africano, un organismo modello di vertebrati naturalmente di breve durata per la ricerca sull'invecchiamento.

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Neuroscienze

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Delicato isolamento dei nuclei dal tessuto cerebrale del killifish turchese africano adulto, un modello naturalmente di breve durata per la ricerca sullinvecchiamento (Video) | JoVE Journal

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