Name: Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante allinterno di embrioni di zebrafish intatti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri un metodo rapido ed economico per monitorare la metilazione della citosina in embrioni di zebrafish intatti. Questa tecnica automatizzata rileva alterazioni epigenetiche indotte da esposizione chimica in modo flessibile.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il supporto alla ricerca è stato fornito da una UCR Graduate Division Fellowship a SAB, una NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) a SAB e una sovvenzione del National Institutes of Health (R01ES027576) e USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) a DCV.

Gli allevatori adulti sono stati gestiti e trattati in conformità con un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (# 20180063) presso l'Università della California, Riverside.
1. Raccolta di embrioni di zebrafish ed esposizione chimica
<ol><li>Aggiungi trappole da riproduzione in vasca alle vasche contenenti pesci zebra maschi e femmine adulti sessualmente maturi e riproduttivamente vitali. Aggiungere almeno tre trappole per serbatoio da 6 litri almeno 12 ore prima della raccolta a ~ 9:00 AM, che è il tempo approssimativo di fecondazione e deposizione delle uova all'interno dei serbatoi.</li>
	<li>Preparare una nuova soluzione di esposizione la mattina della raccolta. La soluzione di esposizione viene preparata utilizzando una pipetta da 5 ml e aggiungendo 5,0 ml di acqua di sistema priva di particelle a una capsula di Petri di vetro da 60 mm.</li>
	<li>Quindi, utilizzare una pipetta microcapillare di vetro da 10 μL per trasferire 10 μL di veicolo (dimetilsolfossido, o DMSO) o soluzione madre chimica all'acqua di sistema nel piatto di vetro.</li>
	<li>Ruotare la capsula di Petri di vetro per assicurarsi che la soluzione madre si dissolva. Aggiungere altri 5,0 ml di acqua di sistema alla capsula di Petri di vetro. Ruotare la capsula di Petri di vetro per omogeneizzare la soluzione di esposizione.</li>
	<li>Ripetere l'operazione per ciascun gruppo di trattamento in repliche di quattro per ottenere quattro repliche per trattamento.</li>
	<li>Dopo aver preparato le soluzioni di esposizione, tappare le stoviglie di vetro con coperchi di vetro per ridurre al minimo l'evaporazione.</li>
	<li>Durante la rimozione delle trappole di allevamento da ciascun serbatoio, lasciare con attenzione che l'acqua all'interno di ciascuna trappola defluisca nel serbatoio prima di rimuoverla dai serbatoi. Assicurati che le trappole rimangano sul lato destro verso l'alto.</li>
	<li>Trasferire le trappole di riproduzione nel lavandino del laboratorio e sciacquarle usando una bottiglia di spruzzo riempita con acqua di osmosi inversa (RO) in una rete da pesca precedentemente imbevuta di candeggina al 10% e risciacquata con acqua. Risciacquare gli embrioni fino a quando tutti i detriti sono stati eliminati e rimangono solo embrioni puliti.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni dalla rete da pesca utilizzando una bottiglia di spruzzo riempita d'acqua RO in una capsula di Petri di plastica da 100 mm. Ordinare in modo casuale 50 embrioni vivi a 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) e rimuovere l'acqua RO in eccesso.</li>
	<li>Utilizzando una microspatola, inserire gli embrioni ordinati nella soluzione di trattamento. Tutti gli embrioni devono trovarsi all'interno del veicolo o della soluzione di trattamento non prima delle 9:45. Ruotare i piatti di vetro per assicurarsi che gli embrioni siano uniformemente rivestiti all'interno della soluzione di trattamento.</li>
	<li>Dopo aver impostato quattro piatti replicati (N = 50 per replica) per ciascun gruppo di trattamento, posizionare il coperchio di vetro sopra i piatti esposti e trasferire tutti i piatti in un incubatore a temperatura controllata impostato a 28 °C fino a 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf o 10 hpf.</li>
	<li>Preparare paraformaldeide fresca al 4% (PFA) almeno 4 ore prima della fine dell'esposizione e conservare a 4 °C.<ol><li>Accendere la piastra riscaldante a 115 °C, produrre 20 ml di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (2 ml di 10x PBS + 18 ml di acqua RO) in una provetta da centrifuga da 50 ml e pesare 800 mg di paraformaldeide.</li>
