Name: Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dellorecchio interno aviario (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri i metodi ovo ed ex ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno nel pulcino. Queste tecniche permettono di analizzare la rigenerazione delle cellule ciliate e valutare gli effetti ototossici dei farmaci.

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Riconosciamo con gratitudine il supporto di NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e Royal National Institute for the Deaf. Vorremmo ringraziare Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Siamo grati al supporto di CIFF e EM facility and lab presso NCBS. Ringraziamo Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami per i costrutti Tol2-eGFP e T2TP, e Guy Richardson per l'HCA e l'anticorpo G19 Pcdh15. Siamo grati ai membri di Earlab per il loro costante supporto e prezioso feedback sul protocollo.

I protocolli che coinvolgono l'approvvigionamento, la coltura e l'uso di uova di gallina fecondate ed embrioni non nati sono stati approvati dal Comitato etico animale istituzionale del Centro nazionale per le scienze biologiche, Bangalore, Karnataka.
1. Elettroporazione in ovo di precursori uditivi pulcini
<ol><li>Progettazione e clonazione di sgRNA per il knockout del gene CRISPR/Cas9<ol><li>Per la creazione di knockout genici, gli RNA guida alla progettazione per interrompere le regioni dell'esone del gene, preferibilmente più vicino all'estremità 5' della regione codificante.</li>
		<li>Selezionare i potenziali RNA guida utilizzando uno strumento web CRISPOR23. Impostare i dati del browser su Gallus gallus e la sequenza del motivo adiacente del protospacer (PAM) su 5'- NGG -3'. Il programma determina gli RNA guida dalla sequenza di input e assegna punteggi diversi in base all'attività on-target e off-target. Seleziona le prime quattro guide per ulteriori studi.</li>
		<li>Per la progettazione di oligo specifici del modello per la produzione di RNA guida (g), rimuovere la sequenza PAM (5′- NGG -3′) dall'output dello strumento di progettazione del gRNA. Questo non è necessario per il targeting, ma contiene la sequenza di riconoscimento della scissione Cas9. Sintetizzare due oligo complementari purificati HPLC con sito di restrizione BsmBI ad entrambe le estremità, per ogni potenziale gRNA.</li>
		<li>Clonare la sequenza guida nel frame con un'impalcatura di tracrRNA di un vettore di scelta (qui, pcU6_1sgRNA vettore è stato utilizzato24).</li>
		<li>Sciogliere gli oligonucleotidi sgRNA ad una concentrazione di 100 μM in acqua priva di DNasi/RNasi. Eseguire la ricottura delle due oligoguide senso e antisenso utilizzando un termociclatore con i seguenti parametri: 95 °C per 3 minuti, poi 37 °C per 15 minuti, quindi diminuire a 4 °C.</li>
		<li>Utilizzando tecniche standard di biologia molecolare come descritto in25, impostare la digestione di restrizione degli oligo ricotti e pcU6_1sgRNA vettore di clonazione con enzima BsmBI durante la notte. Impostare la legatura con il vettore pcU6_1sgRNA lineare BsmBI-digerito con gel e gli oligo sgRNA digeriti. Trasformarsi in una cellula competente DH5-alfa e confermare la sequenza del clone ottenuto.</li>
	</ol></li>
	<li>Gestione delle uova e windowing<ol><li>Procurati le uova appena deposte e puliscile pulendole con etanolo al 70% per evitare la contaminazione. Incubare a 37-38 °C, con 45% di umidità per 3,5-4 giorni.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, posizionare l'uovo su un lato per almeno 5 minuti prima di aprire. Ciò consente all'embrione di riposizionarsi nella parte superiore del tuorlo. Utilizzare una pinza per praticare piccoli fori nella parte superiore e un'estremità smussata dell'uovo in modo che un ago da 21 G possa passare attraverso.</li>
		<li>Per evitare danni durante il windowing, rimuovere l'albumina per abbassare l'embrione lontano dal guscio. Per fare ciò, utilizzare una siringa da 5 ml e un ago da 21 G per prelevare con cura 2 ml di albumina da un foro all'estremità smussata dell'uovo. Utilizzare del nastro trasparente per coprire il foro all'estremità smussata.</li>
		<li>Per creare la finestra dell'uovo, applicare del nastro trasparente sulla parte superiore del guscio d'uovo. Tagliare una finestra, lunga circa 2 cm e larga 1,5 cm, usando le forbici a molla ed esporre l'embrione. Utilizzare una pinza per aprire le membrane coriali sovrastanti l'embrione, consentendo l'accesso all'embrione.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmidi a microiniezione<ol><li>Per l'esperimento di knockout genico, preparare due soluzioni: la miscela knock-down contenente la proteina SpCas9 e il plasmide guida - pcU6_1sgRNA, e la miscela plasmidica tracciante di T2K-eGFP (questo è un promotore di ß-actina di pulcino che guida la cassetta GFP circondata dai siti di trasposone di Tol2) insieme al T2TP (la trasposasi Tol2 clonata nel costrutto Tol226,27). Il tracciante viene utilizzato per monitorare l'efficienza dell'elettroporazione.</li>
