Protocolli per la mutagenesi CRISPR/Cas9 del moscerino orientale della frutta Bactrocera dorsalis

Il moscerino orientale della frutta è una specie di parassiti altamente invasiva e adattabile. Metodi efficaci per la ricerca genetica funzionale potrebbero aiutarci a sviluppare strategie di gestione dei parassiti rispettose dell'ambiente. Questo metodo è ad alta efficienza e basso costo.

Il nostro protocollo servirà come guida utile per generare mosche mutanti per i ricercatori di moscerini della frutta orientali. Per iniziare, prevedere la struttura dei geni bersaglio di interesse e determinare i confini tra esoni e introni attraverso l'analisi bioinformatica del genoma di Bactroceras dorsalis. Utilizzare il kit di sintesi del gRNA disponibile in commercio per generare lo sgRNA progettato.

Risospendere il prodotto di gRNA in acqua priva di nucleasi. Quantificare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile e conservare a 80 gradi Celsius prima dell'uso. Metti le pupe di B.dorsalis in una gabbia di plastica, con una condizione di allevamento del 55% di umidità relativa, 26,5 gradi Celsius e un ciclo di luce / giorno 14:10.

Quando gli adulti si chiudono, fornire una miscela di zucchero e lievito come cibo insieme all'acqua. La maggior parte degli adulti raggiunge la maturità sessuale 10 giorni dopo l'emergenza. Utilizzare un supporto luminoso con una luce da 30 a 50 lux per migliorare la fecondità delle femmine, migliorando così l'efficienza della raccolta degli embrioni.

Quindi, posizionare una garza a 200 maglie nella camera di ovideposizione, a circa 1 o 2 millimetri di distanza dal coperchio della camera. Inserire una nuova camera di ovodeposizione nella gabbia quando la configurazione della microiniezione è pronta. Raccogliere gli embrioni ogni 10 minuti usando una spazzola bagnata fine e allinearli su una piastra di iniezione fatta da sé.

Immergere gli embrioni in olio di alocarbonio durante l'iniezione per evitare un ulteriore disseccamento. Preparare la soluzione di lavoro mescolando la proteina Cas9 e il corrispondente sgRNA ad una concentrazione di 300 nanogrammi per microlitri di ciascuno. Quindi, aggiungere 1 microlitro di rosso fenolo alla miscela per servire come un modo conveniente per contrassegnare gli embrioni iniettati.

Posizionare la miscela preparata su ghiaccio per evitare la degradazione dello sgRNA. Preparare l'ago per iniezione di vetro utilizzando un estrattore di micropipette. Aggiungere 3 microlitri della miscela nell'ago per iniezione senza introdurre bolle d'aria.

Quindi, aprire l'ago utilizzando un Microgrinder e collegarlo al micromanipolatore secondo la guida per l'utente. Impostare i parametri per l'iniettore come Pi su 500 ettopascal. Ti a 0,5 secondi e PC a 200 ettopascal.

Posizionare il piatto con gli embrioni allineati sul tavolo dell'obiettivo. Quindi, regolare la posizione della micropipetta sotto un microscopio ottico fine, impostando la micropipetta e l'embrione sullo stesso piano. Inserire la punta dell'ago nella parte posteriore, o polo vegetale, dell'embrione.

Quindi, premere il pedale dall'iniettore per consegnare le miscele nell'embrione. L'aspetto di un leggero colore rossastro è dovuto all'aggiunta di rosso fenolo nella miscela. Posizionare la piastra di iniezione con gli embrioni iniettati in una camera climatica artificiale.

Dopo 36 ore, trasferire le larve tratteggiate nella dieta larvale usando un pennello a punta fine. Raccogli le larve tre o quattro volte al giorno fino a quando non si schiudono più larve. Quindi, posizionare le larve mature nella sabbia bagnata per impuparsi.

La fase di pupa dura 10 giorni. Dopo la pupa, spostare le pupe in una gabbia di plastica prima che inizi l'eclosione. Dopo aver isolato il DNA genomico da un pupario fresco o da una singola gamba centrale di singoli adulti e aver progettato i primer specifici per amplificare l'area target, eseguire la reazione a catena della polimerasi, o PCR, seguendo le condizioni cicliche descritte nel manoscritto testuale.

Quindi, sequenziare i prodotti PCR purificati. Il rilevamento di più picchi sovrapposti adiacenti al sito bersaglio suggerisce una mutagenesi riuscita. Per la sub-clonazione, mescolare i prodotti PCR purificati con un vettore smussato e ligarli a 25 gradi Celsius per 15 minuti.

Quindi, aggiungere le cellule trans-T1 e metterlo sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi, aggiungere 500 microlitri di mezzo LB e incubare a 37 gradi Celsius per 1 ora agitando. Centrifugare e scartare il surnatante.

Risospendere il pellet e stenderlo su una piastra LB. Posizionare la piastra per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. Quindi, selezionare le singole colonie batteriche per il sequenziamento per verificare il genotipo dei mutanti.

In questo studio, l'esempio del sito bersaglio del gene selezionato si trova nel terzo esone. Il sito bersaglio è altamente conservato e una singola banda è stata rilevata mediante elettroforesi su gel per il modello di DNA per gRNA sintetico e gRNA ottenuto in trascrizione in vitro. La sopravvivenza e la mutagenesi di B.dorsalis dopo microiniezioni sono mostrate qui.

Dopo il sequenziamento dei prodotti PCR, l'80% degli individui G0 sono mutanti a mosaico. Nello screening mutante, il mutante con delezione di 8 coppie di basi ha provocato la cessazione prematura della traduzione di aminoacidi. L'inserimento dell'ago nella zona posteriore o nel polo vegetale di un embrione è un passo centrale perché influisce direttamente sulla sopravvivenza delle uova.

Questa tecnologia fornisce un riferimento per lo studio delle aree delle funzioni geniche in B.Dorsalis Possono catturare rapidamente i mutanti che vogliono attraverso questo metodo.