		<li>All'interno di una cappa chimica, trasferire 1x soluzione PBS in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml, aggiungere 800 mg di paraformaldeide e quindi aggiungere 2 μL di NaOH 10 N. Posizionare un termometro all'interno del pallone, posizionare il pallone sulla piastra riscaldante e osservare la temperatura mentre si mescola.</li>
		<li>Quando la temperatura raggiunge 62-65 °Crimuovere il 4% di PFA dalla piastra riscaldante e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente (RT). Conservare il PFA al 4% a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Una volta terminata la durata dell'esposizione, rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e trasferire tutti gli embrioni viventi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Aspirare la soluzione di esposizione residua utilizzando una pipetta da 1 ml. Non aspirare embrioni.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di PFA refrigerato al 4% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e mescolare gli embrioni in PFA al 4% capovolgendo più volte. Lasciare che gli embrioni si fissino in PFA al 4% durante la notte. NOTA: Non è consigliabile consentire agli embrioni di rimanere in PFA per più di 12 ore.</li>
</ol>2. Dechorionazione degli embrioni
<ol><li>Il giorno seguente, aspirare il PFA al 4%, risospendere gli embrioni in 1x PBS e pipettare delicatamente su e giù per 30 s. Se necessario, interrompere il protocollo in questa fase e conservare gli embrioni in 1x PBS a 4 °C per un massimo di 48 ore.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, trasferire con cura gli embrioni fissi in una piastra di vetro riempita d'acqua RO e ruotare delicatamente per 30 s. Ripetere questo passaggio ancora una volta.</li>
	<li>Utilizzare aghi per siringhe con ingrandimento 5,0x utilizzando uno stereomicroscopio standard per dechorionare manualmente tutti gli embrioni. Fallo usando la punta dell'ago per perforare il corion e staccarlo delicatamente dal tuorlo e dalla massa cellulare4.</li>
	<li>Una volta che gli embrioni sono stati dechorionati, utilizzare una pipetta microcapillare di vetro per trasferire fino a 25 embrioni intatti in un cesto di immunochimica (IHC) e posizionare il cestello IHC in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare l'acqua RO da ciascun pozzetto.</li>
</ol>3. Immunoistochimica con anticorpi specifici per 5-mC
<ol><li>Risospendere gli embrioni in 500 μL di tampone bloccante (1x PBST + 2% siero di pecora + 2 mg/ml di albumina sierica bovina) per pozzetto e avvolgere la piastra con parafilm e foglio di alluminio per proteggerli dalla luce. Incubare a 4 °C per 4 ore su uno shaker orbitale (100 rpm).</li>
	<li>Rimuovere l'involucro del parafilm e l'alluminio e utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare il tampone di blocco da ciascun pozzetto. Sostituirlo con 500 μL di una diluizione 1:100 di anticorpo monoclonale di topo anti-5-mC nel tampone di blocco. Incubare tutti gli embrioni con anticorpi primari ad eccezione di un sottogruppo di embrioni di controllo del veicolo che saranno incubati con il tampone di blocco per tenere conto del rumore di fondo. Fare attenzione a non interrompere l'integrità degli embrioni, né ad aspirare gli embrioni durante questa fase.</li>
	<li>Riavvolgere la piastra in parafilm e foglio di alluminio e lasciare che la piastra incubi a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale (100 rpm).</li>
	<li>Il giorno seguente, rimuovere la soluzione anticorpale primaria da ciascun pozzetto e sostituirla con 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Lavare ogni pozzetto tre volte con 1x PBST per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale (100 rpm).</li>
	<li>Sostituire 1x PBST con una diluizione 1:500 di anticorpo IgG anti-topo di capra nel tampone bloccante e incubare tutti gli embrioni con l'anticorpo secondario. Lasciare incubare la piastra a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale (100 rpm).</li>
