Colture organotipiche di espianti retinici da scimmia macaco

Il modello retinico dei primati stabilito in questo studio offre lo studio del meccanismo globale e dello sviluppo terapeutico del deterioramento retinico cGMP-PKG dipendente. Questo modello individuale di primate non umano riserva la conferma del tessuto retinico e le interazioni intercellulari che consentono una migliore simulazione delle condizioni in vivo. Riduce anche l'uso animale e riduce la durata sperimentale.

Fornire un approccio sperimentale di controllo per studiare lo sviluppo o la degenerazione della retina. Iniziare la preparazione degli espianti retinici lavando i bulbi oculari isolati dai macachi selvatici con 10 millilitri di iodio povidone al 5% per 30 secondi. Per evitare la contaminazione batterica, immergere i bulbi oculari in una soluzione di streptomicina PBS al 5% di penicillina per un minuto prima dell'incubazione in 10 millilitri di terreno R16 per cinque minuti.

Quindi immergere i bulbi oculari in 10 millilitri di soluzione proteica Ace-K preriscaldata a 37 gradi Celsius e incubata per due minuti. Eseguire la successiva incubazione in 10 millilitri di una a una soluzione di siero bovino fetale R16 più per cinque minuti. Dare un lavaggio finale in 10 millilitri di R16 fresco.

Una volta fatto, separare la sclera, la cornea, l'iride, il cristallino e il corpo vitreo. Quindi tagliare la retina da quattro lati con pinzette e forbici. Quindi, utilizzare una lama sottile da quattro millilitri per tagliare l'espianto retinico a 1,5 millimetri dal lato nasale, quattro millimetri dal lato temporale e due millimetri dai lati superiore e inferiore della testa del nervo ottico.

Quindi usando una lama sottile di sei millimetri tagliare il lato centrale dell'espianto retinico contenente il disco ottico e la macula. Utilizzando un pipet largo, tirare l'espianto di retina contenente la retina e la coroide e posizionarlo al centro dell'inserto con il fotorecettore rivolto verso l'alto. Immergere completamente la retina in un millilitro del mezzo completo sulla piastra sotto la membrana.

Coltivare gli espianti retinici e metterli in un incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica umidificata al 5%. Somministrare il trattamento di concentrazione del farmaco appropriato per espianti per quattro giorni. Utilizzare almeno tre espianti per condizione di trattamento e utilizzare gli espianti senza il farmaco come controllo positivo.

Per il fissaggio e la criosezione, trattare gli espianti retinici con un millilitro di aldeide paraforme per 45 minuti. Dopo un breve risciacquo con un millilitro di PBS incubare in serie gli espianti in 10% di saccarosio per 10 minuti, 20% di saccarosio per 20 minuti e 30% di saccarosio per 30 minuti. Tagliare gli espianti retinici in modo uniforme con quattro quadranti nella periferia e sei millimetri al centro.

Quindi trasferire gli espianti retinici in una scatola di latta di circa 1,5 per 1,5 per 1,5 centimetri con un mezzo di incorporamento del composto di temperatura di taglio ottimale che copre l'espianto. Immediatamente, congelare le sezioni di tessuto in azoto liquido e metterle in un frigorifero a 20 gradi per la conservazione. Quindi, tagliare l'agar in un piccolo blocco contenente il campione di tessuto.

Sezionare i blocchi in blocchi da 10 micrometri e posizionare le sezioni su vetrini da microscopio ad adesione usando una spazzola morbida. Quindi asciugare le sezioni per 45 minuti a 40 gradi Celsius e conservarle a meno 80 gradi Celsius fino all'uso. Per la colorazione ciclica con guanosina monofosfato o cGMP, disegnare un anello idrofobo attorno alle sezioni retiniche essiccate con una penna bloccante liquida e coprire i campioni.

Immergere i vetrini in 200 microlitri di 0,3% PBS e Triton-X100 o PBST per 10 minuti seguiti da un trattamento di un'ora in 200 microlitri di soluzione bloccante a temperatura ambiente. Quindi, incubare il vetrino del campione durante la notte con i 200 microlitri di anticorpo primario preparato nella soluzione bloccante a quattro gradi Celsius e sciacquarlo tre volte con PBS per 10 minuti. Incubare il vetrino in 200 microlitri di anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo tre lavaggi di PBS per 10 minuti, coprire i campioni con un mezzo di montaggio antisbiadimento contenente DAPI e conservare a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti prima dell'imaging. Asciugare il vetrino a temperatura ambiente per 15 minuti e disegnare un anello barriera idrorepellente attorno al campione di tessuto retinico con una penna bloccante liquida. Dopo l'incubazione con 40 millilitri di PBS per 15 minuti trattare le sezioni con 42 millilitri di tris-buffer molare 0,05 o TBS a 37 gradi Celsius.

Aspirare il TBS, incubare i campioni con sei microlitri di proteinasi K per cinque minuti e lavare i vetrini tre volte con PBS per cinque minuti ciascuno. Esporre i vetrini a 40 millilitri di soluzione di acido acetico etanolo nel chaplin. Coprirlo con un foglio trasparente e incubare a meno 20 gradi Celsius per cinque minuti.

Lavare i vetrini tre volte con TBS per cinque minuti ogni volta. Esporre i vetrini a 200-300 microlitri di soluzione bloccante o 1% BSA e incubarli in una camera di umidità per un'ora. A circa 130 microlitri di soluzione rossa TMR per vetrino e dopo un'ora, somministrare due lavaggi da 200 microlitri di PBS per cinque minuti ciascuno.

Posizionare i vetrini di copertura contenenti da una a due gocce di mezzo di montaggio antidissolvenza con DAPI sui campioni e incubare i vetrini a quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti prima dell'imaging. Dopo la colorazione sequenziale con tunnel e cGMP procedere alla microscopia a luce e fluorescenza regolando i parametri della telecamera. Cattura le immagini di quattro campi da ogni sezione utilizzando il software con una fotocamera digitale con ingrandimento 20x.

Ottieni immagini rappresentative dalle aree centrali della retina utilizzando DAPI, EGFP e TMR con scansione z-stack e un intervallo di un micrometro e opzionale a 1.251 micrometri. Negli espianti retinici trattati con diverse concentrazioni degli inibitori della PDE6 Zaprinast il numero di cellule tunnel e cGMP positive è stato fortemente aumentato nello strato nucleare esterno rispetto al gruppo di controllo. L'alta percentuale di cellule positive al tunnel ha suggerito che l'aumento dell'attività del cGMP può migliorare la degenerazione delle cellule retiniche indotta prima del nido e l'accumulo di cGMP svolge un ruolo nella degenerazione dei fotorecettori.

La preparazione dell'espianto deve essere eseguita il prima possibile. Op animale spargere cinque e qualsiasi accumulo perché migliora la sopravvivenza cellulare e migliora lo stato di fibra di serie stack bulk. In misura massima visibile il vitreo deve essere pulito con steroidi.

Evitare di contattare gli strati di fibre nervose retiniche durante il trasferimento di espianti retinici per prevenire lesioni cellulari meccaniche. Si prega di prendere nota, per emettere un trasferimento regolare di espianti retinici agli inserti di coltura l'animale può essere pre-immerso in qualcosa per mantenerlo umido prima di trasferire i tessuti retinici. Inoltre, l'intero processo deve essere eseguito nell'atmosfera steroidea per evitare la contaminazione durante il processo.