Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti
24 marzo 2023
Qui, presentiamo un protocollo per isolare il mesenchima intestinale murino, compresi i telocytes. Questi possono essere utilizzati per diverse applicazioni, come la co-coltura con topo o organoidi di derivazione umana, per sostenere la crescita e riflettere meglio la situazione nel tessuto originale.
Il nostro protocollo per l'isolamento del mesenchima intestinale si traduce in un'alta resa di telociti. Questo metodo offre una piattaforma iniziale per studiare l'interazione cellula-cellula che coinvolge i telocytes nell'omeostasi e nella malattia. I telociti sono cellule uniche sensibili ai protocolli di dissociazione tissutale disponibili.
Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica è l'isolamento del mesenchima, compresi i telociti vitali arricchiti. Il mesenchima, incluso il telocita, può servire come fonte per le molecole di segnalazione e i fattori di crescita necessari per la crescita organizzata ex vivo. Per iniziare, lavare l'intestino, separato da un topo eutanasiato, in una capsula di Petri contenente PBS freddo e sterile.
Metti l'intestino in una capsula di Petri. E usando le forbici a sfera, apri il tubo intestinale longitudinalmente e lava le feci. Trasferire l'intestino in un nuovo piatto contenente PBS fresco e freddo.
Dopo aver lavato l'intestino ancora una volta, tagliare l'intestino tenue in segmenti lunghi un centimetro e trasferirli in un tubo conico da 15 millilitri riempito con otto millilitri di PBS. Agitare il tubo manualmente a uno o due cicli al secondo per un minuto. Versare la soluzione in una capsula di Petri.
E usando una pinza, trasferire il segmento in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 20 millilitri di soluzione A.Posizionare i tubi in un incubatore orbitale a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, agitare vigorosamente il tubo a mano a quattro o cinque cicli al secondo per un minuto per dissociare l'epitelio. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
Dopo aver tagliato e lavato i frammenti come dimostrato in precedenza, trasferirli in un nuovo tubo da 50 millilitri riempito con 10 millilitri di PBS sterile e invertire il tubo a uno o due cicli al secondo per un minuto. Versare la soluzione in una capsula di Petri. Trasferire i segmenti in un nuovo tubo da 15 millilitri riempito con 10 millilitri di PBS sterile e inclinare delicatamente su e giù a uno o due cicli al secondo per due minuti.
Sotto un armadio di biosicurezza, utilizzare una pinza per posizionare i segmenti su una salvietta da laboratorio sterile per asciugarli. Una volta asciugati, tagliare ulteriormente gli spicchi a pezzi. Trasferire i pezzi tagliati usando una pinza in una piastra a sei pozzetti riempita con quattro millilitri di soluzione di digestione preriscaldata per pozzetto.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 50 minuti e agitare delicatamente la piastra manualmente ogni 20 minuti. Quindi, trasferire i pezzi utilizzando una pipetta Pasteur in un tubo conico da 15 millilitri riempito con quattro millilitri di DMEM. Agitare il tubo manualmente a quattro o cinque cicli al secondo per un minuto per ottenere una sospensione a cella singola.
Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il filtrato a 700 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante mediante aspirazione e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di 2% FBS / PBS.
Dopo aver centrifugato la sospensione ancora una volta a 700 g per cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 12 millilitri di terreno di coltura. Infine, seminare la sospensione cellulare in piastre a sei pozzetti. Dopo la dissociazione del mesenchima, i telociti perdono le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare rotonda, e riflettono meno cellule GFP-positive il primo giorno rispetto ai giorni successivi.
Pochi giorni dopo, i telocytes mostrano una morfologia cellulare piccola e allungata con processi cellulari brevi. Dopo sette-10 giorni di semina, i telocytes riacquistano le loro caratteristiche cellulari, mostrando una morfologia cellulare ampia e allungata con lunghi processi citoplasmatici. La citometria a flusso rivela la composizione cellulare.
Nel complesso, il 69% delle cellule isolate era vitale sulla base della colorazione DAPI. E di questi, il 60,9% rappresentava la contaminazione epiteliale e le cellule immunitarie ed endoteliali. La frazione telocitaria si è diffusa sopra 100k e 70k FSC e SSC, rispettivamente, e rappresentava quasi il 10% del mesenchima gated.
L'analisi FACS ha rivelato che il sottogruppo di telociti può essere definito mediante colorazione positiva a CD201 e GP38. L'immunocolorazione del mesenchima coltivato di un giorno utilizzando questi marcatori ha mostrato l'espressione di questi marcatori molecolari, nonostante le cellule non presentino le loro caratteristiche cellulari. Questa procedura si traduce in una sospensione monocellulare praticabile di cellule stromali, che può essere utilizzata non solo per la coltura 2D ma per qualsiasi altra applicazione, come la co-coltura 3D con organoidi o bioprinting.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'isolamento del mesenchima intestinale murino, con un focus sull'estrazione dei telociti. Il metodo mira a migliorare i sistemi di co-coltura con organoidi, fornendo una rappresentazione più accurata dell'ambiente tissutale originale.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- I telociti sono cellule specializzate presenti nel mesenchima intestinale.
