En Face Preparazione del cuscino endocardico per l'analisi della morfogenesi planare negli embrioni di topo

Questo protocollo consente l'analisi dell'endocardio primitivo in un orientamento planare. Possiamo analizzare la distribuzione delle cellule endocardiche, l'anisotropia di altre ingiunzioni e descrivere la forma di una singola cellula endocardica durante lo sviluppo valvolare. Rispetto alle sezioni tissutali classiche, l'imaging en face della regione rigenerativa della valvola interna consente l'analisi della polarità cellulare planare e della dinamica delle cellule endocardiche durante lo sviluppo valvolare in embrioni intatti.

Questo metodo può essere utilizzato per approfondire la conoscenza della polarità cellulare planare durante lo sviluppo cardio. Inizia mettendo l'utero asportato da topi gravidi eutanasizzati, in una capsula di Petri contenente PBT ghiacciato. Rimuovere l'individuo deciduye dall'utero sotto un microscopio da dissezione usando una pinza fine.

Usando una pinzetta sottile, fai un'incisione nella parte bianca della decidua, che è dove si trova l'embrione. Rimuoverlo delicatamente, evitare di tirare e trasferire gli embrioni in una nuova capsula di Petri con PBT fresco usando un P-1000 con la punta tagliata, lasciando un diametro abbastanza grande da consentire a un embrione di passare attraverso senza rompersi. Per la genotipizzazione, prendere un piccolo pezzo del sacco vitellino di circa 0,5 millimetri quadrati o un pezzo della coda dall'estremità posteriore, contando da cinque a 10 somiti verso la testa e digerirlo in 100 millilitri del tampone appropriato.

Sotto la cappa aspirante, trasferire gli embrioni al 4% di PFA ghiacciato in una provetta da microcentrifuga da due millilitri a quattro gradi Celsius. Fissare gli embrioni da due ore a una notte a quattro gradi Celsius su un nutatore. Sotto la cappa aspirante, rimuovere il fissativo 4% PFA dalle provette della microcentrifuga senza toccare gli embrioni.

Gettare il PFA in un contenitore appropriato. Lavare gli embrioni cinque volte in PBT freddo per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pinza fine, rimuovere il cuore e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri con PBT fresco.

Sostituire PBT con PBS Triton e lavare i campioni tre volte, cinque minuti ciascuna, a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Sostituire PBS Triton con una soluzione bloccante contenente PBS Triton con siero bovino inattivato al 10% dal calore. Incubare da due ore a una notte a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale.

Sostituire la soluzione bloccante con una soluzione bloccante contenente anticorpi primari alla concentrazione desiderata. Incubare durante la notte su uno shaker orbitale a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, incubare i campioni per 1,5 ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale.

Questo passaggio è fondamentale per aumentare il rapporto segnale-rumore. Rimuovere e mantenere la soluzione anticorpale primaria a quattro gradi Celsius, fino a tre esperimenti futuri. Aggiungere azoturo di sodio ad una concentrazione finale dello 0,02% per una migliore conservazione.

Quindi, lavare gli embrioni tre volte con PBS Triton per tre minuti ciascuno. Lavare gli embrioni con PBS Triton tre volte per 30 minuti e tenerli su uno shaker orbitale a quattro gradi Celsius. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari coniugati con fluorescenza contro la specie ospite di anticorpi primari.

Quindi aggiungere DAPI alla soluzione e incubare gli embrioni durante la notte su uno shaker orbitale a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, incubare gli embrioni per 1,5 ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Questo passaggio è essenziale per aumentare il rapporto segnale-rumore.

Ripetere i passaggi di lavaggio PBS Triton come indicato nel manoscritto di testo. Metti i cuori su una piastra di Petri da 35 millimetri contenente PBS. Utilizzando un filo di tungsteno e una pinza fine, isolare il canale atrioventricolare o il tratto di deflusso e tagliarli longitudinalmente.

Preparare vetrini di copertura, vetrini, pinze, una pipetta P-200 con le punte appropriate, un tovagliolo di carta e qualsiasi mezzo di montaggio acquoso a base di glicerolo per fluorescenza senza DAPI. Incolla due strisce di nastro adesivo su una diapositiva separata da 0,3 a 0,6 centimetri per creare uno spazio 3D che consentirà ai campioni di conservare la loro forma originale senza schiacciarli. Quindi, utilizzando circa 20 microlitri di tampone, rilasciare con cautela i campioni sul vetrino tra le strisce di nastro utilizzando una punta per pipetta P-200 tagliata.

Utilizzare un microscopio da dissezione per aumentare la precisione. Usando una pinza fine, posizionare i campioni con l'endocardio rivolto verso l'alto e il miocardio verso il basso sul vetrino. Rimuovere il PBS in eccesso con un tovagliolo di carta ed evitare di toccare il campione.

Quindi, asciugare i campioni per uno o due minuti a temperatura ambiente per far aderire i campioni al vetrino. Aggiungere 40 microlitri di media di montaggio a base acquosa al tessuto. Posizionare la linguetta di copertura sopra i due pezzi di nastro adesivo e abbassarla lentamente sul fazzoletto con un ago o una pinza.

Evitare di creare bolle d'aria. Sigillare la sottoveste di copertura con una goccia di smalto su ciascun vertice della sottoveste. Una volta che lo smalto è asciutto, pulire il supporto di montaggio in eccesso dai lati della vetrina utilizzando un tovagliolo di carta assorbente.

Evitare di spostare il vetrino di copertina. Aggiungere lo smalto lungo i bordi della fodera del coperchio per sigillarlo completamente, evitando l'evaporazione del supporto di montaggio. Utilizzando un microscopio confocale verticale o invertito, scattare immagini con ingrandimento 10X per la visualizzazione generale e a 63X con zoom 3X per immagini dettagliate.

La forma cellulare dell'endocardio è stata analizzata durante la formazione delle valvole a una risoluzione cellulare. Singole cellule o cloni di poche cellule hanno espresso GFP nell'endocardio. L'espressione e la combinazione di GFP con la localizzazione subcellulare della VE-caderina è stato un approccio efficace per studiare la relazione tra la dinamica di AJ e la formazione di filopodi e le cellule pre-EMT, poiché queste cellule hanno sviluppato protrusioni di membrana quando le AJ si dissolvono.

Le differenze nell'intensità della colorazione VE-caderina nell'endocardio hanno indicato la presenza di contrattilità anisotropa nell'endocardio embrionale del canale atrioventricolare negli stadi pre-valvolari. L'intero cuore era colorato con l'anticorpo VE-caderina a E8.5 ed E9.5. A E8.5, l'endocardio del canale atrioventricolare tendeva ad avere un'organizzazione epiteliale stabile e non sono stati rilevati vertici formati da più di quattro cellule.

A E9.5, sono stati osservati vertici di un massimo di sei cellule che formano strutture simili a rosette, simili all'organizzazione cellulare precedentemente descritta nell'epiteliale sottoposto a riarrangiamenti cellulari attivi, suggerendo che l'endocardio del canale atrioventricolare stava subendo un riarrangiamento cellulare dinamico durante lo sviluppo della valvola. Una curva di apprendimento è necessaria per diventare un esperto in questa tecnica. Inoltre, si consiglia vivamente di utilizzare pinze sovrane e filo di tungsteno.

Oggi, la visualizzazione dell'endocardio pre-valvolare era limitata alle sezioni trasversali. Il nostro approccio offre la possibilità di studiare il comportamento dell'endocardio valvolare embrionale da un punto di vista planare.