		<li>Quando si elettroporano più plasmidi, assicurarsi che la concentrazione finale di DNA sia di almeno 4 μg/μL. Mescolare i tre costrutti, plasmide guida - pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP e T2TP, in un rapporto 1:1:1 con 1 μg di proteina SpCas9, 30% di saccarosio e 0,1% di colorante Fast Green in un volume finale di 10 μL.</li>
		<li>Tirare gli aghi per microiniezione da capillari di vetro standard (lunghezza 3 pollici, OD 1,0 mm) utilizzando un estrattore di pipette verticale. Utilizzare una pinza fine per rompere la punta capillare dopo aver tirato per ottenere un diametro della punta di circa 50 μm con un'estremità affusolata.</li>
		<li>Posare gli embrioni a E3.5 sul lato sinistro con la testa rivolta a destra. In questo modo solo la vescicola otica destra è accessibile per la microiniezione. Micro-iniettare la miscela knock-down nella vescicola otica. Iniettare circa un volume di 200 nL di miscela di soluzione di DNA per riempire la vescicola otica.</li>
		<li>Determinare l'efficienza della guida utilizzando un saggio di endonucleasi T728.</li>
	</ol></li>
	<li>Elettroporazione<ol><li>Aggiungere alcune gocce di soluzione salina allo 0,719% sulla parte superiore dell'embrione prima dell'elettroporazione per abbassare la resistenza elettrica e prevenire il surriscaldamento dell'embrione.</li>
		<li>Posizionare l'elettrodo positivo attraverso il foro praticato sul lato smussato dell'uovo quando l'albumina è stata rimossa. Manovra l'elettrodo in modo che sia sotto il tuorlo. Posizionare l'elettrodo negativo sopra l'otocisti riempita.</li>
		<li>Utilizzare l'elettroporazione per trasfettare i plasmidi nelle cellule dell'embrione. Utilizzare un generatore di impulsi quadrato e applicare cinque impulsi di 25 V e 100 ms di durata ciascuno, a 50 ms di distanza. Determinare le condizioni empiricamente in base a una configurazione di elettroporazione individuale.</li>
		<li>Idratare l'embrione dopo l'elettroporazione aggiungendo qualche goccia di soluzione salina allo 0,719%. Per pulire l'albumina denaturata dalla superficie degli elettrodi, sciacquarla accuratamente con acqua distillata. Richiudere l'uovo con nastro trasparente e tornare nell'incubatrice umidificata a 37-38 °C per un'ulteriore incubazione. NOTA: Gli embrioni possono essere coltivati fino alla schiusa dopo l'elettroporazione, tuttavia vi è una forte riduzione della vitalità.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dissezione della papilla basilare
<ol><li>Utilizzare etanolo al 70% per disinfettare il tavolo chirurgico, lo stadio del microscopio e l'area circostante. Il calore o l'alcol sterilizzano le apparecchiature di microdissezione che includono forbici minimamente a molla, micro-curette e due paia di pinze sottili.</li>
	<li>Preparare le seguenti piastre di dissezione: una capsula di Petri di vetro con una base di silicio nero, una capsula di Petri di plastica da 90 mm e una capsula di Petri da 60 mm. Raffreddare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) per le dissezioni.</li>
	<li>Rompere delicatamente l'uovo nella capsula di Petri da 90 mm. Identifica l'orecchio esterno del pulcino. Decapitare l'embrione tagliando il collo appena sotto il livello della mascella inferiore usando le forbici. Trasferire la testina in una capsula di Petri da 60 mm riempita con PBS ghiacciato.</li>
	<li>Orientare l'embrione con la parte superiore del becco rivolta verso lo sperimentatore e tenere il becco usando una delle pinze #5. Raccogli gli occhi usando la seconda pinza #5. Passando da rostrale a caudale, taglia il cranio lungo la sua linea mediana. Estrai il cervello.</li>
	<li>Aggiungi più PBS o HBSS ghiacciato e individua le due strutture lucide, vicino al livello del padiglione auricolare. Questi sono gli otoliti della lagena alla fine del dotto cocleare e si trovano vicino alla linea mediana.</li>
	<li>Tagliare approssimativamente tra le due lagene, e ben sopra e sotto questa regione per isolare due orecchie interne. Sotto l'illuminazione obliqua, visualizza il contorno dell'orecchio interno. Rimuovere il tessuto estraneo e il vestibolo.</li>
	<li>Trasferire la coclea isolata su una piastra di base in silicone nero con PBS ghiacciato. Utilizzando una pinza #5, rimuovere la capsula cocleare cartilaginea per ottenere il dotto cocleare. Individuare lo strato ondulato (tegmentum) del dotto cocleare e rimuovere usando una pinza #55 per esporre la BP. Utilizzando una pinza #55, rimuovere la membrana tettorica per esporre HC e SC.</li>
</ol>3. Coltura di espianti di papilla basilare
