Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

Questo protocollo consente ai ricercatori di determinare le affinità di legame degli aptameri contro bersagli liberi in soluzione, fornendo al contempo informazioni sul meccanismo di legame. Poiché l'ITC misura i cambiamenti di calore dovuti al legame, né l'aptamero né il ligando devono essere etichettati o funzionalizzati, come nel caso di tecniche come SPR. I nuovi utenti devono prestare molta attenzione ai buffer corrispondenti tra tutti i componenti di associazione.

Inoltre, tieni presente che la tecnica ha elevati requisiti di campionamento che possono essere difficili da soddisfare per ligandi più grandi come le proteine. Per iniziare, attivare la membrana della colonna di dialisi, riempire con tampone PBS, equilibrare per 10 minuti a temperatura ambiente e centrifugare a 5.000 volte G per 15 minuti. Rimuovere il tampone e caricare 500 microlitri di campioni di aptamero nella colonna.

Centrifugare a 5.000 volte G e ripeterlo quattro volte per sostituire il buffer originale con PBS. Raccogliere l'aptamero del DNA dializzato utilizzando una pipetta e trasferirlo nel nuovo tubo da 1,5 millilitri. Raccogliere l'ultimo tampone di flusso per sciogliere la tetraciclina.

Assicurarsi che il tampone per l'esperimento nella siringa corrisponda al tampone nella cella di riferimento. Determinare nuovamente la concentrazione dell'aptamero utilizzando uno spettrometro UV-visibile. Utilizzare l'ultimo tampone di scambio per regolare la concentrazione a 40 micromolari di tetraciclina e aptamero a due micromolari.

Piegare l'aptamero del DNA riscaldando a 90 gradi Celsius per 10 minuti, raffreddando a quattro gradi Celsius per 10 minuti e quindi tornando a temperatura ambiente per 20 minuti. Degasare l'aptamero piegato e la tetraciclina dializzata utilizzando una stazione di degasaggio o una pompa per vuoto per 25 minuti per eliminare i gas disciolti. Dopo aver pulito e confermato la pulizia della macchina, testare l'accuratezza della macchina con un kit standard che include EDTA e cloruro di calcio utilizzando il programma predefinito e seguendo le istruzioni del produttore.

Impostare i parametri di esecuzione. Controllare i volumi richiesti utilizzando un calcolatore di programmi in esecuzione. Con questo parametro di funzionamento, eseguire la misurazione ITC con 230 microlitri di tetraciclina 40-micromolare nella siringa ITC e 485 microlitri di aptamero a due micromolari nella cella campione ITC utilizzando ITC.

Caricare le piastre della siringa tetraciclina dializzate e l'aptamero piegato nella cella del campione, evitando bolle, usando una pipetta. Avviare l'esecuzione dello strumento ITC facendo clic sul pulsante Start sul software. Aprire il software di analisi dei dati facendo doppio clic per avviare l'analisi dei dati.

Aprire il percorso dei dati grezzi salvati per conoscere la tendenza all'associazione. Aprire la scheda Modellazione e utilizzare diversi modelli di associazione per trovare la soluzione migliore per la curva di dati. Quindi, il software calcola automaticamente il termogramma ITC e vari parametri termodinamici, tra cui entalpia, entropia, energia libera, costante di legame all'equilibrio e stechiometria.

Raccogliere i parametri termodinamici determinati dai dati e dalle informazioni del modello di adattamento. Creare un report che includa immagini del termogramma ITC e vari parametri termodinamici. L'aptamero selezionato da Kim, et al si lega alla tetraciclina con affinità di legame della costante di dissociazione uno uguale a 13 micromolari e la costante di dissociazione due uguale a 53 nanomolari.

Il modello di adattamento e la stechiometria di ITC riflettono che l'aptamero si lega alla tetraciclina attraverso un rapporto di legame 2: 1 con il modello di legame sequenziale. I parametri termodinamici determinati dalla misurazione ITC per il sito due hanno indicato che il superamento di una perdita entropica relativamente significativa guida il forte legame. Il legame guidato dall'entalpia con perdita di entropia si riferisce ai cambiamenti conformazionali degli acidi nucleici, che sono stati riportati come comportamenti di legame tra l'RNA e una piccola molecola.

L'aptamero e il ligando devono trovarsi nello stesso buffer. L'aptamero deve essere ripiegato se sviluppato con ripiegatura e i campioni devono essere degassati. Affrontare queste considerazioni assicurerà che solo le interazioni aptamero-ligando contribuiscano al segnale misurato.

A causa delle dimensioni del target aptamero, un metodo di follow-up appropriato potrebbe essere la termoforesi su microscala per confermare l'affinità di legame misurata libera in soluzione.