Name: Determinazione quantitativa della sintesi de novo degli acidi grassi nel tessuto adiposo bruno utilizzando lossido di deuterio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Scopri un metodo quantitativo non invasivo per analizzare la lipogenesi degli acidi grassi nel tessuto adiposo bruno utilizzando ossido di deuterio e GCMS. Questa tecnica offre misurazioni accurate del flusso di sintesi lipidica in vivo nei modelli murini.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Sanchez-Gurmaches e Wallace per le preziose discussioni. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni dell'American Heart Association (18CDA34080527 a JSG e 19POST34380545 a RM), dal NIH (da R21OD031907 a JSG), da un CCHMC Trustee Award, da un CCHMC Center for Pediatric Genomics Award e da un CCHMC Center for Mendelian Genomics & Therapeutics Award. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH P30 DK078392 del Digestive Diseases Research Core Center di Cincinnati. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. RT e MW sono stati sostenuti da una borsa di studio Ad Astra dell'UCD.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Comprendere l'equilibrio e l'interazione tra vie metaboliche complesse è un passo indispensabile verso la comprensione delle basi biologiche delle malattie metaboliche. Qui, mostriamo una metodologia non invasiva e poco costosa per determinare i cambiamenti nella sintesi de novo degli acidi grassi. Questo metodo è adattato da metodi pubblicati in precedenza che hanno sviluppato calcoli per stimare il flusso di sintesi de novo dall'arricchimento di deuterio di acidi grassi31 e per...

L'obesità e le malattie metaboliche associate sono una pandemia che mette in pericolo le generazioni presenti e future 1,2. Comunemente semplificata come conseguenza dello squilibrio tra apporto e dispendio energetico, la disregolazione metabolica associata all'obesità interessa un gran numero di vie metaboliche controllate da fattori ambientali ed endogeni3. Tuttavia, solo poche vie sono testate di routine in modelli animali di disregolazione metabolica.
Ad esempio, lo smaltimento del glucosio viene misurato di routine mediante test di tolleranza al glucosio e all'insulina, probabilmente a causa della semplicità dell'utilizzo di monitor portatili del glucosio4. Anche i tassi relativi di glucosio e ossidazione dei lipidi nell'intero corpo sono regolarmente stimati sulla base del rapporto di scambio respiratorio dei saggi di calorimetria indiretta 5,6. Tuttavia, la maggior parte di tutti gli altri aspetti del metabolismo non sono valutati funzionalmente di routine. Ciò porta a interpretazioni incomplete dello stato metabolico e a opzioni terapeutiche mancate. Uno dei principali percorsi di questo tipo è la lipogenesi de novo.
La lipogenesi de novo (DNL) è il processo mediante il quale vengono generati nuovi acidi grassi dai precursori. Il glucosio è considerato il principale precursore che contribuisce al DNL7 per tutto il corpo, tuttavia altri precursori, come l'acetato, il fruttosio, il lattato e gli aminoacidi a catena ramificata, hanno dimostrato di essere fonti di carbonio rilevanti in modo spaziale e dipendente dalle condizioni 8,9,10,11,12. Il DNL è un fattore chiave che contribuisce all'omeostasi metabolica ed è essenziale per il normale sviluppo13. Inoltre, le alterazioni del DNL sono state associate al cancro 14,15 e al metabolismo 16,17,18 e alle malattie cardiovascolari 19,20.
La via DNL è composta dai componenti enzimatici principali ATP citrato liasi (ACLY), acetil-CoA carbossilasi (ACC1/2) e acido grasso sintasi (FAS) che producono principalmente palmitato, un acido grasso saturo a 16 atomi di carbonio. Tuttavia, gli acidi grassi a catena dispari e a catena ramificata possono essere prodotti anche a tassi inferiori9. Le elongasi e le desaturasi modificano ulteriormente questi acidi grassi, creando una vasta gamma di specie di acidi grassi utili per una varietà di funzioni (ad esempio, l'immagazzinamento di energia a lungo termine e la manipolazione della fluidità della membrana).
L'espressione del meccanismo enzimatico DNL è controllata da un breve numero di fattori di trascrizione. I più ben descritti fino ad oggi includono la famiglia della proteina legante gli elementi regolatori degli steroli (SREBP), la proteina legante l'elemento di risposta ai carboidrati (ChREBP) e il recettore X del fegato (LXR)21,22,23,24,25,26. Nonostante un'apparente sovrapposizione nelle loro funzioni, sono state riportate regolazioni individuali basate sulla dominanza del tipo di cellula e su condizioni fisiologiche o patologiche21,22,27,28.
Sorprendentemente, un certo numero di inibitori per fasi selezionate della via DNL sono stati approvati per uso clinico o sono in fase di sviluppo preclinico o clinico per una serie di malattie, tra cui l'obesità, la steatosi epatica non alcolica/steatoepatite non alcolica (NAFLD/NASH) e le malattie cardiovascolari29. Questi sforzi evidenziano l'importanza della DNL nella salute e nella malattia.
Negli ultimi anni, l'impiego di metodi per valutare quantitativamente la sintesi de novo degli acidi grassi è aumentato30. Il metodo più comune per valutare questo fenomeno è l'uso di acqua marcata pesante (D2O), in cui l'idrogeno marcato pesante viene incorporato nelle catene aciliche durante la sintesi sia direttamente che indirettamente, tramite lo scambio di deuterio con gli idrogeni dei substrati DNL NAPDH, acetil-CoA e malonil-CoA. Sebbene questo approccio stia guadagnando popolarità, mancano protocolli dettagliati disponibili al pubblico adatti ai nuovi arrivati nel campo. Qui, delineiamo un metodo per valutare quantitativamente la sintesi de novo di prodotti di FAS utilizzando D2O e spettrometria di massa gascromatografica (GCMS), con calcoli precedentemente sviluppati da Lee et al.31. Questo metodo misura la sintesi de novo degli acidi grassi indipendentemente da una fonte di carbonio ed è potenzialmente utile praticamente per qualsiasi tessuto, in qualsiasi modello murino e sotto qualsiasi perturbazione esterna. Qui, ci concentriamo sull'analisi del tessuto adiposo bruno (BAT) a causa dei suoi alti livelli di DNL e dei ruoli critici nel mantenimento dell'omeostasi metabolica.