<ol><li>Coltura a membrana della BP<ol><li>Prendi una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti e disponi un inserto di membrana di coltura per pozzetto.</li>
		<li>Raccogliere la papilla basilare sezionata (espianto) in una pipetta da 200 μL con 1x tampone HBSS e trasferirla su una membrana. Per evitare che il tessuto si attacchi alla parete della pipetta, aspirare alcuni supporti prima di aspirare il tessuto.</li>
		<li>Orientare l'espianto in modo tale che la papilla basilare sia rivolta verso l'alto, in modo che i capelli e le cellule di supporto siano visibili dall'alto29. Una volta posizionato l'espianto, aspirare lentamente il tampone HBSS dalla superficie della membrana di coltura. In questo processo, l'espianto si attaccherà alla membrana di coltura.</li>
		<li>Aggiungere 1,2 ml di terreno di coltura Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco tra l'inserto della membrana e la parete del pozzo per riempire i pozzetti della piastra a sei pozzetti. Fino a sei espianti possono essere coltivati su una singola membrana di coltura da 30 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Coltura di collagene del dotto cocleare<ol><li>Preparare la miscela di collagene aggiungendo 400 μL di 3 mg/ml di collagene a coda di ratto, 50 μL di 10x DMEM, 30 μL di NaHCO3 al 7,5% e 5 μL di HEPES in una cappa di coltura tissutale.</li>
		<li>Prendi una piastra a quattro pozzetti e aggiungi tre gocce di miscela di collagene in ciascun pozzetto. Trasferire il dotto cocleare sezionato ad ogni goccia di collagene. Incubare la piastra per 10 minuti a 37 °C, 5% CO2 per polimerizzare la matrice di collagene.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento di piccole molecole di colture<ol><li>Preparare terreni di coltura (DMEM, integratore N-2, penicillina) con il modulatore farmacologico o il suo solvente da solo (per l'uso come controllo). Sostituire i terreni di coltura con 700 μL di terreno integrato con l'inibitore. Coltura degli espianti in incubatrice a 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Sostituire il 50% dei terreni di coltura ogni giorno. Dopo un adeguato tempo di incubazione, rimuovere i terreni di coltura e utilizzare gli espianti per i saggi a valle.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imaging e analisi
<ol><li>Analisi immunofluorescente<ol><li>Rimuovere i terreni di coltura dai pozzetti e lavare gli espianti due volte con 1x HBSS. Utilizzando una pipetta, aggiungere 1 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% nel pozzetto e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Rimuovere il PFA e lavare gli espianti tre volte con 1x PBS a temperatura ambiente. Per raccogliere gli espianti dalla membrana di coltura, fare un piccolo taglio attorno alla membrana contenente il pezzo di tessuto usando piccole forbici a molla e trasferire il tessuto insieme alla membrana su una piastra di coltura a 48 pozzetti usando una pinza. NOTA: Se i tessuti galleggiano dopo la fissazione, aspirare con una pipetta da 200 μL e trasferirla su piastre da 48 pozzetti per ulteriori elaborazioni. Evitare il distacco forzato del tessuto dalla membrana.</li>
		<li>Per la coltura di goccioline di collagene, utilizzare una pinza per trasferire l'intera goccia di collagene su una piastra di silicio. Aggiungere 200 μL di 1x PBS e rimuovere il collagene con l'aiuto di una pinza, quindi trasferire il tessuto in una piastra di coltura a 48 pozzetti.</li>
		<li>Permeabilizzare gli espianti con 1 mL di 1x PBS integrato con 0,3% Tween-20 (PBST) per 30 minuti a temperatura ambiente. Incubare gli espianti con 200 μL di tampone bloccante (10% siero di capra + 1% albumina sierica bovina in PBST) per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare gli espianti con 200 μL di soluzione anticorpale primaria (1:300, in tampone bloccante) per una notte a 4 °C. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare accuratamente gli espianti 5 x 20 minuti con PBST.</li>
		<li>Incubare gli espianti con 200 μL di falloidina e soluzione anticorpale secondaria (in tampone bloccante) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. Rimuovere la falloidina e la soluzione anticorpale secondaria e lavare accuratamente gli espianti 5 x 20 minuti con PBST. NOTA: la concentrazione di anticorpi secondari e la lunghezza del lavaggio devono essere determinate per ogni singola applicazione di imaging. Per l'imaging mediante microscopia a super risoluzione, in genere aumentiamo la concentrazione dell'anticorpo secondario da 1:500 a 1:200 e aumentiamo la concentrazione di falloidina da 1:400 a 1:200.</li>
		<li>Incubare gli espianti con una soluzione di DAPI (1:1000 in PBST) per 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione DAPI e lavare gli espianti 3 x 5 minuti con PBST.</li>
