Name: Sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di DNA lineare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Impara la sintesi proteica priva di cellule con modelli di DNA lineare utilizzando estratti di Escherichia coli carenti di esonucleasi. Questo metodo semplifica la preparazione del DNA e accelera la prototipazione in biotecnologia.

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Qui, mostriamo che il lisato cellulare preparato da E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genomico per l'operone recB o recBCD supporta un'elevata espressione proteica da modelli lineari di DNA. Questo protocollo elabora una procedura di calibrazione del lisato passo-passo specifica per i modelli di DNA lineare (Figura 2), che è un passo critico che porta all'alta espressione da promotori σ70 nel DNA lineare, raggiungendo livelli vicini al plasmide per concentrazio...

I sistemi di sintesi proteica priva di cellule (CFPS) sono sempre più utilizzati come metodo rapido, semplice ed efficiente per l'ingegneria dei biosensori, la produzione decentralizzata e la prototipazione di circuiti genetici1. Grazie al loro grande potenziale, i sistemi CFPS sono utilizzati regolarmente nel campo della biologia sintetica. Tuttavia, finora i sistemi CFPS si basano su plasmidi circolari che possono limitare la tecnologia dal raggiungere il suo pieno potenziale. La preparazione del DNA plasmidico dipende da molti passaggi che richiedono molto tempo durante la clonazione e grandi quantità di isolamento del DNA. D'altra parte, l'amplificazione PCR da un plasmide, o un modello di DNA sintetizzato, può essere utilizzata per preparare semplicemente modelli CFPS entro poche ore 2,3. Pertanto, l'applicazione del DNA lineare offre una soluzione promettente per la CFPS. Tuttavia, il DNA lineare viene rapidamente degradato dalle esonucleasi naturalmente presenti negli estratti cellulari4. Esistono soluzioni che affrontano questo problema, come l'uso della proteina GamS λ-fago5 o il DNA contenente siti Chi6 come agenti protettivi, o proteggere direttamente il DNA lineare modificando chimicamente le sue estremità 2,7,8,9. Tutti questi metodi richiedono integrazioni per l'estratto cellulare, che sono costosi e richiedono tempo. È noto da tempo che il complesso esonucleasi V (RecBCD) degrada il DNA lineare nei lisati cellulari4. Recentemente, abbiamo dimostrato che il DNA lineare può essere protetto molto meglio nei lisati da cellule eliminate per i geni esonucleasi (recBCD)10.
In questo protocollo, i passaggi per la preparazione di lisati privi di cellule dal ceppo E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD mediante lisi sonicazione sono descritti in dettaglio. La lisi sonicazione è una tecnica comune e conveniente impiegata da diversi laboratori11,12. Gli estratti prodotti da questo ceppo non hanno bisogno dell'aggiunta di alcun componente aggiuntivo o modifica del modello di DNA per supportare l'espressione da modelli lineari di DNA. Il metodo si basa sulla fase essenziale dell'ottimizzazione del tampone per gli estratti cellulari specificamente per l'espressione lineare del DNA da promotori nativi di E. coli. È stato dimostrato che questa specifica ottimizzazione del tampone per l'espressione lineare del DNA è la chiave per i promotori nativi σ70 per produrre un'elevata produzione di proteine senza l'integrazione di proteina GamS o DNA Chi, evitando anche la purificazione dei prodotti PCR10. La concentrazione ottimale di Mg-glu per l'espressione lineare del DNA è risultata simile a quella del DNA plasmide. Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glu ha mostrato una differenza sostanziale tra DNA lineare e plasmide, probabilmente a causa di un meccanismo correlato alla trascrizione10. La funzionalità delle proteine espresse con questo metodo è stata dimostrata per diverse applicazioni, come lo screening rapido degli interruttori e la valutazione dell'attività delle varianti enzimatiche10.
Questo protocollo fornisce una soluzione semplice, efficiente ed economica per l'utilizzo di modelli di DNA lineare in sistemi privi di cellule di E. coli semplicemente utilizzando estratti cellulari ΔrecBCD mutanti e calibrazione specifica per DNA lineare come modello.