	<li>Il giorno seguente, rimuovere l'anticorpo secondario e lavare la soluzione residua tre volte con 1x PBST per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale (100 rpm). NOTA: Il protocollo può essere interrotto qui per un massimo di 48 ore se i cestelli IHC sono conservati in pozzi puliti riempiti con 1x PBS.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare 1x PBST da ciascun pozzetto e posizionare il cestello IHC in una capsula di Petri di vetro riempita con acqua RO. Sotto uno stereomicroscopio standard, ordinare casualmente embrioni intatti in una piastra da 96 pozzetti, ottenendo un embrione per pozzetto.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da 1 ml, rimuovere tutta l'acqua RO dai singoli pozzetti e sostituirla con 200 μL di 1x PBS. Centrifugare la piastra per 3 minuti a 1 x g.</li>
</ol>4. Imaging automatizzato di embrioni all'interno di piastre a 96 pozzetti
<ol><li>Immagina gli embrioni con un obiettivo 2x sotto luce trasmessa e FITC utilizzando un sistema di screening ad alto contenuto (Table of Materials). NOTA: Un'immagine fluorescente di ciascun embrione è stata catturata automaticamente utilizzando l'ingrandimento sopra menzionato e un filtro FITC19.<ol><li>Selezionare Autofocus per assicurarsi che la messa a fuoco della fotocamera sia sul fondo della piastra e sfalsata dallo spessore inferiore.</li>
		<li>Selezionare una lunghezza d'onda FITC con una durata di esposizione di 100 ms e impostare l'autofocus su laser con offset Z. Osservare e confermare la corretta acquisizione dell'immagine in diversi pozzetti prima di iniziare l'acquisizione della piastra. NOTA: Lo strumento acquisisce automaticamente le immagini da tutti i pozzetti selezionati contenenti embrioni. Una piastra da 96 pozzetti richiedeva circa 30 minuti per l'acquisizione delle immagini e l'archiviazione dei dati. Per tutta la durata del periodo di acquisizione, la temperatura interna all'interno del sistema di imaging è stata mantenuta a RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo l'acquisizione delle immagini, eseguire l'analisi dei dati utilizzando il sistema di screening ad alto contenuto e una procedura di analisi delle immagini automatizzata personalizzata. Selezionare ogni embrione sulla piastra a 96 pozzetti da analizzare per l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza. NOTA: l'analisi includeva la fornitura di immagini contenenti sovrapposizioni di punti dati dell'analisi.</li>
	<li>Quindi, tabulare i punti dati ed esportarli dal sistema di screening ad alto contenuto andando sotto Misura e selezionando Apri registro dati in un foglio di calcolo. Le parti di acquisizione delle lastre e di analisi dei dati sono illustrate nella Figura 1.</li>
</ol>5. Analisi dei dati
<ol><li>Caricare il foglio di calcolo esportato in un programma per computer in cui il pacchetto deployer (dplyr) viene utilizzato per ordinare, sommare i dati per ciascun pozzetto e filtrare in base al numero di pozzo. Il pacchetto writexl viene quindi utilizzato per esportare i dati riepilogati in un foglio di calcolo. Il codice del programma 5mC è mostrato nel file supplementare 1.</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, H. -Y., Xiong, J., Qi, B. -L., Feng, Y. -Q., Yuan, B. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li>
<li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078(2022).</li>
<li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179(2021).</li>
<li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699(2019).</li>
<li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li>
<li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands%2C+cytosine+methylation%2C+and+the+metabolome+in+driving+tris%281%2C3-dichloro-2-propyl%29phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science & Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li>
<li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li>
<li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li>
<li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li>
<li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation-mediated+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li>
<li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li>
<li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li>
<li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li>
<li>Yuan, B. -F., Feng, Y. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li>
<li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.