<table><tbody><tr><td>Fiale di vetro da 4 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtro</td><td>Olympus Plastic</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>26G siringhe needeled</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Merck</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>Blue GC tappo a vite con setti</td><td>Agilent</td><td>5190-1599</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Sigma</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Di-terz-butil-4-metilfenolo (BHT) Seleziona colonna FAME</td><td>Merck</td><td>B1378</td><td></td></tr><tr><td>Di-terz-butil-4-metilfenolo (BHT) Seleziona colonna FAME</td><td>Agilent</td><td>CP7419</td><td></td></tr><tr><td>Tubo EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>411395105</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Merck</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Esadecenoico-d31</td><td>Larodano</td> acido <td>71-1631</td><td></td></tr><tr><td>Esano</td><td>Merck</td><td>34859</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Merck</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga</td><td>Olympus Plastic</td><td>24-282</td><td></td></tr><tr><td>Camera climatica per topi</td><td>Caron</td><td>Caron 7001-33</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Fisher Bioreagenti</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>MP Biomedicals</td><td>194727</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga</td><td>SafeLock Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Fiala GC ambrata con tappo a vite</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, bioreagenti Fisher bibasici</td><td></td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td><td>Merck</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Acido solforico</td><td>Merck</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Foglietto illustrativo</td><td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione quantitativa della sintesi de novo degli acidi grassi nel tessuto adiposo bruno utilizzando l'ossido di deuterio

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

La sintesi degli acidi grassi è una via metabolica complessa e altamente energivora con importanti ruoli funzionali nel controllo dell'omeostasi metabolica di tutto il corpo e di altri processi fisiologici e patologici. Contrariamente ad altre vie metaboliche chiave, come lo smaltimento del glucosio, la sintesi degli acidi grassi non viene valutata funzionalmente di routine, portando a interpretazioni incomplete dello stato metabolico. Inoltre, mancano protocolli dettagliati disponibili al pubblico adatti ai nuovi arrivati nel settore. Qui, descriviamo un metodo quantitativo economico che utilizza l'ossido di deuterio e la spettrometria di massa gascromatografica (GCMS) per l'analisi della sintesi de novo di acidi grassi totali nel tessuto adiposo bruno in vivo. Questo metodo misura la sintesi dei prodotti dell'acido grasso sintasi indipendentemente da una fonte di carbonio ed è potenzialmente utile praticamente per qualsiasi tessuto, in qualsiasi modello murino e sotto qualsiasi perturbazione esterna. Vengono forniti dettagli sulla preparazione del campione per GCMS e sui calcoli a valle. Ci concentriamo sull'analisi del grasso bruno a causa dei suoi alti livelli di sintesi di acidi grassi de novo e dei ruoli critici nel mantenimento dell'omeostasi metabolica.

