Purificazione dei polisomi dai noduli simbiotici di soia
July 1st, 2022
Questo protocollo descrive un metodo per la purificazione dei polisomi eucariotici da noduli di soia intatti. Dopo il sequenziamento, le pipeline standard per l'analisi dell'espressione genica possono essere utilizzate per identificare geni differenzialmente espressi a livello di trascrittoma e translatoma.
Questo protocollo è significativo perché è, per quanto ne sappiamo, il primo a descrivere un nuovo metallo a base di centrifuga per la purificazione cinetica dei polisomi dai noduli simbiotici della soia. Il grande vantaggio di questa tecnica è che in combinazione con RNA-Seq, permette lo studio della relazione e organizzato in un tessuto complesso come il nodulo simbiotico. Per iniziare, pesare circa 0,2 grammi di noduli intatti in un piatto di pesata e trasferirli in un tubo da due millilitri pre-raffreddato.
Quindi aggiungere 1,2 millilitri di tampone di estrazione dei polisomi, lasciare scongelare il campione per due minuti e omogeneizzare con una smerigliatrice tissutale fino alla completa rottura e omogeneizzazione dei noduli. Quindi, incubare i campioni su ghiaccio con delicata agitazione per 10 minuti o fino a quando tutti i campioni sono stati elaborati e centrifugare a 16.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per pellettare i detriti. Quindi, recuperare il surnatante e ripetere il passaggio della centrifuga.
Dopo aver accuratamente recuperato l'estratto citosolico chiarificato, trasferire un'aliquota da 200 microlitri in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri per un isolamento totale. Quindi, versare 4,5 millilitri dello strato di saccarosio al 33,5% nelle provette della centrifuga e aggiungere 4,5 millilitri dello strato del 12% con attenzione e lentamente con una micropipetta P-1000. Quindi, mettere i tubi sul ghiaccio fino all'aggiunta dell'estratto citosolico chiarificato.
Caricare un millilitro dell'estratto citosolico chiarificato sulla parte superiore del cuscino di saccarosio mediante pipettaggio accurato sulla parete laterale del tubo. Quindi, trasferire i tubi ultra centrifuga in secchi pre-raffreddati e centrifugare a 217, 874 G per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato l'estratto citosolico rimanente e il cuscino di saccarosio, risospendere il pellet polisomiale con 200 microlitri di tampone di risospensione preraffreddato.
Quindi, incubare per 30 minuti su ghiaccio, quindi trasferire la risospensione polisomiale in tubi pre-raffreddati da 1,5 millilitri per procedere con l'estrazione dell'RNA. Dopo aver omogeneizzato i campioni con 750 microlitri del reagente di isolamento dell'RNA incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 200 microlitri di cloroformio freddo e agitare vigorosamente i tubi per 15 secondi.
Quindi, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius per la separazione di fase e trasferire 500 microlitri della fase acquosa superiore in un tubo pulito senza disturbare la fase organica rosa. Quindi, aggiungere 375 microlitri di isopropanolo freddo e 0,5 microlitri di glicogeno libero RNA.
Successivamente, mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare la miscela per 10 minuti a quattro gradi Celsius e centrifugare a 12.000 volte G per 15 minuti. Quindi, scartare il surnatante e lavare il precipitato di RNA con un millilitro di etanolo freddo al 75%.
Mescolare per breve vortice. Quindi, centrifugare a 7.500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet di RNA.
Quindi, sciogliere il pellet in 50 microlitri di acqua libera da RNA e incubare a 65 gradi Celsius per cinque minuti. Valutare la concentrazione e l'integrità dell'RNA con elettroforesi capillare altamente sensibile e/o elettroforesi su un gel di agarosio libero al 2%. Dopo aver stimato il volume del campione, aggiungere 0,1 volumi di tre molari di acetato di sodio, tre volumi di etanolo freddo e 0,5 microlitri di RNA, glicogeno libero.
Quindi, mescolarli accuratamente. L'elettroforesi capillare è stata eseguita per diverse frazioni di campione di RNA associate totali e polisomiali, che hanno dimostrato bande di RNA ribosomiale affilate, senza alcun aspetto spalmato. Tuttavia, ciò non si riflette nei valori RIN, poiché variano tra 5,9 e 7,5, che corrisponde a campioni non intatti.