Durante questo protocollo, ci sono alcuni passaggi che sono critici. In primo luogo, quando si dechorionano gli embrioni, è importante puntare l'ago lontano dal tessuto dell'embrione / sacco vitellino / massa cellulare, poiché queste porzioni dell'embrione in via di sviluppo sono molto fragili e facili da perforare. In secondo luogo, quando si trasferiscono embrioni marcati a singoli pozzetti, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni in quanto aderiranno a una pipetta di plastica. In terzo luogo, quand...

Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina 1,2. Il tris(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (TDCIPP) è un ritardante di fiamma ampiamente utilizzato negli Stati Uniti che ha precedentemente dimostrato di alterare la traiettoria della metilazione della citosina dopo l'esposizione embrionale precoce da 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) fino alla gastrulazione precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . All'interno dei vertebrati, il 5-mC e i suoi derivati modificati sono fondamentali per regolare lo sviluppo embrionale precoce9. La fecondazione di un embrione innesca la demetilazione del DNA parentale, seguita dalla degradazione dell'mRNA materno, dall'attivazione del genoma zigotico e dalla rimetilazione del genoma zigotico9. I processi biologicamente rilevanti che utilizzano la metilazione della citosina includono la modificazione degli istoni, il reclutamento del macchinario trascrizionale, la metilazione dell'RNA, la riprogrammazione epigenetica e la determinazione della struttura della cromatina10,11. La metilazione della citosina è conservata anche tra le specie di vertebrati, sottolineando l'importanza di comprendere e studiare come la metilazione aberrante della citosina possa influenzare la traiettoria di sviluppo di un organismo11. Inoltre, lo sviluppo in utero è sensibile all'esposizione materna e ha il potenziale di causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari12,13,14.
Lunghi tratti di coppie citosina-guanina, o isole CpG, sono stati i principali focolai dei ricercatori che mirano a caratterizzare la dinamica della metilazione della citosina attraverso il genoma15,16,17. Le strategie basate sul bisolfito come il sequenziamento del bisolfito dell'intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito rappresentano il gold standard per interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi. Tuttavia, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, in quanto tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. Inoltre, gli approcci basati sul sequenziamento non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale, che è fondamentale per comprendere i tipi di cellule potenzialmente interessate e le aree all'interno di un embrione in via di sviluppo. Allo stesso modo, i saggi globali di metilazione del DNA come l'analisi di restrizione dipendente dalla metilazione, i saggi immunologici legati all'enzima 5-mC (ELISA) e la cromatografia-spettrometria di massa liquida (LC-MS) 5-metil-2'-deossicitidina (5-mC) si basano su omogenati cellulari o tissutali e, come tali, precludono la capacità di monitorare la localizzazione e l'entità della metilazione della citosina nello spazio e nel tempo all'interno di campioni intatti12,18.
A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere ampiamente utilizzati come modelli fisiologicamente intatti per scoprire percorsi mediati da xenobiotici che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi disponibili in commercio specifici per 5-mC, il protocollo seguente descrive una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero (IHC), l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica.
Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a monitorare 5-mC all'interno di embrioni di zebrafish intatti. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

<table><tbody><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>540225</td><td></td></tr><tr><td>10-&micro; Pipetta microcapillare in vetro L</td><td>Fisher Scientific</td><td>211762B</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri in plastica da 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08757100D</td><td></td></tr><tr><td>10x soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 1 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690032</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di Erlenmeyer da 250 ml</td><td>Fisher Scientific FB501250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13690033</td><td></td></tr><tr><td>piastre di Petri in vetro da 60 mm con coperchi</td><td>Fisher Scientific</td><td>08747A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>720089</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 IgG di capra coniugata anticorpo&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP67110</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2311</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110016SH</td><td></td></tr><tr><td>Trappole per riproduzione in vasca</td><td>Habitat acquatici</td><td>N/A</td><td>Questo prodotto non è più disponibile a seguito dell'acquisizione di Aquatic Habitats da parte di Pentair. Gli investigatori possono utilizzare vasche di riproduzione standard fuori sistema disponibili da più fornitori.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A Sarà</td><td>adatto qualsiasi sistema di screening ad alto contenuto dotato di luce trasmessa e filtro FITC.</td></tr><tr><td>Cestello per immunochimica (IHC)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Prodotto internamente utilizzando provette per microcentrifuga con parte conica rimossa e fondo dotato di rete, dimensionato per piastre da 24 o 48 pozzetti.</td></tr><tr><td>MetaXpress 6.0.3.1658&nbsp;</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>N/A</td><td>Sarà adatto qualsiasi software in grado di quantificare l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza.</td></tr><tr><td>Microspatola</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo anti-5-mC</td><td>Millipore Sigma</td><td>MABE146</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50998290</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1337412</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>18612139</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta per trasferimento in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>1368050</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio</td><td>N/A</td><td>RStudio è un software open source e può essere scaricato all'indirizzo https://www.rstudio.com.</td></tr><tr><td>Siero di pecora</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3772-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Leica</td><td>10450103</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a temperatura controllata&nbsp;</td><td>Fisher Scientific PR505755L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

