Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans

Questo protocollo consente nuove informazioni sul microbiota naturale di C.elegans. Allo stesso tempo, i microbi isolati possono essere utilizzati in esperimenti di laboratorio controllati per caratterizzare le interazioni microbiota-ospite e la biologia di C.elegans. Questo protocollo si concentra sull'isolamento dei microbi associati a C.elegans in natura, che sono quindi fondamentali per comprendere la biologia di questo importante ospite modello in un contesto più naturale.

Sarà utile avere familiarità con l'aspetto di Caenorhabditis rispetto ad altri nematodi. Il pipettaggio sotto l'ambito di dissezione può inizialmente essere impegnativo, ma la pratica sarà utile. Inizia raccogliendo i campioni ambientali come compost o frutta marcia in sacchetti di plastica separati, tubi o contenitori puliti.

Distribuire uniformemente i pezzi dei campioni ambientali raccolti in una capsula di Petri vuota sterile di nove centimetri e aggiungere circa 20 millilitri di mezzo viscoso sterile per coprire il campione con il mezzo. Al microscopio da dissezione, cercare i nematodi Caenorhabditis seguendo le linee guida sull'isolamento di Caenorhabditis elegans e dei nematodi correlati. Utilizzando una pipetta da 20 a 100 microlitri, raccogliere la minima quantità possibile di liquido contenente i nematodi Caenorhabditis dalla piastra e trasferirla nella capsula di Petri di tre centimetri contenente da uno a tre millilitri di M9T sterile.

Per stabilire una popolazione di vermi, i singoli vermi possono essere trasferiti su una piastra con un mezzo di crescita dei nematodi o NGM. Per lavare i nematodi e rimuovere i microbi presenti al di fuori dei nematodi, incubarli in M9T per 10-15 minuti. Pipettare la quantità più piccola possibile di liquido contenente i nematodi e trasferirla in una nuova capsula di Petri sterile di tre centimetri contenente da uno a tre millilitri di M9T fresco.

Per un'identificazione imparziale dei microbi associati ai nematodi, preparare una piastra a 96 pozzetti con circa tre sfere sterili di un millimetro di diametro e aggiungere una miscela di 19,5 microlitri di tampone PCR e 0,5 microlitri di proteinasi K per pozzetto. Trasferire un singolo nematode lavato in ciascun pozzetto con il minor liquido possibile. Rompere i nematodi trasferiti usando un omogeneizzatore di perline per tre minuti a 30 hertz e centrifugare le piastre o i tubi a 8.000 G per 10 secondi a temperatura ambiente per ottenere il liquido sul fondo.

Per identificare C.elegans, riscaldare i campioni in un ciclatore PCR per un'ora a 50 gradi Celsius e 15 minuti a 95 gradi Celsius per isolare il DNA dei singoli nematodi, o utilizzare kit commerciali per isolare il DNA delle popolazioni di vermi. Congelare il DNA isolato a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. Utilizzare il DNA e la coppia di primer NLP 30 in avanti e NLP 30 inverso e produrre un prodotto PCR a 154 coppie di basi.

Per isolare i batteri, preparare una piastra a 96 pozzetti con circa tre perle sterili da un millimetro, 20 microlitri di tampone M9 per pozzetto e pipettare un singolo nematode lavato in ciascun pozzetto con il minor liquido possibile. Rompere i nematodi come dimostrato prima di utilizzare un omogeneizzatore di perline, seguito da una breve centrifugazione della piastra per portare il liquido sul fondo. Una volta fatto, raccogliere la sospensione e diluirla in serie da una a 10 proporzioni.

Placcare fino a 100 microlitri della sospensione diluita su piastre di agar da nove centimetri. Quindi incubare le piastre a 15-20 gradi Celsius per 24-48 ore. Per ottenere la coltura batterica pura, prelevare una singola colonia dalla piastra incubata utilizzando un cappio sterile o uno stuzzicadenti e strisciarla su una nuova piastra di agar contenente lo stesso mezzo di agar utilizzato durante la purificazione.

Assicurarsi di utilizzare solo 1/3 della piastra. Quindi sterilizzare un anello riutilizzabile o utilizzare un nuovo anello sterile e trascinarlo attraverso la prima striscia per creare una seconda striscia su un'altra parte 1/3 della piastra campione. Ripetilo trascinando un ciclo attraverso la seconda serie e creando la terza striscia per ottenere la crescita della singola colonia.

Incubare la piastra nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per l'isolamento e, se necessario, ripetere la fase di purificazione. Coltiva le colonie pure in un mezzo liquido usando la stessa temperatura e le stesse condizioni di crescita. Successivamente, caratterizzare i batteri estraendo il DNA batterico da colture liquide pure amplificando l'RNA ribosomiale 16S utilizzando 27 primer in avanti e 1495 inversi ed eseguendo la PCR come descritto nel testo.

Quando i campioni di frutta e compost raccolti sono stati distribuiti in piastre di Petri e immersi in un mezzo liquido o viscoso, i vermi hanno lasciato il materiale del substrato e nuotato sulla superficie del mezzo. I microbi sono stati isolati come colonie singole pure e la purificazione ha svolto un ruolo essenziale in quanto alcuni batteri associati a C.elegans possono formare biofilm o aggregarsi facilmente, dando luogo a colture multispecie. La PCR utilizzando i primer specifici di C.elegans, vale a dire NLP 30 in avanti e NLP 30 inversa, ha portato all'amplificazione di un prodotto a 154 coppie di basi per C.elegans.

Il DNA isolato da singoli vermi ha prodotto bande PCR deboli, mentre l'estrazione del DNA dalle popolazioni di vermi costituite da almeno 50 vermi ha prodotto una quantità maggiore e bande più chiare. Il successo della PCR specifica di C.elegans è stato confermato eseguendo il DNA di un ceppo di laboratorio, vale a dire N2, come controllo positivo contemporaneamente al DNA dei nematodi isolati I microbi sono ovunque. Quindi, è essenziale lavorare in condizioni sterili per garantire che quei microbi isolati siano veramente associati al verme in natura.

I microbi isolati possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-microbiota o il ruolo dei microbi sulla biologia dell'ospite, ad esempio l'invecchiamento, lo sviluppo o l'immunità in esperimenti di laboratorio controllati. I microbi isolati con questa tecnica sono attualmente utilizzati dalla comunità C.elegans per migliorare la comprensione della diversità del microbiota sulla forma fisica dell'ospite o il ruolo dei microbi sull'immunità.