Sonda β-galattosidasi associata alla senescenza fluorescente Far-Red per l'identificazione e l'arricchimento delle cellule tumorali senescenti mediante citometria a flusso

Il nostro protocollo di citometria a flusso multiparametrico consente una rilevazione rapida e migliorata della senescenza indotta dalla terapia nelle cellule tumorali, che è una condizione di studio in corso nella biologia e nella terapia del cancro. Il nostro test di senescenza con citometria a flusso è più rapido rispetto ai test basati sulla microscopia esistenti. Usiamo due marcatori, invece di uno solo, per identificare le cellule senescenti, migliorando l'affidabilità del test.

Le cellule possono essere co-colorate con anticorpi fluorescenti per rilevare ulteriori bersagli di interesse. La selezione della citometria a flusso può essere utilizzata per arricchire popolazioni di cellule senescenti per l'analisi a valle. Il test può rilevare cellule senescenti in linee cellulari tumorali in coltura o in interi campioni tumorali dopo una leggera dissociazione.

Prima di tentare questa tecnica, è importante avere familiarità con le procedure operative generali del citometro a flusso utilizzato. Si prega di consultare il testo per le specifiche raccomandate del citometro a flusso. Un giorno prima dell'induzione della senescenza da parte di farmaci, raccogliere la coltura della linea cellulare tumorale con 0,25% di tripsina EDTA.

Posizionare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti per attivare la tripsina e staccare il monostrato cellulare. Quando il monostrato si è visibilmente staccato, neutralizzare la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura completo. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico sterile.

Contare le cellule utilizzando il metodo emocitometrico standard e registrare le cellule per millilitro. Celle a piastre da 10 a 10 volte 10 alla terza cella per centimetro quadrato in una piastra di coltura di plastica standard a sei pozzetti. Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e umidità.

Il giorno successivo, trattare le cellule con l'agente di interesse che induce la senescenza, come l'etoposide. Quindi incubare per quattro giorni per consentire l'inizio della senescenza. Esaminare le cellule ogni giorno al microscopio ottico per i cambiamenti morfologici previsti.

Dopo l'inizio della senescenza, raccogliere le cellule aggiungendo tripsina EDTA per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule sono dissociate in sospensione, neutralizzare la tripsina con un volume uguale di mezzo completo. Trasferire ogni pozzetto di sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,7 millilitri.

Contare nuovamente le cellule e distribuire un numero uguale di cellule per campione in una nuova serie di provette. Centrifugare i tubi per cinque minuti a 1.000 g a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante. In primo luogo, regolare il pH lisosomiale dei campioni di cellule coltivate aggiungendo una soluzione di una bafilomicina micromolare A in DMEM al pellet cellulare ad una concentrazione di una volta 10 alla sesta cellula per millilitro e pipetta da miscelare.

Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius su un rotatore a bassa velocità. Quindi, per colorare la beta-galattosidasi associata alla senescenza, aggiungere la soluzione madre DDAOG a 10 microgrammi per millilitro ai campioni senza lavare. Posizionare su un rotatore per 60 minuti al riparo dalla luce diretta.

Come prima, centrifugare i tubi, rimuovere il surnatante e lavare il pellet con un millilitro di ghiaccio freddo 0,5% BSA in PBS. Quindi aggiungere 300 microlitri di soluzione diluita di Calcein Violet 450 AM ai pellet di cellule lavate. Incubare per 15 minuti sul ghiaccio al buio.

Trasferire i campioni di cellule in provette compatibili con strumenti di citometria a flusso. Nel software di acquisizione dati, aprire un istogramma del canale viola e un canale rosso lontano rispetto al dot plot del canale verde. Avviare l'acquisizione dei dati del citometro a bassa velocità di aspirazione e posizionare i campioni di controllo positivi colorati con DDAOG sulla porta di aspirazione.

Iniziare ad acquisire dati di esempio. Regolare le tensioni del canale in modo tale che oltre il 90% degli eventi siano contenuti all'interno di ciascun grafico. Quando tutte le impostazioni sono ottimali, registrare 10.000 eventi per campione.

Posizionare i campioni di controllo solo del veicolo colorati con DDAOG sulla porta di aspirazione. Avviare l'acquisizione dei dati e registrare 10.000 eventi per campione. Cerca un aumento dell'autofluorescenza, o AF, e del segnale DDAO-galattoside rispetto al controllo positivo.

Salvare i dati campione in formato file fcs ed esportare i file su un computer workstation dotato di software di analisi della citometria a flusso. Utilizzando il software di analisi dei dati di citometria, caricare i file di dati fcs per tutti i campioni acquisiti. Innanzitutto, per accedere alle celle vitali, fare doppio clic sui dati di esempio per il controllo solo veicolo per aprire la finestra dei dati.

Visualizza i dati come istogramma del canale viola. Le cellule vitali colorate, colorate con CV 450, si basano sulla loro fluorescenza più luminosa rispetto alle cellule morte. Disegna un cancello usando lo strumento Istogramma a cancello singolo per includere solo le celle vitali.

Assegna un nome al cancello Viable. Trascinate quindi la porta Viable sugli altri campioni di cella dalla finestra di layout di esempio per applicare la porta in modo uniforme. Aprire la finestra Layout.