<table><tbody><tr><td>2-YT Broth</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Provette Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>Micropiastra</td></tr> a <tr><td>fondo quadro a 384 pozzetti</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (D-(-)-3-Acido fosfoglicerico disodico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>guarnizione adesiva per piastra</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina 5'-trifosfato sale disodico idrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &Delta; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 e Delta; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (Adenosina 3' 5'-monofosfato ciclico)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (Coenzima A idrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 mL PP Provette da centrifuga, rack confezionato con tappo CentriStar, sterile</td><td>Corning</td><td>430790</td><td>Provetta da 15 mL</td></tr><tr><td>Corning 50 mL in PP Provette da centrifuga, fondo conico con tappo CentriStar, sterile</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>provetta da 50 mL</td></tr><tr><td>CTP (citidina 5'-trifosfato, sale disodico idrato)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiothreitolo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Acido folinico (acido folinico solido sale di calcio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosina 5?-Trifosfato,&nbsp; Sale disodico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K fosfato bibasico (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K fosfato monobasico (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-glutammato</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutammato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unità filtro siringa, 0,22 &; m, polietersulfone</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>filtro a membrana 0,22 & micro; m</td></tr><tr><td>Monarch PCR & Kit di pulizia del DNA</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR & Kit di pulizia del DNA</td></tr><tr><td>Kit di minipreparazione del plasmide Monarch</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Kit di minipreparazione del plasmide</td></tr><tr><td>NAD (B-nicotinamide adenina dinucleotide idrato)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>Standard FITC tracciabile NIST</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Plasmid Maxiprep Kit</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>lettore di piastre</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Proteina EGFP ricombinante purificata</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>eGFP ricombinante</td></tr><tr><td>Q5 Master Mix 2X ad alta fedeltà</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA polimerasi</td></tr><tr><td>Q5 Master Mix 2X ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA polimerasi</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit di test</td><td>Saggio</td> fluorimetrico Thermo <td>Q32850</td><td>con colorante legante il DNA</td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> sterile <td>Acqua purificata dal sistema Millipore RiOs 8, sterilizzata in autoclave.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Life Science prodotti Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Processore ad ultrasuoni Cella vibrante VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>Sonicatore</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Uridina 5'- trifosfato, sale trisodico idrato)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>Acqua, acqua senza nucleasi</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>senza nucleasi</td></tr></tbody></table>

sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di dna lineare

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

La sintesi proteica priva di cellule (CFPS) è recentemente diventata molto popolare nel campo della biologia sintetica grazie ai suoi numerosi vantaggi. L'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS consentirà inoltre alla tecnologia di raggiungere il suo pieno potenziale, riducendo il tempo sperimentale eliminando le fasi di clonazione, trasformazione ed estrazione del plasmide. Il DNA lineare può essere rapidamente e facilmente amplificato mediante PCR per ottenere alte concentrazioni del modello, evitando potenziali tossicità di espressione in vivo . Tuttavia, i modelli lineari di DNA sono rapidamente degradati dalle esonucleasi che sono naturalmente presenti negli estratti cellulari. Ci sono diverse strategie che sono state proposte per affrontare questo problema, come l'aggiunta di inibitori della nucleasi o la modifica chimica delle estremità lineari del DNA per la protezione. Tutte queste strategie costano tempo e risorse extra e devono ancora ottenere livelli di espressione proteica vicini al plasmide. Un protocollo dettagliato per una strategia alternativa è presentato qui per l'utilizzo di modelli di DNA lineare per CFPS. Utilizzando estratti cellulari da cellule knockout carenti di esonucleasi, i modelli lineari di DNA rimangono intatti senza richiedere alcuna modifica finale. Presentiamo le fasi di preparazione del lisato cellulare da Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD ceppo mediante lisi sonicazione e calibrazione tampone per Mg-glutammato (Mg-glu) e K-glutammato (K-glu) specificamente per DNA lineare. Questo metodo è in grado di raggiungere livelli di espressione proteica paragonabili a quelli del DNA plasmidico in E. coli CFPS.

Risultati rappresentativi sono mostrati qui dopo la calibrazione del lisato per i livelli ottimali di Mg-glutammato e K-glutammato separatamente per DNA lineare e plasmidico (Figura 1). La concentrazione ottimale di Mg-glutammato è simile tra gli estratti di Δ recB e ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA plasmidico è di 140 mM, mentre la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA lin...

Presentato qui un protocollo per la preparazione e la calibrazione tampone di estratti cellulari da ceppi knockout di esonucleasi V di Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Questo è un approccio rapido, facile e diretto per l'espressione in sistemi di sintesi proteica privi di cellule utilizzando modelli lineari di DNA.

Sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di DNA lineare

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

Il protocollo è molto significativo perché consente un uso rapido, facile e diretto di modelli di DNA lineare in sistemi di sintesi proteica privi di cellule, anche da parametri nativi di E.coli. I principali vantaggi sono la quantità di tempo risparmiata evitando la clonazione, le modifiche chimiche delle estremità lineari del DNA e gli integratori protettivi come il DNA gamma o chi. Poiché gli estratti di sintesi auto-segnalanti vengono sviluppati per diversi organismi di interesse, il nostro metodo presenta un modo per accelerare la prototipazione in tali estratti utilizzando il DNA lineare.Per iniziare, striscia il ceppo BL21 Rosetta-2 delta recBCD da meno 80 gradi Celsius di glicerolo su una piastra di agar YTP 2x che contiene 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Quindi, inoculare una singola colonia dalla piastra di agar in poco più di 40 millilitri di 2x YTP integrato con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione di 200 giri / min. Successivamente, crea una sottocoltura diluendo la coltura notturna 100 volte in quattro litri di 2x YTP freschi contenenti 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo.Dividere i quattro litri del supporto in quattro palloni separati. Incubare a 37 gradi Celsius, 200 RPM, per circa tre o quattro ore di crescita per raggiungere una densità ottica da 1,5 a 2,0. Mettere la coltura sul ghiaccio, far girare le cellule a 5.000 G per 12 minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il surnatante decantando.Quindi, risospendere i pellet di cella in 800 millilitri di S30A refrigerato con DTT. Ancora una volta, ruotare le cellule a 5.000 G per 12 minuti a quattro gradi Celsius come dimostrato in precedenza e scartare il surnatante mediante decantazione. Dopo aver risospeso i pellet cellulari in 160 millilitri di S30A refrigerato con DTT, trasferire le celle in tubi da 50 millilitri refrigerati e prepesati.Ruotare le cellule a 2000 G per otto minuti a quattro gradi Celsius e quindi scartare il surnatante decantando. Ancora una volta, ruotare le cellule a 2000 G per quattro minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere con attenzione il surnatante rimanente usando una pipetta. Quindi, rimisurare il peso del tubo per calcolare il peso del pellet cellulare e mantenere i pellet cellulari a meno 80 gradi Celsius.Dopo aver prelevato i pellet cellulari da meno 80 gradi Celsius, scongelarli sul ghiaccio per una o due ore e risospendere i pellet cellulari in 0,9 millilitri di S30A con tampone DTT per grammo del peso del pellet cellulare. Quindi, pipettare lentamente per risospendere le cellule, evitando il più possibile la schiuma superiore. Posizionare aliquote da un millilitro delle celle risospese in microtubi da 1,5 millilitri e tenerli su ghiaccio o un blocco freddo pre-raffreddato a quattro gradi Celsius.Quindi, sonicare ogni tubo in un sonicatore con una configurazione del 20% di ampiezza per tre cicli e ruotare il lisato a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver raccolto il surnatante con una pipetta, trasferire su un tubo da 50 millilitri. Incubare il lisato cellulare a 37 gradi Celsius a 200 RPM agitazione per 80 minuti.Dopo aver fatto girare il lisato e raccolto il surnatante in microtubi da 1,5 millilitri pre-raffreddati, aliquote 30 microlitri in provette PCR 8-strip pre-raffreddate, mantenendo tutti i tubi sul ghiaccio. Flash congelare le aliquote di lisato su ghiaccio secco e conservare a meno 80 gradi Celsius. Preparare un master mix in base alla scheda di preparazione del buffer come descritto nel manoscritto.Per un volume di reazione di 10,5 microlitri, aggiungere 1,05 microlitri di diverse concentrazioni di Mg-glutammato e 9,45 microlitri del master mescolare e mescolare delicatamente. Pipettare 10 microlitri delle reazioni di cui sopra in una micropiastra inferiore quadrata a 384 pozzetti e coprirla con un sigillo adesivo. Misurare l'espressione genica come output di fluorescenza registrando i dati di fluorescenza con un lettore di piastre a intervalli regolari per otto ore di incubazione a 30 gradi Celsius con scuotimento orbitale continuo a 307 cicli al minuto.Dopo aver identificato la concentrazione di Mg-glutammato che si traduce nel più alto valore di fluorescenza nel punto finale, procedere alla calibrazione del K-glutammato. Esegui l'esperimento e identifica il più alto valore di fluorescenza tra le concentrazioni di K-glutammato testate, identificando così la composizione tampone ottimale per Mg-glutammato e K-glutammato per questo lisato. Una volta stabiliti i valori di Mg-glutammato e K-glutammato, preparare provette stock della composizione tampone ottimizzata in base al volume del lotto ottenuto.Dopo aver calcolato il numero di tubi tampone necessari, aliquote 38 microlitri per tubo e conservare a meno 80 gradi Celsius. Innanzitutto, etichettare un microtubo da 1,5 millilitri per la preparazione ottimale del master mix. Aggiungere i volumi corretti del tampone e del lisato e mescolarli delicatamente.Quindi, pipettare prima i campioni di DNA, seguiti da acqua priva di nucleasi e, infine, il master mix ottimale. Mescolare delicatamente la reazione priva di cellule con una pipetta appena prima di aggiungere al lettore di piastre ed evitare eventuali bolle. Dopo aver impostato le reazioni nel lettore di piastre, le corse cinetiche hanno registrato i dati di fluorescenza a intervalli regolari per otto ore di incubazione a 30 gradi Celsius con scuotimento orbitale continuo a 307 cicli al minuto.Dopo la calibrazione del lisato, la concentrazione ottimale di Mg-glutammato era simile a otto millimolari tra gli estratti sia per il DNA lineare che per quello plasmide. Tuttavia, la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA plasmidico è di 140 millimolari, mentre la concentrazione ottimale di K-glutammato per il DNA lineare è di 20 millimolari. Dopo le fasi di calibrazione, i livelli di espressione GFP sono stati confrontati tra DNA lineare e plasmidico negli estratti wild-type, delta recB e delta recBCD.L'espressione di GFP dal DNA lineare ha raggiunto rispettivamente il 102% e il 138% dell'espressione dal DNA plasmidico negli estratti dei ceppi delta recB e delta recBCD. Le cose più importanti nel protocollo sono la lisi sonicativa della cellula e le fasi di calibrazione del tampone separatamente per il DNA lineare e plasmide, in particolare quando si utilizzano i parametri nativi. Questa tecnica contribuirebbe ad accelerare la sperimentazione di progetti biologici in sistemi privi di cellule, ad esempio lo screening di biosensori, enzimi e percorsi o la prototipazione di circuiti genetici sintetici.

