Name: Valutazione del danno termico da craniotomia robotizzata per la chirurgia della finestra cranica nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Impara la craniotomia robotizzata per finestre craniche nei topi transgenici. Questo metodo riduce il danno termico cerebrale e standardizza la procedura chirurgica per l'imaging intravitale.

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Questo studio è stato supportato in parte dai Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) e GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona) e dal Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) dal Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service degli Stati Uniti (USA). Inoltre, questo lavoro è stato anche supportato in parte dal National Institute of Health, dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) e dal National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona/Kirsch). Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto Grant No. GRANT12635723. Qualsiasi opinione, risultato, conclusione o raccomandazione espressa in questo materiale è quella degli autori e non riflette necessariamente le opinioni della National Science Foundation.

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<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Augustinaite, S., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signal+imaging+and+targeted+injections+through+a+chronic+cranial+window+of+a+head-fixed+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100779(2021).</li>
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<li>Kunori, N., Takashima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+cranial+window+using+a+collagen+membrane+for+chronic+voltage-sensitive+dye+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging.</a> Micromachines. 10 (11), 789(2019).</li>
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<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818(2016).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Sundaram, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+brain+permeant+fluorescent+molecule+and+visualization+of+Abeta+parenchymal+plaques%2C+using+real-time+multiphoton+imaging+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice.</a> Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).</li>
<li>Spires, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+abnormalities+in+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice+demonstrated+by+gene+transfer+and+intravital+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).</li>
<li>Price, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+large-scale+mosaic+imaging+using+multiphoton+microscopy+to+characterize+transgenic+mouse+models+of+human+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders.</a> Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).</li>
<li>Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cerebral+amyloid+angiopathy+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+using+in+vivo+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).</li>
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<li>Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cell+function+through+optical+imaging%3A+a+review+highlighting+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models.</a> Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).</li>
<li>Courtin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+mechanism+for+motivational+control+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A neuronal mechanism for motivational control of behavior.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).</li>
<li>Cramer, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+the+looking+glass%3A+A+review+of+cranial+window+technology+for+optical+access+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100(2021).</li>
<li>Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+inflammatory+response+and+fibrous+tissue+remodeling+around+intracortical+implants%3A+An+in+vivo+two-photon+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study.</a> Biomaterials. 195, 111-123 (2019).</li>
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<li>Eriksson, A. R., Albrektsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+threshold+levels+for+heat-induced+bone+tissue+injury%3A+a+vital-microscopic+study+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Prosthetic+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit.</a> The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).</li>
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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da segnalare. I contenuti non rappresentano le opinioni del Dipartimento degli affari dei veterani degli Stati Uniti, del National Institutes of Health o del governo degli Stati Uniti.

L'uso del colorante EB e dell'imaging è semplice, rapido e utile per valutare il danno vascolare nel cervello per nuovi metodi e tecniche. Sia che si utilizzi un robot chirurgico o che si confermino i metodi attualmente eseguiti in laboratorio, è importante convalidare i metodi chirurgici per isolare gli effetti dei trattamenti sperimentali rispetto all'impatto chirurgico e migliorare il benessere degli animali. Una configurazione a termocoppia è utile anche per valutare i metodi di perforazione per garantire che non si ...

