Piattaforma analitica multimodale su un chip di imaging a risonanza plasmonica di superficie multiplexed per l'analisi di sottoinsiemi di vescicole extracellulari
17 marzo 2023
Questo articolo propone una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari. Il metodo si basa su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica, accoppiata con spettroscopia Raman, per qualificare bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray.
La natura complessa delle EV rende difficile riconoscere la sottopopolazione di interesse e questo protocollo può rilevarle con il loro fenotipo, profilo dimensionale e proprietà nanomeccaniche. Questa combinazione di tecnica è un metodo label-free, che ci consente di rilevare EV in tempo reale dai mezzi di condizione e dal plasma sanguigno. Questa tecnica consente di caratterizzare profondamente sottoinsiemi di nanoparticelle di interesse, al fine di essere utilizzate come bioindicatori di patologia, o anche utilizzate come nanoparticelle per la somministrazione di farmaci.
Poiché si tratta di un metodo molto sensibile, è imperativo prestare attenzione alla preparazione del biochip prima di iniettare il campione di interesse. Dopo aver rivestito e funzionalizzato i chip, incubare il biochip in una miscela di 200 millimolari di etile dimetilamminopropilcarbodiimide/N-idrossisuccinimide e 50 millimolari per litro di N-idrossisuccinimide per almeno 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Utilizzando lo spotter, aggiungere 300 nanolitri di soluzione di ligando e incubare il biochip sotto un bagno sonico per 30 minuti.
Lavare il biochip dall'alto con acqua ultrapura. Aggiungi una goccia di olio con lo stesso indice di rifrazione del prisma per creare uno strato sottile uniforme tra il biochip e il prisma e posizionalo delicatamente su un prisma con lo stesso indice di rifrazione del biochip. Per la risonanza plasmonica di superficie, montare il biochip sul sistema SPRi.
Vai al menu a discesa sul lato sinistro del software e fai clic sulla directory di lavoro. Trova l'immagine in cui sono visibili diversi punti e fai clic per selezionare questa immagine. Quindi scrivi il nome delle famiglie di liganti e fai clic sulla definizione di specie Finish.
Trascinare la linea nera con il cursore sull'angolo di lavoro ottimale. Fate clic su Sposta specchia su angolo di lavoro e selezionate un angolo di lavoro. Ora fai clic su Kinetics.
Poiché il software richiede all'utente di definire il controllo negativo, scegliere Nessun controllo negativo a questo punto. Iniettare albumina sierica di ratto a 50 microlitri al minuto per quattro minuti. Iniettare etanolammina a 20 microlitri al minuto per 10 minuti per disattivare i gruppi carbossilici ancora presenti e reattivi sulla superficie.
Successivamente, lavare il biochip iniettando 40 millimolari OG a 50 microlitri al minuto per quattro minuti. Iniettare le vescicole extracellulari ad una concentrazione specifica sul chip biofunzionalizzato seguendo la cinetica dell'interazione delle vescicole sui diversi punti, contemporaneamente. Determina anche il valore della riflettività e il livello di interazione.
Una volta stabilizzato, iniettare glutaraldeide sul chip per fissare le vescicole extracellulari nel punto in cui si trovano prima di eseguire l'imaging AFM. Allineare il biochip sulla parte superiore della maschera sul vetrino. Utilizzare la telecamera CCD sulla parte superiore dell'AFM per localizzare il cantilever nel punto corretto che deve essere scansionato.
Avviare l'acquisizione AFM in modalità di contatto da tre a cinque aree grandi e piccole. Quindi, trattare le immagini AFM con il software di elaborazione dati JPK selezionando prima il canale di altezza. Scegliere un adattamento polinomiale da sottrarre da ogni linea per ottenere linee di scansione raddrizzate.
Selezionate la soglia di altezza sui grani d'oro per eliminare la rugosità sulla superficie. Il modulo di estrazione dei grani segna i grani utilizzando una soglia di altezza di 8,5 nanometri. I biochip multiplexed sono stati analizzati dopo la passivazione dell'albumina.
Il chip senza default. Il chip con alcuni difetti, dovuti alla fusione di macchie, innesti deboli, o bolle o contaminanti. E viene mostrato un chip d'oro nudo senza microarray per esaminare l'adsorbimento di vescicole extracellulari sull'oro.
L'esperimento di cattura su un biochip multiplex ha mostrato buoni segnali di riflettività per diversi ligandi e un buon rapporto segnale-rumore per i diversi ligandi, poiché la risposta del controllo negativo era trascurabile. L'adsorbimento delle vescicole extracellulari dopo l'iniezione del campione di vescicola extracellulare ha mostrato un segnale di alta riflettività, suggerendo che quelle vescicole erano in grado di adsorbire e rimanere stabili sul chip d'oro. Dopo il carico di vescicole extracellulari, sono state generate le immagini AFM su larga e piccola scala delle vescicole extracellulari su biochip.