La metilazione della citosina è altamente conservata tra le specie di vertebrati e, come fattore chiave della programmazione epigenetica e dello stato della cromatina, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale precoce. Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina. La riprogrammazione epigenetica è un periodo critico durante lo sviluppo in utero e l'esposizione materna a sostanze chimiche ha il potenziale per riprogrammare l'epigenoma all'interno della prole. Ciò può potenzialmente causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari. Sebbene il sequenziamento basato sulla bisolfito consenta ai ricercatori di interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, come tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere utilizzati come modello fisiologicamente intatto per scoprire percorsi xenobiotici mediati che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi specifici per 5 mC disponibili in commercio, descriviamo una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero, l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica. Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a rilevare e quantificare con successo i livelli di 5-mC in situ all'interno degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo iniziale. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

Lo scopo generale di questo protocollo è determinare se un trattamento influisce sull'abbondanza relativa di 5-mC valutando l'area totale e l'intensità relativa della fluorescenza all'interno di embrioni di zebrafish fissi ed etichettati. Dopo aver completato il protocollo, è possibile utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per determinare innanzitutto se l'IHC a montaggio completo ha avuto successo. Quando gli embrioni marcati sono osservati sotto un filtro FITC o GFP, un risultato positivo è indicato da un seg...

Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni intatti di zebrafish.

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Questo protocollo offre un metodo relativamente rapido ed economico, nonché un'acquisizione e un'analisi automatizzate, producendo così uno screening a bassa sensibilità della 5-metilcitosina, che è un biomarcatore epigenetico comune. Il vantaggio principale di questa tecnica è la flessibilità che offre un design sperimentale che gli utenti possono ottimizzare per il loro modello e fase di sviluppo. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare come l'esposizione chimica altera l'abbondanza relativa di 5-metilcitosina all'interno di un organismo in via di sviluppo che normalmente potrebbe essere fatto solo attraverso costosi metodi ad alto trpA come il sequenziamento.Questo metodo è utile per qualsiasi ricerca che mira ad utilizzare metodi NCG per comprendere le alterazioni epigenetiche della 5-metilcitosina in risposta a stimoli ambientali. Inizia preparando una nuova soluzione di esposizione la mattina della raccolta. Aggiungere cinque millilitri di acqua di sistema priva di particelle a una capsula di Petri di vetro da 60 millimetri.Quindi utilizzare una pipetta di vetro micro capillare da 10 micro litri per trasferire 10 microlitri di dimetilsolfossido o soluzione madre chi

rapid-efficient-spatiotemporal-monitoring-normal-aberrant-cytosine

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Somitogenesis è un processo di sviluppo ritmico che spazialmente modelli l'asse del corpo di embrioni dei vertebrati. In precedenza, abbiamo sviluppato linee di zebrafish transgenico che usano i giornalisti fluorescenti ad osservare i geni ciclici che guidano questo processo. Qui, la cultura dispersi cellule da queste linee e l'immagine dei loro oscillazioni nel corso del tempo in vitro.

Generazione di Dispersi Presomitic mesoderma colture cellulari, per Immagini del Zebrafish segmentazione Orologio in celle singole

Il pesce zebra, un piccolo pesce tropicale, è diventata un modello importante per studiare la funzione del gene durante lo sviluppo dei vertebrati e la malattia. L'espressione temporale e spaziale dei geni bersaglio può essere...