Le finestre craniche sono diventate onnipresenti nei campi delle neuroscienze, dell'ingegneria neurale e della biologia per consentire la visualizzazione diretta e l'imaging della corteccia negli animali viventi 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . La potente combinazione di topi transgenici e imaging multifotonico ha fornito informazioni estremamente preziose sull'attività dei circuiti e altre intuizioni biologiche nel cervello in vivo 12,13,14,15,16,17,18. I microscopi miniaturizzati montati sul cranio hanno ulteriormente esteso queste capacità per consentire registrazioni in animali svegli e in movimento libero19. Il processo di creazione di una finestra cranica richiede una perforazione elettrica per assottigliare o rimuovere completamente l'osso cranico per produrre craniotomie abbastanza grandi da fissare un pezzo di vetro trasparente sopra la corteccia20. Anche il polidimetilsilossano (PDMS) e altri polimeri sono stati testati come materiali cranici per finestre 9,21. In definitiva, la finestra cranica ideale è quella che non altera o interferisce con la normale attività endogena sottostante. Tuttavia, è comunemente accettato che la perforazione della finestra cranica aggrava il tessuto sottostante, portando a danni al cervello, interruzione dell'ambiente e influenzando le meningi fino al punto di occludere la profondità di imaging multifotonico22. La neuroinfiammazione risultante ha una vasta gamma di effetti che vanno dalla permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB), all'attivazione e al reclutamento delle cellule gliali intorno al sito dell'impianto23. Pertanto, caratterizzare metodi di perforazione della finestra cranica più sicuri e riproducibili è fondamentale per una qualità di imaging costante e per ridurre i fattori confondenti.
Mentre si presta attenzione a ridurre al minimo il trauma al tessuto sottostante, l'atto di perforare l'osso ha il potenziale di causare perturbazioni sia termiche che meccaniche al cervello24,25. Il trauma meccanico dovuto alla penetrazione accidentale del trapano nella dura può ulteriormente indurre vari gradi di lesioni corticali24. In uno studio di Shoffstall et al.25, il calore della perforazione ossea ha provocato un aumento della permeabilità alla BBB, come indicato dalla presenza di colorante Evans Blue (EB) nel parenchima cerebrale 25. Il colorante EB, iniettato per via endovenosa, si lega all'albumina circolante nel sangue e quindi normalmente non attraversa una BBB sana in concentrazioni apprezzabili. Di conseguenza, il colorante EB è comunemente usato come marcatore sensibile della permeabilità alla BBB26,27. Mentre il loro studio non ha misurato direttamente l'impatto della permeabilità della BEE sulle successive sequele biologiche in studio, studi precedenti hanno correlato la permeabilità della BBB a una maggiore risposta neuroinfiammatoria ai microelettrodi cronicamente impiantati e alle alterazioni della funzione motoria28.
A seconda degli obiettivi dello studio, l'entità del danno termico e meccanico può contribuire a una fonte di errore sperimentale, influenzando negativamente il rigore e la riproducibilità dello studio. Esistono dozzine di metodi citati per la produzione di finestre craniche, ognuno dei quali utilizza diverse attrezzature di perforazione, velocità, tecniche e utenti 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 hanno riferito che la variazione osservata nei risultati del riscaldamento è stata attribuita alla variabilità della forza applicata del trapano, della velocità di avanzamento e dell'angolo di applicazione, tra gli altri aspetti che non possono essere controllati quando si perfora a mano 25. Si ritiene che i sistemi di perforazione automatizzati e altre apparecchiature stereotassiche possano migliorare la riproducibilità e la coerenza dei risultati, ma gli studi sui metodi pubblicati non hanno valutato rigorosamente la temperatura o la permeabilità alla BEE come uno dei risultati. Pertanto, vi è la necessità di metodi più riproducibili e applicati in modo coerente per produrre finestre craniche, nonché metodi rigorosamente applicati per valutare l'impatto della perforazione della finestra cranica sul tessuto neurale sottostante.
L'obiettivo di questo studio è determinare e sviluppare metodi di perforazione coerenti e sicuri per le finestre craniche. La dimensione della craniotomia per l'installazione della finestra cranica è significativamente più grande delle craniotomie standard per i microelettrodi impiantati al cervello. Tali craniotomie non possono essere completate con un singolo foro di bava quando si utilizza l'attrezzatura standard, introducendo così una maggiore variabilità della tecnica interchirurgica quando eseguita a mano20. I robot di perforazione chirurgica sono stati introdotti sul campo, ma non sono stati ampiamente adottati 1,6,29. L'automazione della perforazione offre il controllo sulle variabili che contribuiscono alla variazione osservata da prova a prova, suggerendo che l'uso dell'attrezzatura può ridurre gli effetti inter- e intra-chirurgici. Ciò è di particolare interesse data la difficoltà aggiuntiva della craniotomia più grande necessaria per il posizionamento della finestra cranica. Mentre si potrebbe presumere che ci siano chiari benefici per il controllo fornito dall'automazione della perforazione, c'è stata poca valutazione dell'implementazione di queste attrezzature. Sebbene non siano state osservate lesioni visibili5, si desidera il test di sensibilità più elevato utilizzando EB.