Nella finestra Layout, visualizzare tutti i campioni come istogrammi del canale viola. Verificare che il gating cellulare vitale sia appropriato per tutti i campioni. In caso contrario, regolare se necessario.

Quindi, per accedere alle celle senescenti, fare doppio clic sui dati delle celle vitali recintate per il controllo solo del veicolo per aprire la finestra dei dati. Quindi visualizzare i dati come un dot plot per il canale rosso lontano rispetto al canale verde. Disegna un cancello usando lo strumento Rectangle Gating per includere meno del 5% delle celle DDAO-positive e AF-positive dal quadrante in alto a destra.

Assegna un nome alla porta come Senescente. Quindi trascinate il cancello Senescente sul sottoinsieme praticabile di tutti i campioni dalla finestra Layout di esempio per applicare il gate in modo uniforme. Nella finestra Layout, trascinare e rilasciare tutti i sottoinsiemi di celle validi.

Visualizza tutti i campioni validi come grafici a punti del canale rosso rispetto a quelli verdi e osserva i risultati. Assicurarsi che il cancello senescente sia visibile su tutte le piazzole e che il cancello per i comandi solo del veicolo mostri meno del 5% di celle senescenti. L'analisi è ora completa.

I dati possono ora essere esportati a piacere in formato grafico e tabellare. Rispetto alle cellule non trattate, le cellule di melanoma senescenti B16-F10 indotte dall'etoposide hanno mostrato una morfologia allargata e una colorazione blu dovuta alla scissione di X-gal da parte di un'elevata beta-galattosidasi associata alla senescenza. La colorazione delle cellule trattate con etoposide con fluorescente C12FDG o DDAOG ha dimostrato modelli di colorazione e variazioni di intensità comparabili a X-gal.

Tuttavia, è stato dimostrato che l'autofluorescenza cellulare che si sovrappone all'emissione verde di C12FDG si accumula nelle cellule senescenti non colorate. Al contrario, l'autofluorescenza era tipicamente trascurabile nell'intervallo di emissione rosso lontano di DDAOG. Qui sono mostrate le impostazioni di acquisizione dei dati del citometro a flusso per grafici a dispersione, microsfere di calibrazione fluorescenti arcobaleno commerciali a cinque picchi e dati di fluorescenza a canale singolo da cellule colorate.

I dati del saggio di senescenza con citometro a flusso DDAOG per le cellule di melanoma B16-F10 hanno mostrato che la senescenza indotta dalla terapia, o TIS, indotta dall'etoposide si è verificata nel 35% delle cellule vitali e l'agente senolitico ABT-263 ha quasi eliminato le cellule TIS. Nelle cellule tumorali polmonari A549, TIS indotta da bleomicina nel 66% delle cellule vitali e ABT-263 hanno ridotto la percentuale a 15. ABT-263 da solo non era tossico per le cellule proliferanti non trattate.

In un test di co-colorazione degli anticorpi, un istogramma dei dati del canale PE ha mostrato che il 42% delle cellule trattate con etoposide erano positive per il marcatore di senescenza DPPP4-positivo. Inoltre, la visualizzazione con grafici a punti bidimensionali ha indicato che il 44% delle cellule trattate con etoposide era doppiamente positivo per DDAOG e DPP4 rispetto al 4% delle cellule solo veicolo. La fissazione delle cellule colorate DDAOG è stata successivamente valutata.

Rispetto ai campioni di controllo non fissati, i campioni fissi hanno mostrato uno sfondo leggermente più alto nelle cellule non trattate con una percentuale più elevata di cellule che hanno ottenuto un punteggio senescente nelle cellule trattate con BLM. Questo effetto è stato osservato anche in campioni fissi conservati durante la notte e per una settimana a quattro gradi Celsius. Viene mostrato lo smistamento citometrico a flusso e la validazione di popolazioni cellulari senescenti arricchite mediante marcatori morfologici e di proliferazione.

Le cellule senescenti ordinate mostravano una morfologia allargata, come previsto, visualizzata colorando l'actina con falloidina fluorescente. Una riduzione del segnale per il marcatore di proliferazione Ki67 è stata osservata anche dalla colorazione immunofluorescente. Infine, è stata valutata la quantificazione della senescenza nei tumori trattati con farmaci chemioterapici.

La colorazione X-gal nei tessuti era relativamente debole, ma la colorazione blu era evidente nei tumori trattati con doxorubicina o doxorubicina liposomiale pegilata, in particolare nei tumori che hanno anche ottenuto un punteggio positivo per la senescenza mediante test di flusso DDAO-galattoside. Come previsto, i tumori solo salini hanno mostrato una senescenza trascurabile. Qui, come con qualsiasi test di cellule vive, i passaggi del protocollo devono essere eseguiti in modo efficiente, ma delicatamente.

Procedure di colorazione prolungate o incubazioni oltre i tempi indicati dovrebbero essere evitate. Se le cellule senescenti sono ordinate citometricamente a flusso, possono essere reinserite in coltura per i saggi immunologici, o lisate, ed elaborate per l'analisi omica, compresa la trascrittomica o la proteomica. Questa tecnica ha permesso al nostro laboratorio e ad altri di identificare nuove caratteristiche delle cellule tumorali senescenti, tra cui la quantificazione del danno al DNA, l'espressione proteica e i cambiamenti nel metabolismo.