Sulla base del dosaggio di D 2 O descritto nella fase 1, in genere troviamo che l'acqua corporea è arricchita nell'intervallo dal2,5% al 6% e che un livello basale di arricchimento di deuterio nell'acqua corporea viene rapidamente raggiunto in 1 ora e mantenuto per tutta la durata dello studio tramite acqua potabile arricchita all'8% (Figura 1). L'arricchimento continuo delle acque corporee allo stato stazionario è un'ipotesi dei calcoli utilizzati nella fase 6, e quindi ...

Qui, presentiamo un metodo quantitativo poco costoso che utilizza l'ossido di deuterio e la spettrometria di massa gascromatografica (GCMS) per l'analisi della lipogenesi de novo degli acidi grassi totali nel tessuto adiposo bruno in vivo.

Determinazione quantitativa della sintesi de novo degli acidi grassi nel tessuto adiposo bruno utilizzando l'ossido di deuterio

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

Contrariamente ad altre vie metaboliche come lo smaltimento del glucosio, la sintesi degli acidi grassi non viene valutata di routine, portando a interpretazioni incomplete dello stato metabolico. I principali vantaggi di questo metodo sono che è relativamente non invasivo ed è probabilmente un riflesso migliore del flusso di sintesi degli acidi grassi rispetto all'utilizzo di glucosio marcato con isotopi in cui i cambiamenti nella gestione del glucosio a monte possono influire sui risultati. Qui ci concentriamo sul tessuto adiposo bruno, ma questo metodo è potenzialmente utile per studiare qualsiasi tessuto in qualsiasi modello murino.Per iniziare, posizionare i campioni su ghiaccio secco. Prendete una provetta per microcentrifuga pre-etichettata, posizionatela su una bilancia analitica e taratela. Quindi metti una pinzetta e un bisturi o una lama di rasoio in acciaio sul ghiaccio secco per 10-20 secondi per raffreddare.Usa le pinzette per estrarre il campione di tessuto congelato dalla provetta e posizionarlo su una barca di plastica, che può essere posizionata su un blocco piatto di ghiaccio secco o su un'altra superficie preraffreddata. Usando il bisturi o la lama di rasoio in acciaio, sezionare una piccola porzione di tessuto equivalente a 5-15 milligrammi di peso e posizionarla nella provetta della microcentrifuga. Registrare il peso esatto e ripetere per ogni campione.Aggiungere un microlitro per milligrammo di acido D31 esadecanoico da 10 millimolari, seguito da tre perle di acciaio inossidabile da cinque millimetri a ciascun campione. Quindi aggiungere 250 microlitri di metanolo, 250 microlitri di acqua e 500 microlitri di cloroformio a ciascun campione con le perle. Posizionare le provette in un blocco preraffreddato di un mulino di macinazione e mescolare i campioni a una frequenza vibrazionale di 25 hertz per cinque minuti.Rimuovere le perle utilizzando un magnete e centrifugare i campioni a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una micropipetta, prelevare un volume fisso della fase inferiore di ciascun campione in provette per microcentrifuga etichettate in modo corrispondente. Aggiungere 500 microlitri di cloroformio al campione rimanente e ripetere questi passaggi.Posizionare le provette con la fase inferiore combinata sotto azoto gassoso o in un vuoto centrifugo refrigerato resistente al cloroformio a quattro gradi Celsius fino a completa asciugatura. Pipettare 98 millilitri di metanolo anidro in un flacone di vetro. E aggiungi lentamente due millilitri di acido solforico anidro nella cappa aspirante per produrre il 2% di acido solforico in metanolo.Mescolare facendo roteare il flacone chiuso. Aggiungere 500 microlitri di questo acido solforico al 2% in soluzione di metanolo a ciascun campione e vorticare brevemente. Incubare i campioni sul blocco termico a 50 gradi Celsius per due ore e aggiungere 100 microlitri di soluzione satura di cloruro di sodio e 500 microlitri di esano a ciascun campione.Agitare vigorosamente i campioni a temperatura ambiente per un minuto e lasciarli riposare per un minuto. Le due fasi