Qui, la permeabilità alla BBB viene misurata utilizzando un robot di perforazione chirurgica disponibile in commercio con il relativo software, che consente la programmazione delle coordinate stereotassiche, la pianificazione / mappatura della craniotomia e una selezione di stili di perforazione ("punto per punto" vs "orizzontale"), riferendosi al percorso instradato della punta del trapano. Inizialmente, vengono perforati otto punti "seme" (Figura 1A), che delineano la finestra cranica. Da qui, lo spazio tra i semi viene ritagliato utilizzando il metodo di perforazione "punto per punto" o "orizzontale". "Point-by-point" esegue tagli di fori pilota verticali (simili a una pressa per trapano CNC), mentre "orizzontale" esegue tagli orizzontali lungo la circonferenza della finestra cranica che delineano il foro (simile a un router CNC). Il risultato per entrambi i metodi è un pezzo di cranio che può essere rimosso per rivelare la finestra cranica. Per isolare i danni da perforazione, la finestra cranica non viene rimossa fisicamente, in modo da evitare ulteriori danni. Una combinazione di colorante EB accoppiato con imaging fluorescente viene utilizzata per misurare la permeabilità alla BBB dopo aver eseguito craniotomie nei topi e una termocoppia inserita viene utilizzata per misurare direttamente la temperatura della superficie cerebrale durante la perforazione (Figura 1B, C). Osservazioni precedenti hanno indicato che la perforazione pulsata on/off con intervalli di 2 s era sufficiente per mitigare il riscaldamento del trapano25, e quindi è incorporata nell'approccio sperimentale per il robot chirurgico.
L'intento del lavoro presentato è quello di dimostrare i metodi di valutazione del danno termico da perforazione craniotomia. Mentre i metodi sono presentati nel contesto della perforazione automatizzata, tali metodi possono essere applicati anche a schemi di perforazione manuale. Questi metodi possono essere utilizzati per convalidare l'uso di attrezzature e / o schemi di perforazione prima di adottare come procedura standard.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64188/64188fig01.jpg"> Figura 1: Schema sperimentale della pipeline . Schema che dimostra il processo che gli animali sono stati sottoposti per la quantificazione dell'EB dopo la procedura della finestra cranica. (A) Configurazione schematica del mouse con telaio stereotassico e trapano robotico chirurgico. Un esempio di finestra cranica è mostrato sopra la corteccia motoria con punti seme (verde) e punti di bordo (blu). (B) La configurazione della perfusione include l'iniezione di 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) in tutto l'animale per rimuovere il sangue, seguita dall'estrazione del cervello. (C) Il cervello viene quindi messo nella camera del sistema di imaging fluorescente EB per condurre l'imaging fluorescente sul colorante blu Evans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64188/64188fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato Tipo: Reagente</td><td>VWR</td><td>MRGF-6235</td><td>per diluizione blu Evans</td></tr><tr><td>Aura Software Tipo: Strumenti</td><td>spettrali Imaging</td><td></td><td>Software di elaborazione delle immagini ad accesso aperto per i sistemi di imaging Lumina</td></tr><tr><td>Buprenorfina Tipo: Farmaco</td><td>proveniente da Animal Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punta da trapano in carburo, 0,6 mm (trapano robotico) Tipo: Strumento</td><td>Stoelting</td><td>58640-1</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen Tipo: Farmaco</td><td>proveniente da Animal Facility Cefazolin</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tipo: Farmaco</td><td>proveniente da Animal Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue Dye Tipo: Reagente</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>Ricostituito in 1x soluzione salina tamponata con fosfato</td></tr><tr><td>Isoflurano Tipo: Farmaco</td><td>Proveniente da Animal Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II Tipo: Strumento</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td>IVIS Lumina III attualmente in sostituzione di Lumina II sul mercato</td></tr><tr><td>Termometro linearizzatore Jenco Tipo: Strumento</td><td>Jenco</td><td>765JF</td><td>Per la configurazione della termocoppia</td></tr><tr><td>Ketamina Tipo: Farmaco</td><td>proveniente da Animal Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LivingImage Tipo: Strumento</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Software per IVIS Lumina III</td></tr><tr><td>Marcaine Tipo: Farmaco</td><td>proveniente da Animal Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurostar Software Tipo: Strumento</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Viene fornito con l'acquisto di robot chirurgici</td></tr><tr><td>Physiosuite con MouseSTAT&reg; Pulsossimetro & Cardiofrequenzimetro Tipo: Strumento</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-03</td><td>Utilizzato per monitorare i parametri vitali</td></tr><tr><td>PrismPlus topi Tipo: Animal</td><td>Jackson Labortory</td><td>031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Maschio, ~8 mesi</td><td>Animali utilizzati per lo studio</td></tr><tr><td>Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments Tipo: Tool</td><td>Stoelting</td><td>58640</td><td>Trapano robotico principale con telaio stereotassico</td></tr><tr><td>Termocoppia Tipo: Strumento</td><td>TC Direct</td><td>206-557</td><td>Per la configurazione della termocoppia</td></tr><tr><td>USB-6008 I/O multifunzione DAQ Tipo:</td><td>Strumento National Instruments</td><td>USB-6008</td><td>Per la configurazione della termocoppia</td></tr><tr><td>Xilazina Tipo: Farmaco</td><td>proveniente da Animal Facility</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del danno termico da craniotomia robotizzata per la chirurgia della finestra cranica nei topi