Una visione ravvicinata ad alta risoluzione consente la metrologia delle vescicole extracellulari. Il diametro effettivo delle vescicole extracellulari su un biochip variava da 30 a 300 nanometri, con una grande maggioranza intorno ai 60 nanometri. I risultati ottenuti in aria e liquido sono stati comparabili.
Lo spettro Raman delle vescicole extracellulari adsorbite su un chip nudo ha rivelato uno spettro chiaro, con picchi corrispondenti principalmente alle vibrazioni del metilene, che sono associate ai lipidi delle membrane delle vescicole extracellulari. È importante preparare rigorosamente il biochip per essere in grado di rilevare i veicoli elettrici in modo accurato e riproducibile. Metodi convenzionali come il Western blotting e l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle possono essere utilizzati per correlare e confermare fenotipi e modelli di dimensioni.
Inoltre, sono previste analisi multiomiche per approfondire ulteriormente la caratterizzazione molecolare delle EV e la potenziale discriminazione dei sottoinsiemi.
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Panoramica
Questo studio presenta una nuova piattaforma analitica multiparametrica per caratterizzare i sottogruppi di vescicole extracellulari (EV) ad alto rendimento. La piattaforma combina metodi di biosensing multiplexed con microscopia a forza atomica e spettroscopia Raman per analizzare gli EV in tempo reale, concentrandosi sui loro fenotipi, profili di dimensioni e proprietà nanomeccaniche.
Componenti chiave dello studio
Area di ricerca
- Caratterizzazione delle vescicole extracellulari
- Tecniche analitiche multiparametriche
- Metodi di biosensing
Contesto
- La complessità degli EV rende difficile l'identificazione delle sottopopolazioni.
- Importanza degli EV come biomarcatori per patologie e somministrazione di farmaci.
- Necessità di metodi di rilevamento sensibili in vari campioni biologici.
Metodi utilizzati
- Combina biosensing multiplexed, microscopia a forza atomica e spettroscopia Raman.
- Utilizza microarray biofunzionalizzati per rilevare gli EV in tempo reale.
- Approccio senza etichetta per minimizzare le interferenze con la caratterizzazione degli EV.
Risultati principali
- La tecnica mostra un efficace rilevamento degli EV basato su dimensioni e composizione.
- L'imaging ad alta risoluzione rivela il diametro degli EV che varia da 30 a 300 nanometri, prevalentemente intorno a 60 nanometri.
- Gli spettri Raman indicano la composizione della membrana lipidica, confermando l'efficacia del metodo.
Conclusioni
- Lo studio dimostra con successo un metodo affidabile per l'ampia caratterizzazione degli EV.
- Questo lavoro ha implicazioni significative per la ricerca sui biomarcatori e le applicazioni terapeutiche.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicle (EV) subsets with high specificity and throughput is a critical challenge in early biomarker discovery and therapeutic platform development. The described multimodal analytical platform integrates multiplexed biosensing, atomic force microscopy, and Raman spectroscopy to deliver quantitative, label-free phenotypic and molecular profiling of EVs. This capability enhances predictive confidence in EV-based biomarker validation and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic and nanomechanical profiling of EV subpopulations for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing EV subsets based on size, composition, and molecular features.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of EVs as disease-relevant bioindicators.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biochips for reproducible EV capture and analysis workflows.
- Delivers quantitative, real-time readouts of EV interactions and adsorption profiles.
- Standardizes assay conditions to enable reliable cross-sample and cross-ligand comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV subset characterization with translational biomarker strategies for disease monitoring.
- Provides continuity from discovery-stage EV profiling to preclinical validation of candidate biomarkers.
- Reduces mechanistic ambiguity in EV-based therapeutic and diagnostic development.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal platform bridges early discovery, screening, and translational research by enabling comprehensive EV subset analysis from biological fluids.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic de-risking through multiplexed, quantitative EV profiling.
- Screening: Delivers reproducible, label-free assay outputs for EV subset discrimination and ligand specificity.
- Analytics: Integrates morphomechanical and molecular readouts to inform cross-condition comparisons and statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity for EV-based diagnostics.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable analytical platform for diverse EV research and development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker and therapeutic candidate selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in EV analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in EV-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed biosensing, AFM, and Raman spectroscopy for optimal platform operation.
- Demands rigorous biochip preparation and functionalization to ensure reproducibility and sensitivity.
- Needs access to advanced instrumentation and analytical infrastructure for high-resolution EV characterization.
- Benefits from cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different biological matrices or EV sources as supported by the platform's flexibility.