dovrebbero essere evidenti dopo questo. Raccogliere la fase superiore in una nuova provetta per microcentrifuga.Quindi ripetere l'aggiunta di esano. E dopo la separazione di fase, raccogliere i secondi campioni di fase superiore nelle stesse provette etichettate. Essiccare i campioni a temperatura ambiente sotto azoto gassoso e risospendere i campioni in 20 microlitri di esano per milligrammo di peso tissutale originale.Trasferire immediatamente i campioni in una fiala di vetro per gascromatografia con inserto in vetro. Iniettare i campioni in un singolo spettrometro di massa per gascromatografia quadrupla per determinare l'abbondanza di esteri metilici degli acidi grassi o isotopologhi FAME. Iniettare un microlitro di campione in un ingresso split o splitless a una temperatura di ingresso di 270 gradi Celsius utilizzando l'elio come gas di trasporto.In provette per microcentrifuga con chiusura sicura etichettate, combinare 10 microlitri di ciascun campione di plasma o quattro microlitri standard di idrossido di sodio 10 molari e quattro microlitri di acetone al 5% in acetonitrile. Eseguire questa operazione in triplice copia per ogni campione. Dopo aver incubato i campioni per una notte a temperatura ambiente, aggiungere da 450 a 550 milligrammi di solfato di sodio a ciascun campione, aggiungere 600 microlitri di cloroformio a ciascuna provetta nella cappa aspirante e vorticare vigorosamente per 15 secondi.Centrifugare i campioni a 300 G per due minuti. Prelevare fiale GCMS in vetro etichettate con inserti in vetro e trasferire le aliquote triplicate e poi da 80 microlitri del surnatante da ciascun campione alle fiale. Tappare bene i flaconcini per l'analisi GCMS.La percentuale di arricchimento di D2O nel plasma dei topi in più punti temporali è mostrata qui. È stato riscontrato che l'acqua corporea è arricchita nell'intervallo dal 2,5 al 6% e che un livello basale di arricchimento di deuterio nell'acqua corporea viene rapidamente raggiunto in un'ora e mantenuto per tutta la durata dello studio. La distribuzione isotopologica di massa del palmitato nel tessuto adiposo bruno dopo tre giorni di somministrazione di D2O a temperatura ambiente e termoneutralità è mostrata qui.Questo risultato mostra un maggiore arricchimento di deuterio M1 e M2 a temperatura ambiente. In questa figura sono presentati l'arricchimento molare del tessuto adiposo bruno e l'arricchimento molare plasmatico di una serie di acidi grassi dopo tre giorni di somministrazione di D2O a temperatura ambiente e termoneutralità. L'arricchimento della temperatura più fredda è stato trovato in un'ampia gamma di acidi grassi nel tessuto adiposo bruno.In particolare, l'arricchimento plasmatico di acidi grassi totali non segue lo stesso andamento del tessuto adiposo bruno, ma aumenta invece l'arricchimento di acidi grassi con la termoneutralità. Queste immagini rappresentano l'abbondanza totale e il palmitato sintetizzato de novo nel tessuto adiposo bruno dopo tre giorni di somministrazione di D2O. Il risultato mostra un aumento della sintesi totale di palmitato a temperatura ambiente.Prestare attenzione quando si eseguono acidi grassi sul GCMS. Assicurarsi che il palmitato non sia sovraccaricato in quanto può fornire valori di arricchimento isotopico artificialmente elevati. Inoltre, quando si analizza l'acetone sul GCMS, assicurarsi che non vi sia alcun picco di acetone di fondo prima di eseguire i campioni, quindi eseguire gli spazi vuoti per rimuovere l'acetone nel sistema.Questo metodo esamina gli acidi grassi totali in più classi lipidiche, ma se si desidera capire in che modo la sintesi degli acidi grassi influisce su specifiche classi lipidiche, è possibile prima separare queste classi lipidiche utilizzando la cromatografia e quindi estrarre gli acidi grassi da queste frazioni. Poiché la lipogenesi è un fattore chiave per il normale sviluppo, ma anche per molte malattie, questo protocollo può essere utile in molti campi.

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