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

La chirurgia della finestra cranica consente l'imaging del tessuto cerebrale nei topi vivi con l'uso di multifotoni o altre tecniche di imaging intravitale. Tuttavia, quando si esegue qualsiasi craniotomia a mano, c'è spesso un danno termico al tessuto cerebrale, che è intrinsecamente variabile da chirurgia a chirurgia e può dipendere dalla tecnica del singolo chirurgo. L'implementazione di un robot chirurgico può standardizzare la chirurgia e portare a una diminuzione del danno termico associato alla chirurgia. In questo studio, sono stati testati tre metodi di perforazione robotizzata per valutare il danno termico: orizzontale, punto per punto e pulsato punto per punto. La perforazione orizzontale utilizza uno schema di perforazione continua, mentre punta a punto perfora diversi fori che circondano la finestra cranica. Il punto per punto pulsato aggiunge uno schema di perforazione "2 s on, 2 s off" per consentire il raffreddamento tra una perforazione e l'altra. L'imaging fluorescente del colorante Evans Blue (EB) iniettato per via endovenosa misura i danni al tessuto cerebrale, mentre una termocoppia posizionata sotto il sito di perforazione misura il danno termico. I risultati della termocoppia indicano una significativa diminuzione della variazione di temperatura nel gruppo pulsato punto per punto (6,90 °C ± 1,35 °C) rispetto ai gruppi orizzontale (16,66 °C ± 2,08 °C) e punto per punto (18,69 °C ± 1,75 °C). Allo stesso modo, il gruppo pulsato punto per punto ha anche mostrato una presenza significativamente inferiore di EB dopo la perforazione della finestra cranica rispetto al metodo orizzontale, indicando meno danni ai vasi sanguigni nel cervello. Pertanto, un metodo di perforazione pulsato punto per punto sembra essere lo schema ottimale per ridurre il danno termico. Un trapano robotizzato è uno strumento utile per ridurre al minimo l'allenamento, la variabilità e ridurre i danni termici. Con l'uso crescente dell'imaging multifotonico nei laboratori di ricerca, è importante migliorare il rigore e la riproducibilità dei risultati. I metodi affrontati qui aiuteranno a informare gli altri su come utilizzare meglio questi robot chirurgici per far progredire ulteriormente il campo.

Valutazione termica Il potenziale di danno termico è stato valutato misurando la variazione di temperatura rispetto al basale dovuta alla perforazione utilizzando metodi orizzontali (Figura 2A), punto per punto (Figura 2B) e pulsati punto per punto (Figura 2C). La Figura 2D mostra la configurazione sperimentale per ottenere dati termici. Per la valutazione termica è stata utilizzata ...

