Valutazione e manipolazione dell'attività neurale mediante microscopia olografica a due fotoni

Questo protocollo fornisce informazioni spazio-temporali accurate sulla neuroattività. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di manipolare e valutare la neuroattività con un'alta risoluzione temporale spaziale. Può essere utile per illustrare i patogeni dei disturbi neuropsichiatrici che portano ad anomalie nell'attività neurale.

Questo metodo può essere applicato allo studio dei neuroni e della salute negli altri organi. A dimostrare la procedura sarà Zhongtian Guo, dottorando del nostro laboratorio. Un giorno dopo l'impianto della piastra frontale somministrare 1,32 milligrammi per chilogrammo di desametasone fosfato di sodio per via intraperitoneale un'ora prima dell'intervento chirurgico per evitare l'edema cerebrale.

Sotto uno stereoscopio, eseguire una craniotomia circolare di circa due millimetri di diametro utilizzando un trapano dentale. Per ridurre i danni cerebrali, utilizzare il trapano dentale con attenzione con un leggero movimento costante e una leggera pressione verso il basso. Rimuovere i frammenti ossei più volte utilizzando un sistema di aspirazione.

Dopo aver rimosso il frammento osseo, utilizzare un liquido spinale artificiale o una soluzione ACSF per rimuovere e lavare eventuali detriti rimasti sulla superficie del cervello. Ripetere questa procedura di pulizia più volte per sopprimere le reazioni infiammatorie. Utilizzando un sistema di iniezione a pressione, impostare la pressione appropriata per iniettare 500 nanolitri di soluzione AAV attraverso un capillare di vetro con un diametro della punta da 10 a 20 micrometri per 10 minuti.

Se il livello della soluzione AAV nel capillare di vetro diminuisce gradualmente, la soluzione AAV viene somministrata al cervello. Lasciare il capillare di vetro in posizione per altri 10 minuti per evitare il riflusso. Ripeti questo tre volte per somministrare un totale di 1,5 microlitri di soluzione AAV nel cervello.

Applicare il 2% di agarosio a basso punto di fusione sulla superficie cerebrale di S1 utilizzando una micropipetta, quindi posizionare una finestra di vetro sopra la craniotomia con due occhiali di copertura. Premere il vetro di copertura contro l'agarosio mentre è ancora liquido. Ciò impedisce la formazione di bolle d'aria nell'agarosio.

Sigillare i bordi della finestra cranica con cemento in resina adesiva dentale. Per calibrare il sistema di stimolazione olografica, posizionare la superficie di un vetrino fluorescente rosso sul piano del campione e impostare il microscopio in modalità di imaging dal vivo con una debole luce di eccitazione. Eseguire la GUI di calibrazione.

mfile, controllare il riquadro dei parametri e fare clic sul pulsante Salva. Fai clic sul pulsante Z Scan nel riquadro Step One se genererà automaticamente tre punti casuali in 21 diversi piani assiali a due micrometri di distanza da ciascun piano. Sposta la barra di scorrimento e controlla l'immagine dal vivo.

Trova il piano perfetto in cui i punti appaiono più piccoli e luminosi, quindi fai clic sul pulsante Salva. Questo genererà automaticamente un fronte d'onda sferico sfalsato per l'ologramma digitale. Fare clic sul pulsante Vai nel riquadro dei passaggi due, quindi fare clic su sei punti nel riquadro sinistro.

Controlla l'immagine dal vivo. Se sono presenti sei punti fluorescenti distinguibili, digitare gli assi x e Y nelle caselle di modifica e fare clic sul pulsante Salva. Ciò genererà automaticamente un coefficiente di trasformazione fine per coordinare la calibrazione tra la stimolazione olografica e il sistema di imaging.

Quindi, fare clic sul pulsante Scansione nel riquadro del passaggio tre. Genererà 441 ologrammi digitali per eseguire la scansione a punto singolo attraverso il campo visivo in 21 per 21 passaggi. Controlla le immagini mentre modifichi i motivi nella casella di riepilogo.

Regolare la potenza del laser per ottenere immagini spot all'interno della gamma dinamica del dispositivo di imaging. Mettere il dispositivo di imaging in modalità di registrazione e fare clic sul pulsante Riproduci. Al termine del gioco, fai clic su Genera mappa del peso nel riquadro dei passaggi quattro e scegli un'immagine in pila.