- Svolgono un ruolo nelle interazioni tra cellule e nell'omeostasi dei tessuti.
- L'isolamento di telociti vitali è fondamentale per lo studio delle loro funzioni.
- I protocolli esistenti potrebbero non fornire quantità sufficienti di queste cellule.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento del mesenchima intestinale e delle telociti.
- Facilitare lo studio delle interazioni delle telociti in condizioni fisiologiche e patologiche.
- Fornire una fonte di molecole segnali per la crescita ex vivo.
Metodi Utilizzati
- I segmenti intestinali sono stati lavati e tagliati in piccoli pezzi.
- Le cellule sono state dissociate mediante digestione enzimatica e agitazione meccanica.
- La citometria a flusso è stata utilizzata per analizzare la vitalità cellulare e la composizione.
- L'immunomarcatura è stata impiegata per identificare i telociti e valutarne le caratteristiche.
Risultati principali
- Il protocollo ha prodotto un'alta percentuale di telociti vitali.
- La citometria a flusso ha indicato che il 10% delle cellule isolate erano telociti.
- I telociti hanno recuperato la loro morfologia dopo alcuni giorni in coltura.
- L'immunomarcatura ha confermato l'espressione di marcatori specifici nei telociti.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce una fonte valida di telociti per la ricerca.
- I telociti isolati possono essere utilizzati in diverse applicazioni, inclusa la co-coltura di organoidi.
- I risultati migliorano la comprensione del ruolo dei telociti nella biologia intestinale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
L'isolamento efficiente di telociti vitali dal mesenchima intestinale murino consente una modellizzazione avanzata della nicchia delle cellule staminali intestinali e delle interazioni cellula-cellula fondamentali per l'omeostasi tissutale. Questo protocollo supporta sistemi ex vivo ad alta fedeltà, facilitando studi predittivi sulla segnalazione stromale-epiteliale e sulla dinamica dei fattori di crescita. Il metodo migliora la continuità traslazionale dalla biologia della scoperta allo sviluppo di modelli preclinici nei portafogli di ricerca gastrointestinale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei percorsi di segnalazione mediati dai telociti, rilevanti per la regolazione delle cellule staminali intestinali.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo una fonte definita di cellule mesenchimali che sostengono la nicchia.
- Facilita la validazione funzionale degli obiettivi per i fattori stromali che influenzano la proliferazione epiteliale.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce sospensioni cellulari monodimensionali validate, adatte per immunomarcatura quantitativa e citometria a flusso.
- Consente la preparazione riproducibile di popolazioni cellulari mesenchimali per lo sviluppo di saggi di co-coltura.
- Supporta la standardizzazione dei saggi preservando le proprietà antigeniche e funzionali dei telociti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette l'integrazione del mesenchima arricchito in cellule telocitiche in sistemi di co-coltura organoidi per modellare ambienti tissutali nativi.
- Migliora la rilevanza traslazionale consentendo un sostegno agli organoidi indipendente dai fattori di crescita, specchio delle condizioni in vivo.
- Facilita l' avanzamento calibrato sui rischi di modelli preclinici per la ricerca sulle malattie gastrointestinali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo colloca l'isolamento dei telociti come passaggio fondamentale che collega la scoperta iniziale, lo sviluppo di saggi e l'ottimizzazione dei modelli traslazionali nei flussi di lavoro della ricerca gastrointestinale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni strofalo-epiteliali e sul segnale mediato da Wnt.
- Screening: Fornisce sospensioni cellulari quantitative e riproducibili per immunofenotipizzazione e selezione successive.
- Analisi: Permette la quantificazione mediante citofluorimetria e immunomarcatura delle popolazioni di telociti e della loro vitalità.
- Ricerca traslazionale: Allinea i sistemi di co-coltura in vitro all'architettura tissutale in vivo per studi su biomarcatori e meccanismi d'azione.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo riutilizzabile per la generazione di fonti di cellule mesenchimali in diversi programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella modellizzazione della biologia della nicchia intestinale e della segnalazione stromale.
- Valore operativo: Standardizza l'isolamento di telociti vitali e funzionalmente rilevanti per utilizzi di ricerca scalabili.
- Valore strategico: Riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi stromale-epiteliali, sostenendo decisioni informate di tipo go/no-go.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione corretta in base al rischio delle scoperte gastrointestinali e delle risorse precliniche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella dissociazione dei tessuti e nella manipolazione di singole cellule per preservare la vitalità delle telociti.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per la citometria in flusso e l'immunomarcatura per l'identificazione e la quantificazione cellulare.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei passaggi del protocollo per garantire la riproducibilità tra esperimenti.
- Potrebbe richiedere adattamenti per l'uso con diverse fonti tessutali o specie, come indicato dal protocollo.
- Le limitazioni potenziali includono contaminazione da cellule epiteliali e immunitarie, che richiede un'accurata selezione dei marcatori e un'attenta impostazione delle finestre analitiche.