Le finestre craniche sono diventate una tecnica chirurgica implementata ovunque per consentire l'imaging intravitale nei topi transgenici. Questo protocollo descrive l'uso di un robot chirurgico che esegue la perforazione ossea semi-automatica delle finestre craniche e può aiutare a ridurre la variabilità da chirurgo a chirurgo e parzialmente mitigare il danno termico della barriera emato-encefalica.

Valutazione del danno termico da craniotomia robotizzata per la chirurgia della finestra cranica nei topi

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

Questo protocollo fornisce un metodo per valutare il danno vascolare a seguito della perforazione della finestra cranica. Un robot chirurgico offre una migliore coerenza tra le procedure, riducendo al contempo la quantità di formazione per apprendere la tecnica. Durante questa procedura, abbiamo utilizzato iniezioni craniche che possono essere molto impegnative.Raccomandiamo una formazione approfondita per chi è nuovo alla tecnica. Per iniziare, impostare il sistema come descritto nel manoscritto ed eseguire la calibrazione del telaio seguendo il manuale del robot chirurgico. Passare al software chirurgico e creare un nuovo progetto selezionando Inizia con un progetto pulito.Quindi impostare il soggetto come mouse nella parte superiore per designare l'atlante delle coordinate di foratura da utilizzare. Quindi, selezionare avvia nuovo progetto e fare clic su pianificazione nell'angolo in basso a sinistra per passare alla schermata di pianificazione delle coordinate di foratura. Creare lo schema di perforazione per la tecnica della finestra cranica da eseguire facendo clic in un punto qualsiasi dell'atlante stereotassico.Usa bregma come riferimento e inserisci le coordinate per la corteccia motoria come descritto nel manoscritto. Premere Invio sulla tastiera per aggiornare le coordinate selezionate. Fare clic su Destinazione archivio per salvare queste coordinate e immettere un nome appropriato.Quindi fare clic sul pulsante Sposta in basso a sinistra per tornare alla schermata principale di foratura. Fare clic su Strumenti, quindi su Proietta e salva con l'opzione Salva con nome per riutilizzare questo progetto modello per progetti successivi, poiché manterrà automaticamente le coordinate di foratura. In primo luogo, somministrare iniezioni sottocutanee di antibiotici, cefazolina, analgesico, carprofene e buprenorfina al topo anestetizzato.Quindi, posizionare il mouse su una piastra riscaldante e mantenere l'anestesia con isoflurano dallo 0,5% al 2% tramite inalazione attraverso un cono nasale. Montare l'animale sul telaio stereotassico del robot chirurgico utilizzando le barre auricolari in dotazione e valutare regolarmente i parametri vitali e la profondità dell'anestetico tramite pizzico del piede. Quindi strofinare l'area chirurgica con clorexidina gluconato e isopropanolo al 70% per la sterilizzazione.E posizionare un involucro di plastica sterile sul mouse e sul telaio stereotassico per mantenere la sterilità durante l'intervento chirurgico. Utilizzando una lama di bisturi, eseguire un'incisione di un pollice sulla linea mediana del cranio, iniziando dalla parte posteriore degli occhi, asciugare e pulire il cranio usando perossido di idrogeno al 3% con applicatori con punta di cotone. Per preparare la coda per una facile iniezione, pulire con alcool.Usando il pollice e l'indice, piega la coda per esporre la vena della coda sopra la curva della coda. Inserire la siringa parallelamente alla vena e iniettare lentamente il volume di blu di Evans. Una volta iniettato, attendere cinque minuti per consentire al blu di Evans di circolare.Un'iniezione di successo viene immediatamente verificata quando le estremità del topo e la finestra chirurgica diventano blu. Una volta che il cranio è pronto per la perforazione, tornare al software chirurgico e fare clic sugli strumenti. Quindi seleziona progetto, seguito da nuovo, e seleziona un progetto modello dal menu a discesa per scegliere un progetto modello.Selezionare gli stessi elementi del protocollo. Fare clic su pianificazione, quindi selezionare i parametri di foratura da trasferire a questo nuovo progetto e fare clic su Avvia nuovo progetto. Quindi, correggete il trapano e la cornice per