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Sistemi di espressione senza cellula sono strumenti potenti e convenienti per la sintesi di alto-rendimento e screening di proteine importanti. Qui, descriviamo la preparazione del sistema di espressione della proteina senza cellula utilizzando Vibrio natriegens per la produzione di proteina rapida utilizzando il DNA del plasmide, DNA lineare e modello del mRNA.

Senza cellula proteina espressione utilizzando la rapida crescita batterio Vibrio natriegens

Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l'RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell'RNA lineare.

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

Lo studio descrive un protocollo per la creazione di grandi quantità (μg-mg) di DNA per campagne di screening proteico da frammenti di geni sintetici senza clonazione o utilizzando cellule viventi. Il modello minimo viene digerito enzimaticamente e circolarizzato e quindi amplificato utilizzando l'amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento. Le reazioni di espressione senza cellule potrebbero essere eseguite con il prodotto non purificato.

Metodi rapidi ed enzimatici per l'amplificazione di modelli minimi e lineari per la prototipazione di proteine utilizzando sistemi privi di cellule

Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per produrre lisato batterico per l'espressione genica senza cellule, utilizzando un ceppo ingegnerizzato di Escherichia coli e richiedendo solo attrezzature di laboratorio standard.

Produzione rapida, economica e semplice di lisato privo di cellule batteriche

Parti genetiche ben caratterizzate sono necessarie per la progettazione di nuovi circuiti genetici. Qui descriviamo un metodo economico e ad alto rendimento per caratterizzare rapidamente le parti genetiche. Il nostro metodo riduce costi e tempi combinando lisati privi di cellule, DNA lineare per evitare la clonazione e manipolazione acustica dei liquidi per aumentare la produttività e ridurre i volumi di reazione.

Caratterizzazione rapida di parti genetiche con sistemi cell-free

Questo lavoro descrive la preparazione dell'estratto cellulare di Escherichia coli (E. coli) seguito da reazioni di sintesi proteica senza cellule (CFPS) in meno di 24 ore. La spiegazione del protocollo CFAI (Cell-Free Autoinduction) descrive i miglioramenti apportati per ridurre la supervisione dei ricercatori e aumentare le quantità di estratto cellulare ottenuto.

Dalle cellule alla sintesi proteica senza cellule entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione senza cellule

Questo protocollo descrive il sistema di sintesi proteica senza cellule (CFPS) utilizzato nella costruzione di cellule sintetiche. Delinea le fasi chiave con risultati rappresentativi in diversi micro-compartimenti. Il protocollo mira a stabilire le migliori pratiche per i diversi laboratori della comunità delle cellule sintetiche, facendo avanzare i progressi nello sviluppo delle cellule sintetiche.

Sistema di sintesi proteica cell-free per la costruzione di cellule sintetiche

Impara la sintesi proteica priva di cellule con modelli di DNA lineare utilizzando estratti di Escherichia coli carenti di esonucleasi. Questo metodo semplifica la preparazione del DNA e accelera la prototipazione in biotecnologia.

Sintesi proteica priva di cellule da estratti cellulari carenti di esonucleasi utilizzando modelli di DNA lineare

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