		<li>Utilizzare il supporto di montaggio per montare gli espianti su una slitta con la pressione rivolta verso l'alto (contro il coprivetrino). Per l'imaging confocale utilizzare supporti di montaggio antidissolvenza. Lasciare asciugare il supporto di montaggio durante la notte a temperatura ambiente al buio. Visualizzare direttamente l'immagine o conservare i vetrini a 4 °C fino all'imaging.</li>
	</ol></li>
	<li>Fissazione OTOTO per analisi SEM<ol><li>Preparare tutte le soluzioni fresche e maneggiare secondo le linee guida di sicurezza locali. Fissare gli espianti coltivati a membrana (dal punto 4.1.4) in glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,3) con 3 mM CaCl2. Eseguire la fissazione a 4 °C per 24-72 ore con un cambio di fissativo ogni 24 ore.</li>
		<li>Rimuovere il fissativo e lavare il tessuto con cacodilato di sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Correzione secondaria con OsO4 all'1% (diluito da un brodo di OsO 4 al4 % utilizzando tampone cacodilato di sodio 0,1 M) per 1 ora a temperatura ambiente. Eseguire questo e i passaggi successivi fino alla disidratazione in una cappa aspirante.</li>
		<li>Risciacquare con tampone cacodilato di sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Quindi risciacquare in acqua bidistillata o ultrapura 3 x 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Preparare una soluzione allo 0,5% di tiocarboidrazide (TCH) in acqua ultrapura. Agitare a 75 °C per 10 minuti e filtrare la soluzione quando si è raffreddata a temperatura ambiente. NOTA: TCH è estremamente pericoloso. L'uso deve essere approvato dal comitato di sicurezza locale e deve essere prestata attenzione durante la manipolazione.</li>
		<li>Rimuovere l'acqua ultrapura dal campione e aggiungere lo 0,5% di TCH goccia a goccia. Se la soluzione diventa marrone, fermarsi e sciacquare il campione con acqua ultrapura, prima di aggiungere con attenzione la soluzione di TCH allo 0,5%. Una volta che la soluzione è limpida, sostituirla con 0,5% TCH. Incubare a temperatura ambiente per 20 min30,31.</li>
		<li>Risciacquare il campione con acqua ultrapura 3 x 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere i passaggi 4.2.2, 4.2.3 e 4.2.5 altre due volte terminando con l'incubazione di OsO4 seguita dal risciacquo.</li>
		<li>Disidratare i campioni in una serie di etanolo al 100% anidro (EtOH). Incubare prima in ETOH al 25% per 10 minuti, poi al 50% ETOH per 10 minuti, al 75% EtOH per 10 minuti, al 95% ETOH per 10 minuti, prima di incubare per un totale di 3x per 10 minuti ciascuno in ETOH al 100%.</li>
		<li>Eseguire l'essiccazione dei punti critici utilizzando CO2 liquido. Montare immediatamente i campioni su un tronchetto SEM con nastro biadesivo in carbonio. Procedere allo sputter coat per fornire 5-10 nm di rivestimento. Se non si esegue immediatamente l'imaging, conservare i campioni in un essiccatore sotto vuoto.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno interessi concorrenti da rivelare.

Il pulcino è un'aggiunta economica e conveniente agli organismi modello che un laboratorio può utilizzare per la ricerca sull'orecchio interno. I metodi qui descritti sono abitualmente utilizzati nel nostro laboratorio e completano la ricerca in corso nell'orecchio interno dei mammiferi. Nell'ovo l'elettroporazione viene utilizzata per introdurre manipolazioni genetiche nel genoma del pulcino. L'elettroporazione può anche essere usata per introdurre costrutti che codificano proteine fluorescenti mirate a partico...

L'orecchio interno di tutti i vertebrati deriva da un semplice epitelio noto come placode otico 1,2. Ciò darà origine a tutti gli elementi strutturali e ai tipi cellulari necessari per trasdurre le informazioni meccanosensoriali associate all'udito e all'equilibrio della percezione. Le cellule ciliate (HC), il sensore ciliato dell'orecchio interno, sono circondate da cellule di supporto (SC). Gli HC trasmettono informazioni al cervello posteriore uditivo attraverso i neuroni dell'ottavo nervo cranico. Questi sono anche generati dal placode otico3. La trasduzione primaria del suono si ottiene sulla superficie apicale dell'HC uditivo, attraverso un fascio di capelli meccanicamente sensibile4. Questo è mediato attraverso protrusioni modificate a base di actina chiamate stereociglia, che sono disposte in un modello graduato di scala5. Inoltre, un ciglio primario modificato, chiamato kinocilium, organizza la formazione di fasci di capelli ed è adiacente alla fila più alta di stereociglia 6,7,8. L'architettura delle stereociglia è fondamentale per questo ruolo nella conversione di stimoli meccanici derivati dall'energia acustica in segnali neurali elettrici9. Danni all'HC uditivo dovuti all'invecchiamento, all'infezione, al trauma otoacustico o allo shock ototossico possono provocare una perdita parziale o completa dell'udito che, nei mammiferi, è irreversibile10.