tenere conto dell'inclinazione e del ridimensionamento del cranio del topo dell'animale corrente facendo clic su strumenti e selezionate correggi per inclinazione e ridimensionamento per aprire la schermata delle correzioni.Nella parte superiore dello schermo, assicurarsi che il trapano sia attivo facendo clic sul pulsante di perforazione rosso chiaro Dopo aver eseguito la correzione, uscire dalla finestra di correzione facendo clic su Chiudi nella parte inferiore centrale dello schermo e passare alla schermata di foratura facendo clic su Strumenti e quindi selezionando Foratura per iniziare la procedura di foratura. Confermare il sito di perforazione selezionando la finestra della forma craniotomia nella parte superiore dello schermo, quindi visualizzando i dettagli del target di perforazione nel menu a discesa sottostante. Per eseguire la perforazione manuale a impulsi, disattivare la funzione di arresto automatico deselezionando la casella di controllo accanto all'opzione di arresto automatico nel menu del trapano, che consente di controllare quando il trapano è spento per il pulsante.Nel menu del trapano, selezionate 100 micrometri come avanzamento della profondità del trapano. Aprire il menu del sito di perforazione e passare al primo sito di perforazione. Utilizzare il pulsante avanzato o i comandi manuali per abbassare il trapano fino a quando non tocca il cranio e premere la superficie impostata una volta che la punta del trapano raggiunge il cranio.Una volta pronto, fare clic su Avanzate per iniziare la perforazione. E dopo che il trapano è avanzato di 100 micrometri, premere Esc due volte per fermare il trapano. Dopo due secondi, ripeti questo ciclo per la profondità del cranio.Per ogni punto di partenza e spigolo durante la perforazione, assicurarsi di impostare la dura utilizzando il pulsante nel menu della foratura una volta raggiunta la dura. Misura i cambiamenti di temperatura del cranio e del cervello utilizzando una termocoppia in combinazione con i tre diversi schemi di perforazione collegati a un sistema di acquisizione dati, che consente di leggere la misurazione in MATLAB. Montare un topo cadavere sul telaio stereotassico e sul trapano robotizzato.Praticare manualmente un piccolo foro a circa due millimetri di distanza da dove la finestra cranica verrà fatta sul lato del cranio, che consente di far scivolare la termocoppia nella posizione sotto la quale si verifica la perforazione della finestra cranica. Iniziare il processo di perforazione per ciascuno dei tre schemi come dimostrato in precedenza, con conseguenti picchi dovuti al cambiamento di temperatura, indicando il riscaldamento che si verifica vicino al cervello mentre il trapano attraversa il cranio. Il potenziale di danno termico è stato valutato misurando la variazione di temperatura rispetto al basale dovuta alla perforazione utilizzando metodi orizzontali, punto per punto e pulsati punto per punto.Sia gli schemi di perforazione orizzontale che punto per punto mostrano differenze non significative nei cambiamenti termici. Tuttavia, il passaggio a un metodo pulsato punto per punto ha comportato un riscaldamento significativamente inferiore del cervello rispetto alla perforazione orizzontale e punto per punto. La perforazione orizzontale dei bordi ha richiesto 300 secondi, mentre la perforazione punto per punto dei bordi ha richiesto 200 secondi.Il metodo a impulsi ha richiesto più tempo con la semina e la perforazione dei bordi, impiegando circa 500 secondi ciascuno. Per monitorare la relazione tra lo schema di perforazione e il danno vascolare, è stata eseguita l'imaging fluorescente blu Evans. La perforazione orizzontale e il taglio punto per punto sono stati considerati dannosi per la vascolarizzazione nel cervello.Rispetto ai gruppi di controllo, il metodo pulsato punto per punto aveva meno danni localizzati nel punto di semina e bordo, ma aveva ancora una presenza blu di Evans visibile all'interno della finestra cranica. Durante la perforazione manuale è fondamentale controllare la craniotomia dopo aver avanzato il trapano per assicurarsi che la dura non venga violata. Oltre alle finestre craniche, un robot chirurgico può essere utilizzato per craniotomie standard per migliorare i risultati chirurgici.