Il bioanalizzatore non è riuscito a identificare i picchi 18S e 25S come si vede negli elettroferogrammi, sia per campioni di RNA totali che associati ai polisomi. Non c'era alcun segno visivo di degradazione del campione. Tuttavia, un campione è stato analizzato per visualizzare il risultato di un campione quasi interamente degradato, per il confronto.
La cosa più importante è lavorare in condizioni di conservazione dei polisomi e dell'RNA durante l'intero protocollo. Dopo aver sequenziato le frazioni totali e par RNA, i modelli standard per l'espressione genica analizzata possono essere utilizzati per identificare geni differenziali espressi a livello di trascrizione e traduzione.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per la purificazione dei poliribosomi eucariotici da noduli di soia intatti. Questa tecnica permette lo studio dell'espressione genica a livello di trascrittoma e translatoma.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Vegetale
- Analisi dell'Espressione Genica
Sfondo
- La purificazione dei poliribosomi è essenziale per studiare la regolazione della traduzione.
- Comprendere l'espressione genica nei noduli simbiotici può fornire informazioni sulle interazioni pianta-microbo.
- Questo metodo è il primo a utilizzare un approccio basato su centrifugazione per la purificazione cinetica dei poliribosomi dai noduli di soia.
- L'RNA-Seq può essere combinato con questa tecnica per un'analisi completa.
Obiettivo dello Studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la purificazione dei poliribosomi dai noduli di soia.
- Facilitare lo studio dell'espressione genica in tessuti complessi.
- Migliorare la comprensione della relazione tra trascrittoma e translatoma.
Metodi Utilizzati
- Pesare i noduli di soia intatti e trasferirli in un tubo.
- Omogenizzare i noduli con un trita-tessuti in tampone di estrazione dei poliribosomi.
- Incubare i campioni su ghiaccio e centrifugare per separare i detriti.
- Recuperare il surnatante e ripetere la centrifugazione per la purificazione.
Principali Risultati
- Il metodo purifica con successo i poliribosomi dai noduli di soia.
- Consente l'analisi RNA-Seq successiva per identificare i geni differenzialmente espressi.
- Dimostra il potenziale per studiare le interazioni dei tessuti complessi.
- Stabilisce un nuovo protocollo per future ricerche in biologia vegetale.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un nuovo approccio per la purificazione dei poliribosomi.
- Apre nuove strade per comprendere l'espressione genica nelle relazioni simbiotiche.
- Gli studi futuri possono sfruttare questo metodo per approfondire la biologia vegetale.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Polysome purification from soybean symbiotic nodules enables direct interrogation of translational regulation in complex plant tissues, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By isolating both total and polysome-associated mRNA for RNA-seq, this method provides quantitative insight into gene expression at both transcriptome and translatome levels. These capabilities enhance predictive confidence for target validation and pathway analysis in plant biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of translational control in disease-relevant plant systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing transcriptional from translational regulation.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of mRNA pools.
Screening & Assay Development
- Prepares high-quality, reproducible RNA samples for downstream RNA-seq workflows.
- Standardizes sample integrity assessment using capillary electrophoresis for sequencing readiness.
- Enables robust differential gene expression analysis at both transcriptional and translational levels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression outputs with translational biomarker discovery in plant-microbe interaction models.
- Provides continuity from molecular discovery to functional validation in complex tissues.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate targets based on translational evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven analysis of translational regulation in symbiotic nodules.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-quality mRNA fractions for differential expression and pathway analysis.
- Translational Research: Connects molecular findings to functional outcomes in complex plant tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to other plant systems requiring translational profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving translational regulation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable RNA purification for high-throughput sequencing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by integrating transcriptome and translatome data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on translational evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and RNA integrity assessment.
- Demands access to ultracentrifugation and capillary electrophoresis instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible RNA quality.
- May require adaptation for other plant species or tissue types.
- Sample integrity must be preserved throughout to ensure reliable downstream analysis.
