Una piattaforma di vaccino a nanoparticelle "plug-and-display" basata su vescicole di membrana esterne che mostrano il dominio di legame del recettore SARS-CoV-2

La nanoscienza può migliorare efficacemente la risposta immunitaria antigene-specifica dopo aver visualizzato gli antigeni sulla superficie di Il vantaggio principale in questa piattaforma vaccinale può raggiungere la placca e il display di uscita. In altre parole, la piattaforma è in grado di visualizzare la varietà di antigeni in Questo metodo può essere applicato anche ad altre nanoparticelle biologiche per visualizzare il motore a vettori di dimensioni nanometriche. Per eseguire la trasformazione del catetere spia della citolisina A, iniziare con l'aggiunta di cinque microlitri di soluzione plasmatica a 50 microlitri di ceppo competente BL 21.

Soffiare delicatamente e lasciare raffreddare sul ghiaccio per 30 minuti. Posizionare la soluzione per 90 secondi a bagnomaria a 42 gradi Celsius, quindi mettere immediatamente la soluzione mista sul ghiaccio per tre minuti. Aggiungere 500 microlitri di luria bertani mezzo alla sospensione batterica e dopo aver miscelato la coltura a 220 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per un'ora.

Successivamente, placcare tutta la trasformazione luria bertani agar piastra contenente ampicillina e coltura durante la notte a 37 gradi Celsius. Per la produzione di acchiappaspia OMV, iniziare isolando una singola colonia dalla piastra a 20 millilitri di terreno di luria bertani e coltura durante la notte a 220 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius. Incubare la soluzione batterica in un mezzo da due litri e coltivare a 220 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per cinque ore fino al raggiungimento della fase di crescita logaritmica.

Aggiungere isopropil beta D-IPTG per rendere la concentrazione finale della soluzione batterica di 0,5 millimolari e quindi coltivare durante la notte a 220 rotazioni al minuto a 25 gradi Celsius. Quindi, eseguire la purificazione dello spycatcher OMV. Inizia con centri che fondono la soluzione batterica.

Filtrare il surnatante con un filtro a membrana da 0,22 micrometri, quindi concentrarlo utilizzando una colonna di fibra cava. Filtrare il concentrato attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri, quindi fonderlo a 150.000 volte G a quattro gradi Celsius per due ore usando un fusibile ultra centri e scartare il surnatante con una pipetta. Risospendere le precipitazioni con PBS e conservarle a meno 80 gradi Celsius.

Per eseguire la trasfezione di spytag RBD, iniziare con la selezione di un appropriato sistema di espressione eucariotica e coltivare le cellule durante la notte a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius dopo il recupero. Aggiungere 20 microlitri HEK 293F di soluzione cellulare nel contatore automatico delle celle. Registrare il numero di celle, regolare la concentrazione a una volta 10 alle sei cellule per millilitro.

E poi coltivare le cellule a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per quattro ore. Filtrare il plasmide RBD Spy Tag attraverso un filtro a membrana da 0,22 micrometri e aggiungere 300 microgrammi di plasmidi nel mezzo di coltura cellulare fino a quando il volume finale è di 10 millilitri. Agitare per 10 secondi.

Riscaldare PEI a 65 gradi Celsius a bagnomaria. Mescolare 0,7 millilitri di PEI con 9,3 millilitri di terreno di coltura cellulare e agitare a intermittenza per 10 secondi. Aggiungere la soluzione plasmidica alla soluzione PEI.

Agitare la miscela a intermittenza per 10 secondi e incubarla a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Aggiungere la miscela a 280 millilitri di terreno di coltura cellulare e coltivare a 130 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Quindi, eseguire la purificazione dello spytag RBD.

Inizia con centri che fondono le cellule a 6.000 volte G a 25 gradi Celsius per 20 minuti e usa una pipetta per raccogliere il surnatante. Riempire la colonna con due millilitri di nichel NTA agarosio e lavarla tre volte con PBS. Aggiungere imidazolo nel surnatante cellulare per rendere la concentrazione finale di 20 millimolari e caricare il surnatante cellulare.

Aggiungere tre volumi di colonna di PBS contenenti 20 millimolari di imidazolo per il lavaggio e raccogliere la frazione di lavaggio. Eluizione a gradiente con volumi a tre colonne di PBS contenenti concentrazioni da basse ad alte di imidazolo eluito due volte per ciascuna concentrazione. Per determinare la concentrazione proteica con il metodo BCA, diluire in serie la soluzione proteica BSA standard da due a 0,0625 milligrammi per millilitro, diluire lo spycatcher OMV purificato e il tag spia RBD 10 volte.

Quindi mescolare le soluzioni di lavoro BCA A e B con un rapporto di 50 a uno. Aggiungere la soluzione proteica diluita e mescolare con la soluzione di lavoro BCA. Incubare a 37 gradi per 30 minuti.

Misurare l'assorbanza a 562 nanometri di ciascun pozzetto e calcolare la concentrazione proteica dalla curva standard. Per eseguire la bioconiugazione di OMV spycatcher e RBD spy tag, mescolare OMV spycatcher e RBD spytag e PBS con un rapporto di 40 a uno. Ruotare verticalmente per frullare la miscela durante la notte a 15 rotazioni al minuto a quattro gradi Celsius.

Eseguire la purificazione di OMV RBD utilizzando la soluzione PBS utilizzando una procedura simile alla purificazione dello spycatcher OMV. Lo schema di progettazione del plasma mostra che il gene spycatcher è collegato al gene cly A tramite linker flessibile mentre lo spytag si collega ai cinque terminali principali del gene RBD con un gene hys tag per la purificazione e la verifica. Dopo l'ultracentrifugazione, quasi tutti gli spytag RBD non reagiti sono rimasti nel surnatante.

La seconda ultracentrifugazione non ha fornito un ulteriore vantaggio significativo rispetto alla prima volta. Il diametro idrodinamico medio z dello spycatcher OMV era di 133 nanometri mentre era di 152,6 nanometri per OMV-RBD. Queste differenze possono essere dovute al fatto che RBD aumenta la dimensione delle particelle OMV dopo una visualizzazione intensiva.

I risultati di TEM sono coerenti con la distribuzione granulometrica ottenuta dai risultati DLS. La rotazione per la miscelazione della miscela è molto importante. L'efficienza della reazione può essere molto più bassa senza rotazione.