Sono state proposte terapie cellulari sostitutive che potrebbero riparare tali danni11,12. L'approccio di questa ricerca è stato quello di comprendere il normale sviluppo della cellula ciliata dei mammiferi e chiedere se i programmi di sviluppo possono essere riavviati in cellule simili a progenitori che possono esistere all'interno dell'orecchio interno13. Un secondo approccio è stato quello di guardare al di fuori dei mammiferi, ai vertebrati non mammiferi in cui avviene una robusta rigenerazione delle cellule ciliate uditive, come gli uccelli14,15. Negli uccelli, la rigenerazione delle cellule ciliate avviene prevalentemente attraverso la de-differenziazione di una cellula di supporto in uno stato simile a un progenitore, seguita da una divisione mitotica asimmetrica per generare una cellula ciliata e una cellula di supporto16. Inoltre, è stata osservata anche la differenziazione diretta di una cellula di supporto per generare una cellula ciliata17.
Mentre i meccanismi dello sviluppo uditivo aviario mostrano somiglianze significative con quello dei mammiferi, ci sono differenze18. La differenziazione di HC e SC nel pulcino BP è evidente dal giorno embrionale (E) 7, diventando più distinta nel tempo. Con E12, è possibile visualizzare una papilla basilare (BP) ben modellata e ben polarizzata, e da E17 si possono vedere cellule ciliate ben sviluppate19. Questi punti temporali forniscono finestre sui meccanismi di differenziazione, pattern e polarità, nonché sulla maturazione delle cellule ciliate. Capire se tali meccanismi sono conservati o divergenti è importante, in quanto forniscono informazioni sulla profonda omologia delle origini delle cellule ciliate meccanosensoriali.
Qui, dimostriamo una serie di tecniche eseguite nelle fasi embrionali iniziali e tardive per studiare i processi cellulari come la proliferazione, la specifica del destino, la differenziazione, il pattern e il mantenimento durante lo sviluppo dell'organo dell'orecchio interno. Questo integra altri protocolli sulla comprensione dello sviluppo dell'orecchio interno nella coltura di espianti20,21,22. Per prima cosa discutiamo l'introduzione di DNA esogeno o RNA nei precursori della BP all'interno dell'otocisti E3.5 utilizzando l'elettroporazione ovo. Sebbene le manipolazioni genetiche possano fornire preziose informazioni, i fenotipi così generati possono essere pleiotropici e di conseguenza confondenti. Ciò è particolarmente vero durante il successivo sviluppo dell'orecchio interno, dove processi fondamentali come il rimodellamento citoscheletrico svolgono molteplici ruoli nella divisione cellulare, nella morfogenesi dei tessuti e nella specializzazione cellulare. Presentiamo protocolli per l'inibizione farmacologica negli espianti in coltura, che offrono vantaggi nel controllo del dosaggio e dei tempi e della durata del trattamento, offrendo una precisa manipolazione spaziotemporale dei meccanismi di sviluppo.
Diversi metodi di coltura degli organi possono essere utilizzati a seconda della durata del trattamento di piccoli inibitori. Qui dimostriamo due metodi di coltura degli organi che consentono approfondimenti sulla morfogenesi epiteliale e sulla specializzazione cellulare. Un metodo per la coltura 3D che utilizza il collagene come matrice per coltivare il dotto cocleare consente una coltura robusta e una visualizzazione dal vivo della BP in via di sviluppo. Per comprendere la formazione di stereociglia, presentiamo un metodo di coltura a membrana tale che il tessuto epiteliale viene coltivato su una matrice rigida che consente alle protrusioni di actina di crescere liberamente. Entrambi i metodi consentono l'elaborazione a valle come l'imaging di cellule vive, l'immunoistochimica, la microscopia elettronica a scansione (SEM), la registrazione cellulare, ecc. Queste tecniche forniscono una tabella di marcia per l'uso efficace del pulcino come sistema modello per comprendere e manipolare lo sviluppo, la maturazione e la rigenerazione dell'epitelio uditivo aviario.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Falloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi V3</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>1081061</td><td>Proteina Cas9 ad alta fedeltà</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>Siero bovino policlonale di coniglio</td></tr><tr><td> Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q12135</td><td></td></tr><tr><td>Collagene I, coda di topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Essiccatore per punti critici Leica EM CPD300</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUY-21 Elettroporatore</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dimetil solfossido (DMSO)</td><td>Microscopio a campo largo Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DM5000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glicemia