Quindi chiudere la finestra della GUI di calibrazione. Genererà automaticamente una mappa del peso per compensare l'intensità sbilanciata in ogni punto. Posizionare il mouse iniettato AAV con una piastra frontale sotto il microscopio ed eseguire l'imaging a due fotoni utilizzando un microscopio olografico e un laser zaffiro di titanio bloccato in modalità sintonizzato su 920 nanometri con un obiettivo 25x.

Aprire il software di imaging commerciale in modalità live imaging. Regolare la tensione del rilevatore di immagini e la potenza del laser di imaging per ottimizzare la luminosità dei neuroni che esprimono GCaMP8f. Cattura le immagini dei neuroni che esprimono questa proteina.

Per illuminare i neuroni specifici con l'illuminazione olografica, eseguire SLMcontrol. m file di script. Fare clic sull'immagine di riferimento e scegliere l'immagine acquisita.

Quindi, fai clic sul pulsante Spot per scegliere pixel specifici sui neuroni nell'immagine e premi il pulsante Invio sulla tastiera per finalizzarlo. Per rilevare l'attività neurale con un'elevata risoluzione temporale utilizzando un sensore di immagine, impostare il tempo di esposizione, l'area di imaging e il binning, quindi eseguire l'acquisizione dell'immagine. Dopo aver posizionato il mouse al microscopio ed eseguito l'imaging a due fotoni, aprire il software di imaging commerciale.

Nella modalità live imaging, regolare la tensione del rilevatore di immagini e la potenza del laser di imaging per ottimizzare la luminosità dei neuroni che esprimono GCaMP-6m-p2A-ChRmine. Cattura le immagini dei neuroni che esprimono queste proteine e poi illumina i neuroni specifici seguendo la procedura mostrata in precedenza. Per studiare la connettività funzionale all'interno dei neuroni di livello due e tre, utilizzare un modulatore di luce spaziale per generare modelli olografici di stimolazione optogenetica e combinarlo con l'imaging del calcio a due fotoni.

Impostare l'intensità del laser di imaging su 920 nanometri a 10-20 milliwatt e il campo visivo su 256 micrometri per 256 micrometri misurati a una profondità di 100-150 micrometri dalla superficie corticale. Imposta il tempo di permanenza dei pixel su 1,5 microsecondi per due hertz o 100 nanosecondi per 30 hertz. Usa sia due hertz che 30 hertz come frame rate di imaging per vedere se un singolo stimolo olografico ha causato una risposta di calcio nei neuroni.

Imposta l'intensità del laser di stimolazione olografica che stimola un singolo neurone a 10 milliwatt che è sufficiente per indurre l'attività neurale. Contemporaneamente, visualizzare la risposta del ferro e calcio a 920 nanometri con 10 stimoli olografici a 1040 nanometri e intervalli di otto secondi per una durata di 50 millisecondi dopo un periodo basale di 10 secondi. Successivamente, riporta il mouse nella sua gabbia di casa.

L'immagine rappresentativa e le tracce di neuroni che esprimono GCaMP8f nell'imaging a 100 hertz con stimolazione olografica e un sensore di immagine sono mostrati qui. Questo grafico mostra la risposta neurale alla stimolazione olografica ad ogni potenza del laser. Le tracce rappresentative di Calcium 2++ durante la stimolazione olografica di 10 diversi neuroni a frame rate di imaging a due hertz e 30 hertz sono presentate qui.

Lo stesso colore indica lo stesso neurone. Un diagramma schematico che valuta le connessioni funzionali tra i neuroni è raffigurato qui. Quando il neurone arancione viene stimolato, i neuroni rossi rispondono allo stesso tempo indicando che esiste una connettività funzionale tra questi neuroni.

Un'immagine tipica dei neuroni primari della corteccia somatosensoriale che esprimono GCaMP6m in wild type è mostrata qui. Queste immagini grafiche rappresentano le tipiche tracce di calcio 2++, durante la stimolazione olografica a frame rate di imaging di due hertz e 30 hertz. La neuro reattività alla stimolazione olografica può essere rilevata a velocità di imaging sia di due hertz che di 30 hertz.

Questi passaggi sono importanti per ridurre il movimento del cervello e due, ottenere risultati stabili. Crediamo che questo microscopio possa indurre un comportamento nella scrittura di neuroni con schemi specifici. Con questa tecnica, siamo ora in grado di valutare e manipolare l'attività del singolo neurone e caratterizzare la neuropsichiatria in dettaglio.