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Questo video e protocollo dimostrano come impiantare una copertura in vetro finestra cranica nei roditori. Queste preparazioni possono essere utilizzate per cronica in vivo a due fotoni di imaging della neocorteccia su scale temporali di mesi. Può essere utilizzato anche per altri tipi di imaging, tra cui l'imaging ottico del segnale intrinseco.

Un Chirurgia Procedura Craniotomia per l&#39;imaging cerebrale cronica

Laterale fluido percussioni (LFP), un modello stabilito di lesioni cerebrali traumatiche nei topi, è dimostrato. LFP soddisfa tre criteri principali per i modelli animali: rilevanza validità, l'affidabilità e la clinica. La procedura, che consiste di craniotomia chirurgica, la fissazione del mozzo seguita da induzione di lesioni, con conseguente lesioni focali e diffuse, è descritto.

Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Questo video mostra la procedura per indurre una lesione cerebrale traumatica a cranio aperto in un topo praticando un'incisione del cranio sulla linea mediana, perforando il cranio e rimuovendo il lembo osseo per esporre la corteccia cerebrale e applicando un'alta pressione per indurre un trauma. La ferita viene quindi suturata per preparare il modello murino per gli esperimenti successivi.

Generazione di un modello murino di lesione cerebrale traumatica utilizzando una sonda impattante

Trauma acuto cerebrale è una lesione grave che non ha alcun trattamento adeguato ad oggi. La microscopia multiphoton permette lo studio longitudinalmente il processo di sviluppo acuto trauma cerebrale e sondando strategie terapeutiche nei roditori. Due modelli di trauma cerebrale acuto studiato con in vivo a due fotoni di imaging del cervello sono dimostrate in questo protocollo.

Acuta cerebrale Trauma nei topi Seguito By longitudinale a due fotoni di imaging

Le lesioni cerebrali traumatiche (TBI) rimangono un serio problema di salute. Utilizzando il modello di chirurgia a impatto corticale controllato, possono essere eseguite ricerche sugli effetti del trauma cranico e sui possibili metodi di trattamento.

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

Questo protocollo dimostra le metodologie per un modello murino di lesioni cerebrali traumatiche a cranio aperto e il trapianto di cellule derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane coltivate nel sito della lesione. Test comportamentali e istologici dei risultati di queste procedure sono descritti anche in breve.

Modello di impatto corticale controllato di lesioni cerebrali del topo con trapianto terapeutico di cellule neurali derivate da cellule staminali indotte dall'uomo

Qui descriviamo un protocollo per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche murine attraverso un impatto corticale controllato a testa aperta.

Modello Murine di impatto corticale controllato per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche

Questo studio dimostra la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica ripetitiva ai topi e l'impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale di un EGFP espresso da neuroni utilizzando la microscopia a due fotoni.

Imaging intravitale dell'espressione di proteine fluorescenti nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e una finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni

Questo protocollo presenta un modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva (rmTBI) indotta tramite un metodo di lesione cranica chiusa (CHI). L'approccio presenta una finestra cranica assottigliata e una percussione fluida per ridurre l'infiammazione comunemente causata dall'esposizione alle meningi, insieme a una migliore riproducibilità e accuratezza nella modellazione dell'rmTBI nei roditori.

Modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva che incorpora finestra cranica assottigliata e percussione fluida

Questo protocollo descrive un metodo chirurgico a due fasi per creare una grande finestra cranica richiudibile e conservatrice della durata nei topi. Questa tecnica consente registrazioni elettrofisiologiche croniche e multimodali da reti cerebrali profonde distribuite, come la Default Mode Network, nell'arco di diverse settimane.

Protocollo chirurgico per una grande finestra cranica richiudibile che consente registrazioni elettrofisiologiche longitudinali e multimodali della rete in modalità predefinita del mouse

Impara la craniotomia robotizzata per finestre craniche nei topi transgenici. Questo metodo riduce il danno termico cerebrale e standardizza la procedura chirurgica per l'imaging intravitale.

Valutazione del danno termico da craniotomia robotizzata per la chirurgia della finestra cranica nei topi

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