alta, integratore GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forcipe</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forcipe</td><td>per la scienza</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>FLUOVIEW 3000 Microscopio a scansione laser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide (25 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-Topo IgG Anticorpo secondario, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-Topo IgG Secondario Anticorpo, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra Sterile filtrato</td><td>HiMedia</td><td>RM10701</td> Soluzione <td></td></tr><tr><td>salina bilanciata di Hanks inattivata termicamente (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific 14025092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM980 Airyscan Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Inserto per Colture Cellulari, 30 mm, PTFE idrofilo, 0,4 & micro; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio MVX10</td><td>Anticorpo Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MYO7A</td><td>DSHB</td><td>138-1</td><td>Microscopio da dissezione monoclonale a miosina non convenzionale</td></tr><tr><td>MZ16</td> Supplemento <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 (100X)</td><td>Forbici Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Noyes, 14 cm (5,5' ')</td><td>World Precision Instruments</td><td>501237</td><td></td></tr><tr><td>tetrossido di osmio (4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PC-10 Puller</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcU6_1sgRNA</td><td>Addgene</td><td>92395</td><td>Mini vettore con promotore U6 di pollo modificato</td></tr><tr><td>Penicillina G sale</td> <td>sodicoSigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>SMZ1500 Microscopio da dissezione</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone per cacodilato di sodio,</td><td>microscopia elettronica</td> 0,2 M Scienze <td>11652</td><td></td></tr><tr><td> cloruro</td><td>HiMedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>Sputtre Coater K550X</td><td>Capillari</td> in vetro standard Emitech <td></td><td></td></tr><tr><td>3 pollici, OD 1,0 mm, senza filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Il MERLIN compatto VP</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbobidrazide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L01205</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

metodi ovo ed ex ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

L'orecchio interno percepisce il suono e mantiene l'equilibrio usando la coclea e il vestibolo. Lo fa utilizzando un tipo di cellula meccanosensoriale dedicata nota come cellula ciliata. La ricerca di base nell'orecchio interno ha portato a una profonda comprensione di come funziona la cellula ciliata e di come la disregolazione può portare a perdita dell'udito e vertigini. Per questa ricerca, il topo è stato il sistema modello preminente. Tuttavia, i topi, come tutti i mammiferi, hanno perso la capacità di sostituire le cellule ciliate. Pertanto, quando si cerca di comprendere le terapie cellulari per ripristinare la funzione dell'orecchio interno, studi complementari in altre specie di vertebrati potrebbero fornire ulteriori approfondimenti. L'epitelio uditivo degli uccelli, la papilla basilare (BP), è un foglio di epitelio composto da cellule ciliate meccanosensoriali (HC) intercalate da cellule di supporto (SC). Sebbene l'architettura anatomica della papilla basilare e della coclea dei mammiferi differisca, i meccanismi molecolari dello sviluppo dell'orecchio interno e dell'udito sono simili. Questo rende la papilla basilare un sistema utile non solo per studi comparativi, ma anche per comprendere la rigenerazione. Qui, descriviamo le tecniche di dissezione e manipolazione per l'orecchio interno del pollo. La tecnica mostra metodi di inibizione genetica e di piccole molecole, che offrono un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari dello sviluppo dell'orecchio interno. In questo articolo, discutiamo in ovo tecniche di elettroporazione per perturbare geneticamente la papilla basilare usando delezioni CRIPSR-Cas9, seguite dalla dissezione della papilla basilare. Dimostriamo anche la coltura dell'organo BP e l'uso ottimale delle matrici di coltura, per osservare lo sviluppo dell'epitelio e delle cellule ciliate.

Nella configurazione dell'elettroporazione, il posizionamento degli elettrodi può svolgere un ruolo nel dominio della trasfezione. L'elettrodo positivo è posto sotto il tuorlo e il negativo sopra l'embrione (Figura 1A). Ciò si traduce in una maggiore espressione di GFP in gran parte dell'orecchio interno e di entrambi gli organi vestibolari (Figura 1B) e nella papilla basilare uditiva (Figura 1C, D), confermando la ...

Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell'orecchio interno aviario.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

L'età, l'infezione e i farmaci ototossici possono causare la degenerazione delle cellule ciliate dell'orecchio interno, che in noi porta alla perdita dell'udito. Nei vertebrati non mammiferi, come il pulcino, le cellule ciliate possono essere rigenerate. Le tecniche qui descritte sfruttano l'efficacia in termini di costi del lavoro sugli embrioni di pulcino, la facilità di ottenere embrioni e il buon sviluppo esometrico degli espianti di tessuto.Comprendere lo sviluppo e la rigenerazione dei peli dell'orecchio interno aviario può fornire importanti informazioni sulla perdita dell'udito e sulle potenziali terapie, e la coltura degli espianti può essere importante per valutare gli effetti ototossici di vari farmaci. Prima di iniziare l'esperimento, procurati uova appena deposte e puliscile con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione. Incubare le uova per 3,5-4 giorni, a 37-38 gradi Celsius con il 45% di umidità.Dopo l'incubazione, riposizionare l'embrione sulla parte superiore del tuorlo, posizionando un uovo su un lato per cinque minuti. Quindi, utilizzare una pinza per praticare un piccolo foro nella parte superiore e un'estremità smussata dell'uovo per far passare un ago di calibro 21. Utilizzando una siringa da cinque millilitri e un ago da 21 gauge, rimuovere due millilitri di albumina da un foro all'estremità smussata dell'uovo.Coprire il foro all'estremità smussata con nastro trasparente. Per fare in modo che la finestra dell'uovo applichi il nastro trasparente sulla parte superiore del guscio d'uovo. Tenere gli aghi dalla microiniezione da capillari di vetro standard utilizzando un estrattore di pipette verticale.Dopo aver tirato, rompere la punta capillare utilizzando una pinza fine per ottenere un diametro della punta di circa 50 micrometri con un'estremità affusolata. Per l'esperimento di knockout genico, mescolare i tre costrutti, vale a dire il plasmide guida, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP in un rapporto uno-a-uno-a-uno con un microgrammo di proteina SP Cas9, 30% di saccarosio e 0,1% di colorante verde veloce e un volume finale di 10 microlitri. Durante l'elettropostazione di più plasmidi, assicurarsi che la concentrazione finale di DNA sia di almeno quattro microgrammi per microlitro.Con l'aiuto delle forbici a forbice a molla tagliare intorno a una finestra lunga due centimetri e larga 1,5 centimetri ed esporre l'embrione. Quindi utilizzare una pinza per aprire le membrane coriali sovrastanti l'embrione, consentendo l'accesso all'embrione. Iniettare circa 200 nanolitri di volume di miscela di soluzione di DNA per riempire la vescicola otica.Per determinare l'efficienza dell'RNA guida eseguire un test di endonucleasi T7. Aggiungere lo 0,719% di gocce saline all'embrione per abbassare la resistenza elettrica e prevenire il surriscaldamento. Quindi, posizionare l'elettrodo positivo attraverso il foro praticato sul lato smussato dell'uovo e manovrare l'elettrodo in modo che sia sotto il tuorlo.Posizionare l'elettrodo negativo sopra l'otocisti riempita. Per trasfettare il plasmide nella vescicola otica con elettroporazione, utilizzare un generatore di impulsi quadrati e applicare cinque impulsi di 25 volt per 100 millisecondi ciascuno, a 50 millisecondi di distanza. Determinare empiricamente le condizioni sulla base di una singola configurazione di elettroporazione.Dopo l'elettroporazione, idratare l'embrione aggiungendo alcune gocce di soluzione salina allo 0,719%. Richiudere l'uovo con nastro trasparente e tornare all'incubatore umidificato a 37-38 gradi Celsius per un'ulteriore incubazione. Disinfettare il tavolo chirurgico, lo stadio del microscopio e l'area circostante utilizzando il 70% di etanolo e calore, oppure sterilizzare con alcool l'attrezzatura di micro dissezione, comprese le forbici per arco a molla, il micro curet e due paia di pinze sottili.Preparare le piastre di dissezione tra cui una capsula di Petri di vetro con una base di silicone nero, una capsula di Petri di plastica da 90 millimetri e una capsula di Petri da 60 millimetri. Tenere il PBS refrigerato o la soluzione salina bilanciata di Hanks, nota anche come HBSS, pronta per le dissezioni. Rompere delicatamente l'uovo nella capsula di Petri da 90 millimetri.Quindi identificare l'orecchio esterno del pulcino e trasferire la testa su una capsula di Petri da 60 millimetri piena di PBS ghiacciato. Quindi, orientare l'embrione con la parte superiore del becco rivolta verso l'interno e tenere il becco usando una delle pinze numero cinque. Raccogli gli occhi usando la seconda pinza numero cinque.Quindi, dal rostrale al caudale, taglia lungo il cranio lungo la sua linea mediana e scava il cervello. Aggiungi più PBS ghiacciato, o HBSS, e individua i due otoliti della lagena come strutture lucide alla fine del dotto cocleare e vicino alla linea mediana. Per isolare due orecchie interne, tagliare tra le due lagene e ben sopra e sotto la regione.Quindi sotto illuminazione obliqua visualizzare il contorno dell'orecchio interno e rimuovere il tessuto estraneo e il vestibolo. Trasferire la coclea isolata su una piastra di base in silicone nero con PBS ghiacciato. Rimuovere la capsula cocleare cartilaginea usando una pinza numero cinque per ottenere il