Alta Risoluzione intero monte<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in embrioni di zebrafish per studiare l&#39;espressione genica e la funzione

I livelli di proteine ​​nelle cellule e tessuti sono spesso strettamente regolati dal saldo della produzione di proteine ​​e di liquidazione. Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP), la cinetica di clearance di proteine ​​possono essere sperimentalmente misurati in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

La mitosi è fondamentale per ogni organismo vivente e i difetti spesso portano al cancro e ai disturbi dello sviluppo. Utilizzando questo protocollo di imaging e il pesce zebra come sistema modello, i ricercatori possono visualizzare la mitosi in un organismo vertebrato vivo e la moltitudine di difetti che si verificano quando i processi mitotici sono difettosi.

Osservando divisione mitotica e Dynamics in un embrione vivo Zebrafish

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

Una combinazione delle tecniche ottiche avanzate di scansione microscopia con lungo l'eccitazione di fluorescenza multi-fotone lunghezza d'onda del laser è stata implementata per catturare immagini ad alta risoluzione, tridimensionale, in tempo reale della migrazione dalla cresta neurale in embrioni di zebrafish di Tg (foxd3:GFP) e Tg (sox10:EGFP).

Multi-fotone Time Lapse Imaging per visualizzare lo sviluppo in tempo reale: visualizzazione della migrazione di cellule neurali della cresta negli embrioni di Zebrafish

Zebrafish recentemente sono stati utilizzati come un sistema di modello in vivo per studiare il tempo di replicazione del DNA durante lo sviluppo. Qui è dettagliato i protocolli per l'utilizzo di embrioni di zebrafish per tempo di replicazione di profilo. Questo protocollo può essere facilmente adattato per studiare il tempo di replicazione in mutanti, tipi di cellule individuali, modelli di malattia e altre specie.

Tempo di replicazione del DNA utilizzando Zebrafish come un sistema di modello In Vivo di profilatura

Dimostriamo un metodo che sfrutta la microscopia confocale a scansione rapida per eseguire l'imaging dal vivo delle cellule della microglia nel tectum ottico del pesce zebra in via di sviluppo, consentendo l'analisi della dinamica di queste cellule in vivo.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia nell'embrione di zebrafish

Viene descritta una strategia di preparazione del campione per l'imaging di embrioni precoci di zebrafish all'interno di un corion intatto utilizzando un microscopio a foglio luminoso. Analizza i diversi orientamenti che gli embrioni acquisiscono all'interno del corion al 70% degli stadi di epibolia e gemma e descrive in dettaglio le strategie di imaging per ottenere una risoluzione su scala cellulare in tutto l'embrione utilizzando il sistema light-sheet.

Imaging al microscopio a foglio leggero e strategie di montaggio per embrioni precoci di zebrafish

Le RASopatie sono sindromi genetiche multisistemiche causate dall'iperattivazione della via RAS-MAPK. Varianti potenzialmente patogene in attesa di convalida emergono continuamente, mentre le scarse evidenze precliniche limitano la terapia. Qui, descriviamo il nostro protocollo in vivo per testare e convalidare in modo incrociato i livelli di attivazione ERK associati alla RASopathy e la sua modulazione farmacologica durante l'embriogenesi mediante imaging FRET dal vivo in zebrafish...

Un protocollo efficiente per valutare la modulazione dell'attività di ERK nei primi modelli di sindrome di Noonan del pesce zebra tramite microscopia FRET dal vivo e immunofluorescenza

Questo studio stabilisce un metodo sensibile di imaging basato sull'immunofluorescenza per quantificare la metilazione globale del DNA nei cuori embrionali di singoli pesci zebra. Questo approccio supera la sfida del materiale tissutale limitato e bypassa la necessità della conversione del bisolfito.

Rilevamento della metilazione globale del DNA nei cuori delle larve di pesce zebra

Scopri un metodo rapido ed economico per monitorare la metilazione della citosina in embrioni di zebrafish intatti. Questa tecnica automatizzata rileva alterazioni epigenetiche indotte da esposizione chimica in modo flessibile.

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante allinterno di embrioni di zebrafish intatti (Video) | JoVE Journal

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Esplora altri video