dotto cocleare.Quindi individuare lo strato ondulato o il tegmentum del dotto cocleare e rimuoverlo usando una pinza numero 55 per esporre la papilla basilare o BP. Quindi, rimuovere la membrana tettorica per esporre le cellule ciliate e le cellule di supporto usando il forcipe numero 55. Per la coltura a membrana della papilla basilare, prendere una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti e disporre un inserto di membrana di coltura per pozzetto. Aspirare alcuni supporti in una pipetta da 200 microlitri, quindi aspirare l'espianto di papilla basilare sezionato con un tampone X HBSS.Trasferire l'espianto su una membrana e orientarlo in modo che la papilla basilare sia rivolta verso l'alto e che i capelli e le cellule di supporto siano visibili dall'alto. Una volta posizionato l'espianto, aspirare lentamente il tampone HBSS dalla superficie della membrana di coltura. In questo processo l'espianto si attaccherà alla membrana di coltura.Riempire il pozzetto della piastra a sei pozzetti aggiungendo 1,2 millilitri di terreno di coltura modificato di dulbecco, o terreno di coltura DMEM, tra l'inserto della membrana e la parete del pozzo. Per preparare la coltura di collagene del dotto cocleare aggiungere tre gocce di miscela di collagene appena preparata in ciascun pozzetto di una piastra a quattro pozzetti e trasferire il dotto cocleare sezionato a ciascuna goccia di collagene. Incubare la piastra per 10 minuti a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica per curare la matrice di collagene.Per un trattamento a piccole molecole delle colture, sostituire i terreni di coltura con 700 microlitri di terreno integrato con il modulatore farmacologico, come la penicillina, e incubare le piastre come dimostrato in precedenza. Sostituire il 50% dei terreni di coltura ogni giorno. Dopo un adeguato tempo di incubazione, rimuovere i terreni di coltura e utilizzare gli espianti per i saggi a valle.Nella configurazione dell'elettroporazione, il corretto posizionamento dell'elettrodo ha comportato una maggiore espressione di GFP nell'orecchio interno in entrambi gli organi vestibolari e una papilla basilare uditiva che conferma la trasfezione. CRISPR Cas9 ha mediato il knockout del gene Atoh1 nell'orecchio interno, con conseguente perdita di cellule ciliate. Il knockout del gene Atoh1 tramite ovo-elettroporazione seguita da incubazione fino a E10 ha mostrato uno sviluppo ridotto delle cellule ciliate rispetto al controllo plasmidico vuoto.Sebbene l'elettroporazione sia a mosaico, le cellule elettroporate di controllo sono state in grado di formare cellule ciliate. Nei campioni elettroporati di gRNA Atoh1, le cellule positive alla proteina fluorescente verde non hanno mai mostrato i marcatori dello sviluppo delle cellule ciliate. La coltura d'organo della papilla basilare in una matrice 3D, come collagene e colorazione con anticorpi contro l'antigene delle cellule ciliate, ha fornito l'eccellente conservazione della morfologia dei tessuti per un massimo di cinque giorni.L'organizzazione delle cellule ciliate e delle cellule di supporto è stata mantenuta in queste condizioni di coltura. Le colture di organi su una membrana possono essere mantenute fino a cinque giorni mantenendo l'integrità del fascio di capelli. Questo può essere visto nell'immagine rappresentativa dalla localizzazione della proteina tip link, protocaderina 15.Per studiare lo sviluppo del fascio di capelli, l'imaging ad alta risoluzione, come la microscopia a super risoluzione o la microscopia elettronica a scansione, può fornire ulteriori informazioni. Le condizioni sterili devono essere mantenute durante tutta la procedura. Durante l'elettropore, assicurarsi che gli embrioni non si secchino.Quando si titolano gli inibitori farmacologici, si può ridurre la concentrazione per superare qualsiasi letalità. Sia gli embrioni che gli espianti possono essere prelevati per esperimenti di imaging. Eseguendo la microscopizzazione video in tempo reale o la microscopia elettronica confocale a luce statica, come mostrato nel protocollo.Data la facilità e l'accessibilità dell'utilizzo di espianti di orecchio interno di pulcino, possiamo utilizzare il mezzo attraverso lo screening di prova per identificare nuove molecole essenziali per la rigenerazione delle cellule ciliate.

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Abbiamo usato tecniche standard di risposta uditiva del tronco cerebrale (ABR) e le abbiamo applicate ai polli da cova, un modello aviario precoce per la funzione uditiva. Il protocollo delinea in dettaglio le tecniche di preparazione degli animali e di acquisizione ABR, con passaggi che potrebbero tradursi in altri modelli aviari o roditori.

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Questo protocollo, destinato agli utenti inesperti del tessuto dell'orecchio interno del topo, descrive in dettaglio i passaggi per l'elaborazione dell'orecchio interno del topo in diverse fasi di sviluppo per l'immunocolorazione della sezione.

Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

Scopri i metodi ovo ed ex ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno nel pulcino. Queste tecniche permettono di analizzare la rigenerazione delle cellule ciliate e valutare gli effetti ototossici dei farmaci.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

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